重症低ホスファターゼ症に対する骨髄移植併用同種間葉系幹細胞移植 

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平成 23‑25 年度厚生労働科学研究費補助金（再生医療実用化研究事業） 

分担研究報告書 

重症低ホスファターゼ症に対する骨髄移植併用同種間葉系幹細胞移植 

‐骨形成能の研究‐ 

研究分担者  大串 始  (産業技術総合研究所健康工学研究部門  招聘研究員)

研究要旨

この研究期間内に同種間葉系幹細胞の移植をおこなった2症例の長期でのレントゲン 像ならびに

CT

像の解析をおこなった。症例

1

では移植前にみられた骨端線のキャッ ピング変化が移植後長期にわたり消失することを確認し、同部位での石灰化が継続 して存在することを確認した。また、移植前にみられた頭蓋骨の形成不全も改善し、

この良好な石灰化も移植後持続していた。しかし、長菅骨脆弱性は残存していた。

症例

2

では移植前にみられた非石灰化骨端線の拡張は改善し、さらに長菅骨の変形も 生じなかった。しかし、症例

1

と同様、骨の脆弱性は残存していた。また、これらの 症例には複数回の移植をおこなったが、この複数回に用いた間葉系幹細胞の

in vitro

での骨形成能を

ALP

活性やカルセインの取り込みにより生化学的に検証した。これ らの検証により、複数回用いた間葉系幹細胞は全て骨分化能を有することが確認で きた。以上より、本疾患患者に対する同種幹細胞移植の有用性が確認されるも、骨 の脆弱性の問題を解決すべく、さらなる研究が必要である。

A.  研究目的 

低ホスファターゼ症患者は骨を作 るのに必要な

ALP

が生まれつき正常 に働かないことにより、骨を作るこ とが障害される遺伝性疾患である。

本計画では骨形成障害を改善するた めに、同種の間葉系幹細胞を患者に 移植して骨形成能を付与することに ある。しかし、その検証には間葉系 幹細胞移植前にみられる骨成長不全 の改善と、移植に用いる間葉系幹細

胞が骨分化能を有することが必須で ある。以上の点をふまえて、分担研 究者大串は、継時的な移植後におけ る患者の画像解析（レントゲン撮影 と

CT

撮影）をおこなうとともに、こ れまでに複数回用いたドナー間葉系 幹細胞の骨分化能を検証した。すな わち、本研究の有用性を骨形成解析 という側面から検討することを目的 とした。

80

B.  研究方法 

  骨成長の画像解析においては島根 大学で通常のレントゲン撮影と

CT

撮影をおこなった。ドナー同種間葉 系幹細胞の骨分化は、島根大学から 搬送された骨髄から培養増殖された 間葉系幹細胞(

mesenchymal stem cell: MSC

)を用いて以下の方法によ りおこなった。 

≪骨分化能解析≫

・MSCを基礎培地に浮遊し2x10⁴ cell s/1.5mL  /wellで12well plateに播種 する。

（この時の濃度は5000cells/cm2とな る）

・播種翌日（又は細胞接着後）、6 we llを基礎培地に添加因子3種をそれぞ れ100分の1ずつ加えた誘導培地（Dex (+)）に交換する。（コントロールとし て残りの6 wellは-GPのみ加えた培 地（Dex(-)）に交換する。）

・Dex(+), Dex(-)各6 wellのうち、5 wellにCalceinを100分の1加える。

・添加因子を加えた培地で週2-3回培地 交換をおこない、2週間培養する。

・イメージアナライザー（タイフーン）

で蛍光強度を測定し、石灰化基質の定 量を行う。

・DNA bufferを0.5mLずつ各wellへ添 加し、細胞を回収する。

・回収した細胞を超音波破砕する。

・DNA量を定量する。

・ALP活性を測定する。

・DNA 1gあたりのALP活性を計算す

る。

基礎培地：15%FBS/MEM（抗生物質 +）

添加因子

・-GP：-Glycerophosphate disodi um salt (CALBIOCHEM: 35675) 作成法  -GPを精製水に1Mとなるよ うに溶解→ろ過滅菌

・Vit.C：L-ｱｽｺﾙﾋﾞﾝ酸ﾘﾝ酸ｴｽﾃﾙﾏｸﾞﾈｼｳ ﾑ塩n水和物 (Wako: 013-12061) 作成法  Vit.C をPBSに2.05mg/mL となるように溶解→ろ過滅菌

・Dex：Dexamethasone (SIGMA: D- 8893)

作成法  1mg入りの瓶に1mLのエタノ

ールを添加→24mLのPBSを添加

→PBSでさらに10倍希釈→ろ過滅菌

・Calcein (3,3 -Bis[N,N-bis(carboxy ethyl)-aminomethyl  fluorecein)：(D ojin:344-00431)

作成法  CalceinをPBSに0.1mg/mL となるように溶解→ろ過滅菌

・DNA Buffer：100mM NaCl, 10m M Tris-HCl, 1mM EDTA[pH 7.4]溶 液

(

倫理面への配慮

)

  患者のレントゲン撮影や

CT

撮影に関 しては、本計画提案時の研究計画ならび に患者（家族）への説明文章にかかれて いる。さらに、骨形成能の解析について も、本計画提案時の研究計画ならびに患 者（家族）への説明文章にかかれている。

以上より倫理面での問題は無い。

Ｃ．研究結果 症例

図

1

に示す。

骨の両端には骨形成不全の る。これはビタミン 生じる

関節での脛骨の下端 凹状のレントゲン透過像 として見られる。

図

このキャッピングは 植後に消失し、

改善された。この らわれることは無く、

才

6

ヶ月 でも、

た。しかし、

脆弱性がみられ、さらに右大腿骨の中央 にこれまでに

れた。

Ｃ．研究結果 

症例

1

の移植前のレントゲンの像を に示す。これに

骨の両端には骨形成不全の これはビタミン 生じる、くる病の 関節での脛骨の下端

のレントゲン透過像 として見られる。

図

1.

  症例

1

このキャッピングは 植後に消失し、骨端部

された。この らわれることは無く、

ヶ月の時点での

、この消失は

しかし、大腿骨や下腿骨全体に骨の 脆弱性がみられ、さらに右大腿骨の中央 にこれまでに生じなかった骨折

れた。

の移植前のレントゲンの像を これに見られるように長菅 骨の両端には骨形成不全の

これはビタミン

D

の不足によって の変化と類似であり、

関節での脛骨の下端と大腿骨の

のレントゲン透過像（キャッピング として見られる。

1

の移植前のレントゲン

このキャッピングは間葉系幹細胞移 骨端部での骨形成不全は された。このキャッピング

らわれることは無く、症例

時点でのレントゲン像（図 この消失は長期にわたり

大腿骨や下腿骨全体に骨の 脆弱性がみられ、さらに右大腿骨の中央

生じなかった骨折

の移植前のレントゲンの像を 見られるように長菅 骨の両端には骨形成不全の像がみられ

の不足によって 類似であり、膝 大腿骨の上端に

（キャッピング

のレントゲン

間葉系幹細胞移 での骨形成不全は キャッピングが再度あ

症例

1

の患者の レントゲン像（図

2

にわたり確認でき 大腿骨や下腿骨全体に骨の 脆弱性がみられ、さらに右大腿骨の中央 生じなかった骨折がみら

81

の移植前のレントゲンの像を

見られるように長菅 がみられ の不足によって

膝 に

（キャッピング）

のレントゲン

間葉系幹細胞移 での骨形成不全は

再度あ の患者の

4 2

） でき 大腿骨や下腿骨全体に骨の 脆弱性がみられ、さらに右大腿骨の中央 がみら

ゲン像

す。

ン 像 蓋骨 骨 の 図

頭蓋骨はほぼ いる。

これらの 認で

CT

かし、

ントゲン（図

骨折が確認できる。また、

が湾曲しているのも見られる。

図

2.

症例 ゲン像

症例

1

の移植前

す。この像に見られるように、

ンでみられた 像でもみられる。

蓋骨の顕著な骨形成不全がみられ、頭蓋 骨に著名な骨透過像が見られる。

の骨形成不全は移植 図

4

に見られるように、

頭蓋骨はほぼ

いる。また、骨端部の骨形成も改善し これらの骨形成

認でき、患者の

CT

像（図

5

） かし、骨強度 ントゲン（図

骨折が確認できる。また、

が湾曲しているのも見られる。

症例

1

の

4

才

6

移植前の

CT

像に見られるように、

でみられた骨端部の骨形成不全 でもみられる。また、

の顕著な骨形成不全がみられ、頭蓋 著名な骨透過像が見られる。

骨形成不全は移植により に見られるように、

頭蓋骨はほぼ正常の骨にまで回復して 骨端部の骨形成も改善し 骨形成の改善は

患者の

4

才

6

ヶ月

）において

骨強度の改善は不完全であり、レ ントゲン（図

2

）にみられる

骨折が確認できる。また、

が湾曲しているのも見られる。

6

ヶ月でのレント

CT

像を図

3

に示 像に見られるように、レントゲ

骨形成不全が また、この

CT

では の顕著な骨形成不全がみられ、頭蓋 著名な骨透過像が見られる。これら により改善される。

に見られるように、移植後１年で、

にまで回復して 骨端部の骨形成も改善し

の改善は引きつづき ヶ月の時点での

も見られる。し の改善は不完全であり、レ

みられる右大腿骨 骨折が確認できる。また、全体に大腿骨 が湾曲しているのも見られる。

レント

に示 レントゲ

が

CT

では頭 の顕著な骨形成不全がみられ、頭蓋 これら される。

１年で、

にまで回復して 骨端部の骨形成も改善した。

引きつづき確 時点での 見られる。し の改善は不完全であり、レ

右大腿骨の に大腿骨

図

3.

図

.

症例

1

の移植

図

4

症例

1

の移植後 移植前の

CT

の移植後

1

年

CT

像

年の

CT

82

図

成の促進

部分における骨形成促進 も、

確認

分であった。

られ、

る

症例 ン かな

非石灰化骨端線が幅広く

（ に していた の所見を得た

と同様に骨皮質の石灰化は不十分で脆 弱性が示唆された。

図

5.

症例

1

以上より、

成の促進、特に

部分における骨形成促進 も、長菅骨の皮質骨部 確認は困難であり、

分であった。

られ、結果として る。

症例

2

においては、

ン像にみられるような

かなキャッピングはみられなかったが、

非石灰化骨端線が幅広く

（図

6

）。この非石灰化骨端線は移植後 に改善し、長期

していた（図 の所見を得た

と同様に骨皮質の石灰化は不十分で脆 弱性が示唆された。

1

の

4

才

6

ヶ月

、症例

1

では

、特に頭蓋骨や 部分における骨形成促進

長菅骨の皮質骨部の十分な石灰化 困難であり、菲薄

分であった。特に大腿骨では脆弱性がみ 結果として骨折を生じた

においては、症例 にみられるような移植前

キャッピングはみられなかったが、

非石灰化骨端線が幅広く

。この非石灰化骨端線は移植後 長期（

2

才の時点）で

図

7

）。

CT

の所見を得た（図

8

）。

と同様に骨皮質の石灰化は不十分で脆 弱性が示唆された。

ヶ月での

CT

では移植による骨形 や関節近傍の骨端 部分における骨形成促進が示唆され

の十分な石灰化 菲薄化の改善は不十 大腿骨では脆弱性がみ を生じたと思われ

症例

1

のレントゲ 移植前のあきら キャッピングはみられなかったが、

非石灰化骨端線が幅広く存在してい

。この非石灰化骨端線は移植後 才の時点）でも改善

CT

の画像でも同様

。しかし、症例 と同様に骨皮質の石灰化は不十分で脆

CT

像

移植による骨形 関節近傍の骨端

が示唆される の十分な石灰化の

は不十 大腿骨では脆弱性がみ 思われ

レントゲ あきら キャッピングはみられなかったが、

ていた

。この非石灰化骨端線は移植後 も改善 の画像でも同様

、症例

1

と同様に骨皮質の石灰化は不十分で脆

図

6

 

図

7.

これまでに、

葉系幹細胞の移植を ントゲン像

胞が患者の骨に を生じている

の幹細胞移植が有効であると   症例

2

の

.

症例

2

の

2

これまでに、両症例に対して複数回の間 葉系幹細胞の移植を

ントゲン像や

CT

が患者の骨に

生じていることを示唆 の幹細胞移植が有効であると

の

1

歳のレントゲン

2

才でのレントゲン

両症例に対して複数回の間 葉系幹細胞の移植をおこなってきた

CT

では、移植 が患者の骨に生着して新たな

ことを示唆され、

の幹細胞移植が有効であると のレントゲン像

レントゲン像

両症例に対して複数回の間 おこなってきた。レ 移植間葉系幹細 新たな骨形成 され、この同種 の幹細胞移植が有効であると思われた

83

両症例に対して複数回の間

レ 間葉系幹細 骨形成

同種 た。

れた

必要である。特に、

回移植しているが、

おける

今回これまでに移植された幹細胞の 植毎

セイン   るも、

による みられ

得られた間葉系幹細胞 認された。

図

8.

症例

しかし、骨 れた幹細胞の 必要である。特に、

回移植しているが、

おける骨分化

今回これまでに移植された幹細胞の 植毎の骨形成の

セインの取り込みによりおこなった。

  図

9,10

のように、

るも、測定した による

ALP

活性

みられた。これにより、ドナー骨髄 得られた間葉系幹細胞

認された。

症例

2

の

2

才で

骨の脆弱性は残存し、移植さ 幹細胞の骨分化能に

必要である。特に、同じ 回移植しているが、これらの

骨分化能の比較が

今回これまでに移植された幹細胞の の骨形成の比較を

ALP

の取り込みによりおこなった。

ように、

variation

した全てで

dexamethasone

活性と骨基質

た。これにより、ドナー骨髄 得られた間葉系幹細胞の

での

CT

像

は残存し、移植さ に関する検証が 同じドナーから複数 これらの移植ごとに が重要と思われ、

今回これまでに移植された幹細胞の

ALP

活性とカル の取り込みによりおこなった。

variation

がみられ

dexamethasone

骨基質産生の誘導が た。これにより、ドナー骨髄

の骨分化能が確 は残存し、移植さ

検証が ドナーから複数

移植ごとに 重要と思われ、

今回これまでに移植された幹細胞の移 とカル の取り込みによりおこなった。

みられ

dexamethasone

産生の誘導が た。これにより、ドナー骨髄から

骨分化能が確

図

9.

図

10

D.  考察

  この研究において、

胞の移植により、長期にわたり

.

症例

1

の骨形成

10.

症例

2

の骨形成比較

考察 

の研究において、

胞の移植により、長期にわたり 骨形成比較

の骨形成比較

の研究において、ドナー間葉系幹細 胞の移植により、長期にわたり

の骨形成比較

ドナー間葉系幹細 胞の移植により、長期にわたり骨端にお

84

ドナー間葉系幹細

骨端にお

ける できた。

あった。

質骨の 症例

これまで見られなかった大腿骨 が

十分

結果にみられるように、

細胞の移植は をもたらし、

今後 と

Ｅ．結論

CT

細胞

の骨構築が改善されたこと た。

骨形成 できた。

性 骨

まえると、

の さらなる 胞

重要である。また、

ては、

の変更も視野にいれるべきかと る

F.

なし

ける骨格の改善がみられることが できた。特に

あった。この点

質骨の菲薄化、すなわち 症例と残存していた。

これまで見られなかった大腿骨 がみられ、皮質骨の機械特性が非常に 十分であることが

結果にみられるように、

細胞の移植は をもたらし、

今後長期にわたり、

となる。   

Ｅ．結論 

この研究期間における

CT

像の継時的

細胞の移植後

の骨構築が改善されたこと

た。また、移植された間葉系幹細胞が 骨形成分化能を有し

できた。しかし、四肢 性は残存し、特に症例 骨骨幹部の骨折が まえると、同種

の本疾患治療の有用性が さらなる症例において 胞の移植研究

重要である。また、

ては、移植細胞数を増やすなどの の変更も視野にいれるべきかと る。

F.  健康危険情報 なし

骨格の改善がみられることが 特に、頭蓋骨の骨形成は良好 この点に比し、

化、すなわち していた。特に これまで見られなかった大腿骨

皮質骨の機械特性が非常に であることが示唆された

結果にみられるように、

細胞の移植は患者の長期にわたる をもたらし、有用であると思われる

長期にわたり、さらなる検証を必要  

研究期間における 継時的な画像比較で、

移植後長期にわたって骨端部分 の骨構築が改善されたこと

移植された間葉系幹細胞が 能を有していたことも確認 しかし、四肢の皮質

は残存し、特に症例

1

においては大腿 骨折がみられた。

同種間葉系幹細胞 本疾患治療の有用性が

症例において同種間葉系幹細 研究を引きつづき行うことが 重要である。また、今後

細胞数を増やすなどの の変更も視野にいれるべきかと

健康危険情報

骨格の改善がみられることが

、頭蓋骨の骨形成は良好

、四肢における 化、すなわち骨の脆弱性が

特に、症例１では これまで見られなかった大腿骨の

皮質骨の機械特性が非常に 示唆された。これらの 結果にみられるように、同種の間葉系幹

の長期にわたる であると思われる

さらなる検証を必要

研究期間におけるレントゲンと 比較で、間葉系幹 長期にわたって骨端部分 の骨構築が改善されたことが確認でき 移植された間葉系幹細胞が いたことも確認 の皮質骨の脆弱 においては大腿 みられた。以上 間葉系幹細胞を用いて 本疾患治療の有用性が示されるも

同種間葉系幹細 を引きつづき行うことが 今後の研究におい 細胞数を増やすなどの の変更も視野にいれるべきかと思われ

骨格の改善がみられることが確認

、頭蓋骨の骨形成は良好で における皮 骨の脆弱性が両

、症例１では の骨折 皮質骨の機械特性が非常に不 これらの の間葉系幹 の長期にわたる生存 であると思われるも、

さらなる検証を必要

レントゲンと 間葉系幹 長期にわたって骨端部分 確認でき 移植された間葉系幹細胞が いたことも確認 骨の脆弱 においては大腿 以上を踏 用いて るも、

同種間葉系幹細 を引きつづき行うことが の研究におい 細胞数を増やすなどの計画 思われ

85

G.  研究発表 

  （巻末に別記載）

H.  知的財産権の出願・登録状況 

1．特許所得：なし  2．実用新案登録：なし  3．その他：なし