血 中superoxide dismutase活 性 の 加 齢 に よ る 変 動 お よ び 環 境 汚 染 物 質 に よ る 阻 害
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(2) 446. 植. そ れ ぞ れ0, 約10分. 10,. 20,. … …50,. 80,. 100μlと. 田. 子. を用 いて 算 出 した 報 告 もあ る9)何れ の場 合 で も1単. 入れて. 間 恒 温 槽 の 中 で 保 っ た 後, xanthine. 和. 位 の 点 をVμlと. oxidase. す る と,粗 酵 素 抽 出 液 は最 終 的 に. を 加 え て 十 分 に 試 験 管 内 を 混 和 し て 反 応 を 開 始 し,. は10gHb/dlが20倍. 10分 後 のNBT還. ビ ン濃 度 は1/2×10.2mgHb/μlで. 液 にSigma社 Units/mg 3.000倍. 元 を 測 定 し た.な の 純SOD. (3100. Solidを1.5mgと. お本 実 験 の 反 応. Units/mgProt,. り1mlの. 単 位Vμlに. 2900. A法 で は50%の. O‑2の ヘ モ グ ロ ビ ン に 対 す る 作 用 の 検 討 に は 日 本 人. DEAEセ. bufferで. 粗 酵 素 抽 出 液 を用 い た測 定 で は, O‑2によ らないNBT. 論 的 にはB法. 80分 間 照 射 し た 後 のMetHbを kman. DK2)で. し て40分. で 得 られた活 性 値 が真 の 活 性 値 に近 い. と考 え られ るが,著 者 は粗 酵 素 抽 出液 を用 いて 両者. を 含 ん だ 反 応 液 を ス ラ イ ドプ ロ ジエ ク タ ー(オ ラ ン プ で4cm離. 点 が得 られ れ ば よい の で,測 定試. 還 元 が 存 在 し,試 料 ご とに最 大 阻 害 率 が異 な る.理. ル ロ ース カ ラム を通 して ヘ モ グ ロ ビン を抽. ー トキ ャ ビ ン)300Wの. Units/mgHb. 料 数 が 少 な くて 活 性値 が求 め られ る利 点 が あ るが,. 出 した8).抽 出 し た ヘ モ グ ロ ビ ン30μMにriboflavin 53μMを. ヘ モグ ロビ ンが含. で 表 わ され る.. 害の点 に. お け る 濃 度 を 求 め た.. の 無 カ タ ラ ーゼ 血 症 を1mMのphosphate. あ る.従 って1. は1/2V×10‑2mgの. ま れ,単 位 ヘ モ グ ロ ビン あた り200/V. 純 に溶 か して. に 希 釈)を 添 加 し本 実 験 の1/2阻. に 希 釈 され て い るか らヘモ グロ. と. に よ る活 性 値 の比 較検 討 を お こな っ た. B法 によ る 活 性 値 をx,. 自記 分 光 光 度 計(Bec. 測 定 し た.. A法 に よ る活 性値 をyと. 帰 方 程 式 はy=0.62x+1.8で. した場 合 の 回. 相 関 係数 は0.92と. 高. く,良 い相 関 を示 す. B法 で求 め られ た活 性 値 はA 結 1.. 果. 法 で 求 め られ た よ り高 く,真 の活 性 値 に近 い値 を示 す と考 え られ る. A法 につ いて はB法. 単 位 の 計算 法. 添 加 し たSODの. 量 を 横 軸 に, NBT還. を 縦 軸 に と る と 図1の. NBT還. 元 の 発 色 の 幅 を100%と. か ら決 め る 方 法(A法)と,各 求 め そ の1/2阻 考 え ら れ る. はB法. 用 す る こ と がで きる と考 え られ る.. よ う な 検 量 線 が 得 られ る.単. 位 の 計 算 と して, xanthine‑xanthine. oxidaseに し て50%阻. 本 実 験 の 反 応 系 にSigma社. よる 害 の点. Fridovich法. 試 ご との最 大 阻害 率 を. 害 の 点 か ら決 め る方 法(B法)と McCord,. Fridovich,. mg. 1. Inhibition ract. of. of human. of crude. reduction red. 添 加 して1単. 1.5mgを1mlの. は0.05. of cells.. by. (McCord,. Prod,. 2900. 水 に 溶 か し3.000倍. Unitお. に希 釈 し. ま り 本 実 験 の1単. よ び0.0175μg. SODに. (ƒÊl). a. chloroform. Units/. 位 に相 当 す る濃 度 をみ る. し た.つ. Sigma. extract. NBT. の 純SOD. Units/mg. た 純SODを35μl要. 方A法. Volume. Fig.. で3100. Solid)を. と,. が. Winterbourn. に よ る 計 算 法 で 単 位 を 決 め て い る.一. のparameter. と して相 互 の 比 較 に用 い る近 似 的 な 簡便 法 と して 利. 元の阻害率. ethanol. ext. 位 相当.
(3) 血 中Superoxide. dismutase活. 性 の 加 齢 に よ る変 動 お よ び 環 境 汚 染 物 質 に よ る 阻 害. に示 す.す な わ ち回 収 率 は93.1%,抽. した. 2.. 血 中SODの. 血 中SOD活. 前処理法. 出誤 差 に よ る. 活性 値 の変 動 係 数 は1.8%と 低 く,粗酵 素 抽 出液 に よ. 性 の測 定 は溶 血 液 を材 料 と して 用 い. る方 法 と,あ らか じめ抽 出 した粗 酵 素 を用 い る方 法. る測 定 が可 能 で あ る と考 え られ る. 3.. Superoxide. が あ る.両 者 を比 較 して み る と前 者 は抽 出 誤 差 が な い こ と と,測 定 に 用 い る血 液 の量 が 少 な くて す む と い う利 点 が あ る. 一 方 クロ ロ ホル ム ・エ タ ノ ール 抽 出 液 は. free. radicalの. ヒ トの 無 カ タラ ー ゼ 血 症 の 血 液 よ りDEAEカ を 通 し て カ タ ラ ー ゼ お よ びSODを. ,抽 出率. ロ ビ ン 溶 液 を 材 料 と し,こ 照 射 し て 発 生 させ たO‑2を. な る.そ こで純SODを. い て 吸 収 ス ペ ク トル は. 溶 血 液 に加 えて そ の 回収 率 して それ ぞ れ 同 様 に抽. ヒ ト赤 血 球 ヘ モ. グ ロ ビ ン に対 す る作 用. の他 に,抽 出誤 差 に よ って 生 じる実 験 誤 差 が 問題 と. を検 討 した.同 一 血 液 を5分. 447. 578mmの. ラム. 含 ま な いヘ モ グ. れ に リボ フ ラ ビン に光 を 作 用 さ せ,そ. 〔図2〕. の結果につ. に 示 す ご と く, 540,. ヘ モ グ ロ ビ ン ピ ー ク の 下 降 と共 に630mm. 出 した もの の 活性 値 を求 めて,回 収 率 の 差異 に よ っ. の メ トヘ モ グ ロ ピ ン ピ ー ク の 上 昇 が 認 め ら れ る と い. て生 じる実験 の バ ラツ キ を検 討 した 結 果 を 〔 表1〕. う,ブ. (表1). Fig.. 2. Change. タ の ヘ モ グ ロ ビ ン に お け るLynch等. 同一 血 液 にお け る抽 出率 とSOD活. in spectrum. of. 性値. oxyhemoglobin. の 報 告9).
(4) 448. 植. 田. 和. と同 様 の成 績 が 得 られ た.こ の事 実 はSuperoxide free radicalが. 子. な 結 論 が 得 られ た.. ヒ トの ヘモ グロ ビ ン に作 用 して そ の. 酸 化 に用 い られ,そ の た め にSOD活 要 なSuperoxide. 1. 単 位 の 計算 法 xanthine‑xanthine. 性の測 定に必. free radicalの 濃 度 が 減 少 す る. 幅 を100%と. oxidaseに. して,そ の50%阻. よ るNBT還. 元の. 害 の 点 か ら決 め る方. 結 果,溶 血 液 に よ る測 定 値 は正 しい 値 が 得 られ な く. 法 は簡 便 で は あ る が近 似 的 な比 較 に しか 使 用 で きな. な る こ とが推 測 され る.ま たNBT還. い.各 試 料 ご とに最 大 阻 害 率 を求 め,そ の1/2阻. じるblue. formazanをOD550で. 元 に よ って 生. 測 定 す る こ とか ら,. で あ る と考 え られ る.. 活 性 が 低 くて 多量 に溶 血 液 を必 要 とす る試 料 にお い て は,ヘ モ グ ロ ビンの 吸 光 帯 の一 部 と重 な るの で,. 2.. 抽 出誤 差 に よ る活 性 値 の バ ラッ キ は,回 収 率. 最 大 阻 害 率 に 大 きな バ ラ ツ キ を生 じる こ とか ら も,. 93.1±1.6(m±SD)%.活. 溶 血 液 を試 料 と して 活 性 値 を測 定 す る こ とは適 当 で. Hb変. な い と考 え られ る.. 測 定 が 可 能 で あ る.. oxidaseの. 元 の 阻 害 率 よ り血 中SOD活. 性 値15.2±0.3Units/mg. 動 係 数 は1.8%と. 3. 総 括 な らび に考 案 xanthine‑xanthine. 低 い の で粗 酵 素抽 出液 に よる. 溶 血 液 を試 料 と した場 合. 測 定 に用 い る血 液 の量 が少 な くて 済 む とい う利 点 系 に よ るNBT還. は あ る が,ヘ モ グ ロ ビ ンに よ るSOD反 NBT還. 性 を測 定 す る場 合,次. 元 に よ っ て生 じ るblue. とヘ モ グ ロ ビンの 吸 光帯 が近 いためblue. い もの と考 え る.. の真 の吸 光 度 が得 られ ず, SODに. 血 液 は生 食 で洗 浄 し, 10gHb/dlに. 調 整 した. 応 の 阻 害,. formazanの. に述 べ る方 法 を 用 い た方 が適 当 で,真 の活 性 値 に近. 1.. 害. の点 か ら単 位 を決 め る方 法 は真 の 活 性 値 に 近 く正 確. 吸 光帯. formazan. よ るNBT還. 元の. 最 大 阻害 率 が求 め られ な い と考 え られ,溶 血 液 を試. 溶 血 液 か らク ロ ロホ ル ム ・エ タノ ー ル で抽 出 した粗. 料 と して用 い る こ と は適 当 で な い と考 え られ る.. 酵 素 抽 出 液 を試 料 とす る. 2.. 単 位 の 計 算 は,そ れ ぞ れ の試 料 の最 大 阻害 率. を求 め,そ の1/2阻. 稿 を終 えるにあた って,御 懇 篤 な御指導 と御校 閲を賜 わ った,恩 師 緒 方正 名教授 に深 く感謝の意 を表 します.ま. 害 の点 を1単 位 と して決 め る.. た本研 究 に有益 な御助言 と御協力 を腸 わ った水垣 順 子 助 結 ヒ トの 血 中SOD活. 論. 手,お よ び人 見 硬 技官,蓬 郷智子氏 は じめ教室 の皆様 に. 性 を測 定 す るに あ た って そ の. 感謝 の意 を表 し,あ わせて夫 植 田ロ禾佐の理解 と協力 に感 謝 致 します.. 測 定 方 法 につ い て 検討 した と ころ以 下 に述 べ るよ う. 参 1) McCord,. J. M. and Fridovich,. I.:. 考. 文. Superoxide. 献 dismutase.. J.. Biol.. Chem., 244,. 6049-6055,. 1969. 2). Fridovich,. 3). Beauchamp, Anal.. L:. Biochem.,. 4) Winterbourn, dismutase 5). dismutase. I.:. 44, 276-287, J. Lab.. Anual.. Biochem.,. 44, 147-159,. and assay. applicable. 学 の あ ゆ み,. 101,. H. P.. ephrine. 496‑497,. R. E. Clin.. and a simple assay S.:. on radical. and sensitive. gels.. and Brian,. Med.. M.: The estimation. 85, 337-341,. of red cell. superoxide. 1975.. Superoxide. dismutase活. 性 測 定 法 の 改 良,医. 1977.. and Fridovich,. Harklund,. 1975.. to acrylamide. 1971.. C. C., Hawkins,. activity.. Rev.. Improved assays. 今 城 登 志 男 ・広 田 元 子 ・宮 崎 元 一 ・早 川 和 一 ・田 村 義 蔵:. 6) Misra, 7). Superoxide. C. and Fridovich,. L:. The role of superoxide. for superoxide. Spectrophotometric direct. dismutase.. study of spontaneous assay. for. superoxide. anion in the autoxidation. J. Biol.. disproportivnativn dismutase.. of epin. chem., 247, 3170-3175, J.. Biol.. of superoxide. 1972. ani. Chem., 251, 7504-.
(5) 血 中Superoxide. 7507, 8). 性 の加 齢 に よ る変 動 お よ び環 境 汚 染物 質 に よ る阻害. 449. 1976.. 緒 方 正 名 ・高 原 滋 夫:低 ‑298. dismutase活. お よ び 無 カ タ ラ ー ゼ 血 液 症 に お け るcatalaseの. 異 型 性,医. 学 と生 物 学,. 73,. 292. , 1966.. 9) Lynch, R. E., Lee, G. R. and Cartwright, hemoglobin formation from oxyhemoglobin.. G. E.: Inhibition by superoxide dismutase J. Biol. Chem., 251, 1015-1019, 1976.. of met.
(6) 450. 植. The classified Part. levels. of human. by. age and. 1 Estimation. 田. erythrocyte in vitro of red. 和. superoxide. inhibition cell. Kazuko. by. dismutase some. superoxide. activity. polluting. dismutase. agents.. activity. UEDA. Dept. of Public Health, Okayama (Director:. 子. Univ. Med. School. Prof. Masana Ogata). The assay of red cell superoxide dismutase (SOD) activity employing the method of nitro blue tetrazolium (NBT) reduction in aerobic xanthine oxidase system was studied. The results were as follows. 1, Determination of unit of SOD activity Assuming the range of NBT reduction is 100 percent, one unit is defined by the amount of SOD required to inhibit NBT reduction by 50 percent. However, the activity defined by this calculating method is lower than the real value. Because the maximal inhibition of NBT reduc tion in aerobic xanthine oxidase system by crude extract was in the range of 75 to 90 percent in this experiment, and differed from each sample. The activities calculated from the point of 50 percent inhibition and half maximal inhibition showed good correlation (correlation coefficient; 0.92). And to get 50 percent inhibition less samples are needed than to get the maximal inhibition. So, this calculating method could be used in the case of comparison of SOD activities. 2, Recovery of purified SOD 93 percent recovery of purified SOD added to the hemolysate before extraction was ob tained. The activities were determined 5 times about the same sample to get the variation co efficient. The value was as low as 2 percent. 3, Interferrence by hemoglobin Methemoglobin formation from acatalasemic hemoglobin by SOD reaction was observed. And maximal inhibition of NBT reduction by hemolysate was low and varies widely. Using hemolysate for sample interferes the assay and the value of SOD activity is unreliable..
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