Printed May 1, 2012 Version 2.3
組換えセンダイウイルスミニベクター調製キット
(組換え SeV ミニベクター調製キット)
Recombinant Sendai MiniVector Expression System
CODE No. DV-0001
本 キ ッ ト は 、 「 遺 伝 子 組 換 え 生 物 等 の 使 用 等 の 規 制 に よ る 生 物 の 多 様
性の確保に関する法則（カルタヘナ法）」の対象品です。
使用の際には、カルタヘナ法に則して適切にお取り扱いください。
MEDICAL & BIOLOGICAL LABORATORIES CO., LTD. 5-3 sakae 4 chome, Naka-ku Nagoya 460-0008 Japan
TEL; (052) 238-1904, FAX; (052) 238-1441, URL https://ruo.mbl.co.jp
.
For Research Use Only. Not for use in diagnostic
procedures.
目次
I． はじめに
・ センダイウイルスについて ・ センダイウイルスベクターについてII． 組換え SeV ミニベクターについて
・ 従来法（組換えアデノウイルス）との作業フローの比較、データ例III． キット構成
・ 構成 ・ 輸送温度、保存温度 ・ 有効期限 ・ 劇毒物の有無IV． キット以外に必要な器具・試薬
・ 器具･装置 ・ 細胞 ・ 試薬類および培地V． SeV Miniplasmid の構造
VI． プロトコール
・ [目的遺伝子を導入した SeV Miniplasmid の調製] ・ 組換え SeV の調製 Day ‒1 [BHK-21 細胞の用意] Day 0 [BHK-21 細胞への感染と遺伝子導入] Day 1 [培地交換] Day 2 [培地交換] Day 3∼5 [培養上清回収、培地交換、保存] ・ [目的細胞への組換え SeV ミニベクターの感染] ・ [組換え SeV ミニベクターウイルス液濃縮プロトコール]ＶＩＩ． 参考文献
・ 日本語総説 ・ 英文論文VIII． SeV ミニベクター遺伝子地図
・ SeV ミニベクターマップ情報 ・ SeV Miniplasmid の遺伝子搭載近傍の塩基配列ＩX． 組換え SeV ミニベクターを作製するにあたっての注意点
・ カルタヘナ法について ・ 本キットの使用についてX． Q&A
XI． 製造元、販売元
I． はじめに
・ センダイウイルスについて
センダイウイルス（Sendai virus, SeV）は、マウスやラットを自然宿主とする呼吸器病ウイルス であり、パラミクソウイルス科のマウスパラインフルエンザウイルス 1 型に分類されます。SeV は 1950 年代前半に日本で初めて分離され、SeV という通称以外に HVJ（Hemagglutinating Virus of Japan） とも呼ばれています。１本のマイナス鎖 RNA（全長 15,384 塩基）をゲノムにもつ直径 150-250 nm の楕円形のエンベロープウイルスです。SeV ゲノム RNA には 3 末端から順に、ヌ クレオカプシド蛋白質（nucleocapsid protein, NP）、RNA ポリメラーゼの小サブユニットであるリン 酸化蛋白質（phosphoprotein, P）、ウイルス粒子構造を内側から維持するマトリクス蛋白質 （matrix protein, M）、宿主細胞への侵入にかかわる膜融合蛋白質（fusion protein, F）、宿主細 胞との結合にかかわる赤血球凝集素/ノイラミニダーゼ（hemagglutinin-neuraminidase, HN）、 RNA ポリメラーゼの大サブユニットである巨大蛋白質（large protein, L）の 6 個の遺伝子がコード されています。宿主核内で DNA として存在する既存のプラスミド、アデノウイルス、レトロウイル ス、アデノ随伴ウイルス等のベクターでは宿主染色体へのゲノムの組込みによる挿入変異や染 色体の構造変化を惹起するおそれがありますが、SeV は細胞に感染してから新たなウイルスが 出芽、生成するまでの全生活環を通してそのゲノムが細胞質で RNA の状態で存在するため、そ のような遺伝毒性が存在しない事が大きな特徴です。
・ センダイウイルスベクターについて
本キットの製造元であるディナベック株式会社は SeV を利用したベクターの実用化に世界で 初めて成功しました（1996 年特許出願）。 SeV ベクターには以下の特徴があります。 １） 分裂、非分裂細胞を問わずヒト由来を含むさまざまな哺乳動物細胞、鳥類細胞、発育鶏 卵での発現が可能です。 ２） 宿主細胞への短時間の接触による遺伝子導入が可能です。 ３） 低い感染価（少ないベクター量）で、高発現を可能にします。 ４） 導入 6∼10 時間後から発現を確認することができます（最大の発現は 24 時間以降とな ります）。 ５） 遺伝子の複製・転写は自らの RNA ポリメラーゼを使って宿主の細胞質内で行われるた め、宿主の細胞周期に影響を受けず発現が安定しています。 ６） 宿主染色体と相互作用しません（遺伝毒性がありません）。 ７） ヒトの病原性ウイルスではありません。このような特徴から SeV ベクターは、 細胞質型 RNA ベクター という新しい概念の遺伝子デリ バリーツールとして遺伝子治療、遺伝子ワクチン、抗体医薬の創出、遺伝子機能解析、組換え 蛋白質の生産などに広く利用されています。
II． 組換え SeV ミニベクターについて
ディナベック株式会社によって開発された組換えセンダイウイルスミニベクター（本文書では、 「組換え SeV ミニベクター」と記載します。）は、SeV のゲノム RNA を３つの構成成分に再構成し、 培養細胞等での蛋白質発現・機能解析用に利用しやすく改良を加えた SeV ベクターの改変モデ ルです。①目的遺伝子を組込むための SeV Miniplasmid は、ウイルス由来遺伝子を全て欠失し、 転写複製ユニットのみから構成されています。②Helper SeV/∆F は、宿主細胞への侵入にかか わる感染性粒子の必須成分である膜融合蛋白質（F）を欠失させた非伝播型ウイルスで、SeV ミ ニベクター用に改変されています。③F Protein Expression Plasmid は、膜融合蛋白質（F）を供給 するプラスミドです。これら 3 つの構成成分を同時にハムスター腎由来細胞株の BHK-21 細胞に 導入します。この BHK-21 細胞の培養上清には、ミニ SeV （目的遺伝子を搭載したミニゲノムを 有する感染性粒子） と Helper SeV （F 蛋白質が供給され感染性を有する） が混在しています。 この混合液を組換え SeV ミニベクターと呼びますが、それぞれの粒子は SeV ベクターと同等の
いては、Helper SeV から NP/P/L 蛋白質が十分量供給されるため、組換え SeV ミニベクター上 の目的遺伝子を SeV ベクターと類似レベルに高発現させることができます。 組換え SeV ミニベクターは、細胞表面糖鎖のシアル酸を認識するため、標的細胞を選ばず、 多くの種類の標的細胞への遺伝子導入が可能です。ウイルス液調製までの時間を大幅短縮で きるため、約 1 週間で目的遺伝子の発現を確認することも可能です。なお SeV ベクターと同等の 遺伝子導入・発現効率が確認されており、アデノウイルスと比較した場合、数倍から数十倍の遺 伝子発現が可能です。 本キットとは別に、受託サービスとして「組換え SeV ベクター作製」、「組換え SeV ミニベクター 作製」、および「組換え SeV ベクターを利用したモノクローナル抗体作製」をご提案しております。 受託サービスで利用する「組換え SeV ベクター作製」では約 5.1 kb の遺伝子搭載実績がありま すが、本キットで利用する「組換え SeV ミニベクター」への搭載に適している遺伝子長は約 1.5 kb 程度までです。組換え SeV ベクターの受託サービスについては、下記へお問合せ下さい。 ・ 受託サービス： 「組換え SeV ベクター作製」 「組換え SeV ミニベクター作製」 「組換え SeV ベクターを利用したモノクローナル抗体作製」 複数膜貫通型蛋白質に対するモノクローナル抗体作製に最適です。 問合せ先 MBL 総合受託サービス ホームページ ： https://ruo.mbl.co.jp/jutaku/index.html E-mail ： [email protected] TEL ： 052-238-1904 FAX ： 052-238-1441
・ 従来法（組換えアデノウイルス）との作業フローの比較、データ例
短期間でのウイルスベクターの調製が可能です。
多種類の標的細胞に遺伝子導入できます。
III． キット構成
・
構成
1 キットの DV-0001 で、100-mm dish で 3 枚分の実験が可能です。 1. SeV Miniplasmid 100 µL 1 本 （100 µg / 100 µL） 2. F Protein Expression Plasmid 100 µL 1 本 （100 µg / 100 µL） 3. Helper SeV/∆F 100 µL 3 本 （6 x 107 CIU / 100 µL）・ 輸送温度、保存温度
弊社からお客様へのキットの輸送・納品は-80℃（ドライアイス輸送）となります。 受取後、Helper SeV/∆F は-80℃で保存してください。
SeV Miniplasmid と F Protein Expression Plasmid は 4℃以下で保存してください。
・ 有効期限
製造日から 2 年です。製造日は本キットの外箱に記載しております。・ 劇毒物の有無
本キットには劇毒物は含まれておりません。IV． キット以外に必要な器具・試薬
・ 器具･装置
・ CO2 インキュベーター 37℃ （Day -1 ∼ Day 1 まで 3 日間使用） ・ CO2 インキュベーター 32℃ （Day 1 ∼ Day 5 まで 5 日間使用） ・ 37℃恒温槽 （ウォーターバス） ・ 4℃遠心機 ・ Vortex・ 培養皿： Collagen I-coated 100-mm dish
（cat. no. 354450 or 356450, Becton Dickinson）
・ ポリスチレン製チューブ： 滅菌チューブ （印刷目盛） （cat. no. 11-025-008, IWAKI） ・ その他、培地交換など培養細胞をハンドリングする際に必要な器具一式、リクローニン
グなど遺伝子組み換え実験に必要な器具一式。
・ 細胞
BHK-21 細 胞 株 は 、 ATCC （ American Type Culture Collection, ATCC number ： CCL-10TM） あ る い は 理 化 学 研 究 所 バ イ オ リ ソ ー ス セ ン タ ー （ 理 研 BRC, 細 胞 番 号 ：
RCB1423）から入手可能です。BHK-21 細胞の継代維持には D-PBS, Trypsin-EDTA, 10% FBS / G-MEM / P&S （1x） を使用します。
・ 試薬類および培地
(1) 遺伝子導入用試薬： LipofectamineTM 2000 (cat. no. 11668-019, Invitrogen)
(2) Trypsin （0.25%, 1x） （cat. no. 15050-065, Invitrogen） (3) Trypsin-EDTA （1x） （cat. no. 25300-054, Invitrogen） (4) Fetal Bovine Serum （FBS）
(5) Penicillin-Streptomycin, liquid （P&S, 100x） （cat. no. 15070-063, Invitrogen） (6) L-Glutamine, 200 mM （100x） （cat. no. 25030-081, Invitrogen）
(7) Bovine Albumin Fraction V Solution （BSA, 7.5%） （cat. no. 15260-037, Invitrogen） (8) D-PBS （cat. no. 14190-144, Invitrogen）
(9) Opti-MEM （cat. no. 31985-070, Invitrogen） ・ Opti-MEM （原液）
・ 20% FBS / Opti-MEM （P&S 無し）
(10) Glasgow-MEM （G-MEM） （cat. no. 11710-035, Invitrogen） ・ 【細胞継代用】 10% FBS / 1x P&S / G-MEM ・ 【Transfection 用】 10% FBS / G-MEM （P&S 無し） (11) VP-SFM （cat. no. 11681-020, Invitrogen）
・ 【ウイルス生産用】 0% FBS / VP-SFM / P&S （1x） / L-Glutamine （2x） 以下 「VP-SFM (-FBS)」と記載します。
V． SeV Miniplasmid の構造
・ SeV Miniplasmid のクローニングサイトには、制限酵素 NotI および SacII の認識部位があり、 どちらかあるいは両方の部位を使って、目的遺伝子を組み込む事ができます。
VI． プロトコール
[目的遺伝子を導入した SeV Miniplasmid の調製]
常法に従って、SeV Miniplasmid のクローニングサイトに目的遺伝子（約 1.5 kbp まで）（目的遺伝 子の ORF や制限酵素サイトなどを含めた挿入断片の塩基数が 6 の倍数にする必要があります。 厳密には、元より増えた塩基数が 6 の倍数になるようにします。）を組み込み、プラスミド DNA を 調製して下さい。 注）：センダイウイルスの１分子 NP 蛋白が 6 塩基のゲノム RNA を正確認識するため、ゲノ ム RNA の塩基数が 6 の倍数に限って効率的なゲノムの転写複製が行えると言う６ 塩基ルールがあります。 1). NotI サイト単独を利用する場合、 「目的遺伝子の ORF + 1 塩基(目的遺伝子 ORF が 6n+3 の場合) または 4 塩基（目 的遺伝子 ORF が 6n の場合)+ NotI サイト(8 塩基)」の総塩基数を 6 の倍数にします。 2). SacII サイト単独利用する場合、 「目的遺伝子の ORF + 3 塩基(目的遺伝子 ORF が 6n+3 の場合) または 0 塩基(目 的遺伝子 ORF が 6n の場合）+SacII サイト(6 塩基)」の総塩基数を 6 の倍数にします。 3). NotI と SacII 両サイトを利用する場合、NotI∼SacII 断片の塩基数が 44 であり（NotI と SacII の間「 」の塩基数が 30 で 6 の倍数である）、NotI∼目的遺伝子∼SacII 断片と入れ替えると、「∼目的遺伝子 ORF∼」の塩基数を 6 の倍数にします。即ち、「目的遺伝子の ORF + 3 塩基(目的遺 伝子 ORF が 6n+3 の場合) または 0 塩基（目的遺伝子 ORF が 6n の場合)」の総塩 基数を 6 の倍数にします。
Day ‒1 [BHK-21 細胞の用意]
１． サ ブ コ ン フ ル エ ン ト の 状 態 で 培 養 し て い る BHK-21 細 胞 を 、 D-PBS で 一 回 洗 浄 後 、 Trypsin-EDTA (1x) を用いて細胞を剥がし、直ちに 10% FBS / G-MEM / P&S （1x） に浮遊さ せます。２． 生細胞数をカウントし∼6 106 cells/10 mL の 10% FBS / G-MEM / P&S （1x） で 100-mm dish
へ播種します。
３． 37˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで一晩培養します。
Day 0 [BHK-21 細胞への感染と遺伝子導入]
４． -80˚C で保存されている Helper SeV/∆Fを 37˚C 恒温槽で溶かし、速やかに解凍（氷が見えな くなる直前に on ice へ）します。
５． 軽く 3 回 vortex してから、6 107 CIU/dish で前日に用意した BHK-21 細胞へ添加し、
丁寧によく混和します。添加する際に、培地を除く必要はありません。
６． 37˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで１時間培養し、Helper SeV/∆Fを感染させま す。
７． Helper SeV/∆Fを感染させている間に、DNA/LipofectamineTM 2000 混合液をポリスチレン製チ
ューブに用意します。70 µL/dish の LipofectamineTM 2000 を、1.5 mL/dish の Opti-MEM （原
液）で希釈し、室温で 5 分間静置後、同量 1.5 mL/dish の Opti-MEM (原液)で希釈した目的遺 伝子を導入した SeV Miniplasmid (20µg/dish) および F Protein Expression Plasmid（20 mg/ dish）と混合し、室温 20 分∼30 分間静置します。
８． Helper SeV/∆Fの感染処理後（1 時間培養後）培地を除き、Opti-MEM（原液）で 1 回洗浄後、 20% FBS/Opti-MEM （P&S 無し）*を 3 mL/dish で添加します。
９． ステップ７で調製した DNA/LipofectamineTM 2000 混合液を 3 mL/dish で添加した後、
速やかに丁寧によく混合します。
１０． 37˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで 6 時間培養します。
１１． 10% FBS/G-MEM (P&S 無し)* を 6 mL/dish で添加します。培地は 12 mL/dish になります。 *注）：通常 BHK-21 細胞を継代維持する時には、10% FBS / P&S (1x) / G-MEM を使用し
ますが、P&S が Transfection 効率に影響するため、Day 0 では 10% FBS / G-MEM (P&S 無し) を使用します。
１２． 37˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで 18 時間培養します。
Day 1 [培地交換]
Day 0 に Helper SeV/∆F を感染させ、目的遺伝子を搭載した SeV Miniplasmid および F Protein Expression Plasmid を導入してから 24 時間経過した後、培地交換を行います。
１３． VP-SFM (-FBS)で１回洗浄してから、Trypsin / VP-SFM (-FBS)（用時調製）を 6 mL/dish で添加します。
注）：ウイルスの回収時に添加する Trypsin は、invitrogen で販売している EDTA を含まな いもの(0.25%, x1, invitrogen, ca. no.15050-065)を使用します(8 ページ参照)。Trypsin は 小 分 注 後 に -20 ℃ で 保 存 し 、 用 時 調 製 し て く だ さ い 。 こ の 0.25% Trypsin を VP-SFM(-FBS)で 1000 倍に希釈して (使用濃度 0.00025%Trypsin)、ご使用ください。 また、SeV ウイルス回収用の培地には VP-SFM （-FBS）の代わりに Opti-MEM を 使用することが可能ですが、ウイルスの生産性が約半分に低下する場合があり ますので注意が必要です。 １４． 32˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで 24 時間培養します。 注）：32˚C での培養が非常に重要ですので、変更しないでください。
Day 2 [培地交換]
１５． Trypsin / VP-SFM (-FBS)（用時調製）を 6 mL/dish で培地交換します。 １６． 32˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで 24 時間培養します。 注）：32˚C での培養が非常に重要ですので、変更しないでください。Day 3∼5 [培養上清回収、培地交換、保存]
Day 3∼5 は下記のステップ 17∼21 に従い毎日培養上清の回収、培地交換とウイルス液の保存 を行います。通常、Day 4, Day 5 にかけて組換え SeV ミニベクターの生産性が良くなりますので Day 4 および Day 5 の培養上清のみ回収してもかまいません。１７． 培養上清（組換え SeV ミニベクターを含む培地）を回収し、6 mL/dish の Trypsin / VP-SFM (-FBS)（用時調製）を添加します。 １８． 32˚C、5% CO2に設定した CO2インキュベーターで 24 時間培養します。 注）：32˚C での培養が非常に重要ですので、変更しないでください。 １９． 回収した培養上清は、4˚C、3,000 rpm で 1 分間遠心して細胞残骸などを沈殿させます。 ２０． 上清を回収し、最終濃度が 1% BSA になるように 7.5% BSA を加えます。 （例：上清 6.5 mL に対して 7.5% BSA を 1 mL 加えます。） 注）：回収した上清をさらに超遠心処理により組換え SeV ミニベクターを濃縮してから保 存する方法もあります（ウイルス液濃縮プロトコールの項を参照して下さい）。濃縮し た場合は BSA を添加する必要はありません。 ２１． -80˚C に保存してください。-80˚C への保存の際には、急速凍結法（ドライアイス / エタノ ール、液体窒素など）で速やかに凍結してください。
[目的細胞への組換え SeV ミニベクターの感染]
目的の遺伝子を効率よく発現させる条件は、さまざまな要因に影響されます。目的遺伝子の性 質、感染させる細胞、感染前の細胞の状態、ウイルスの濃度（原液あるいは濃縮液）、培養日数 などの至適条件を検討する必要があります。 ２２． 標的細胞（感染させる細胞）を用意します。標的細胞は、2∼3 日間の培養期間中に オーバーグロースにならないように注意して下さい。 ２３． -80˚C で保存されている組換え SeV ミニベクターを含むウイルス液を 37˚C 恒温槽で 溶かし、速やかに解凍（氷が見えなくなる直前に on ice へ）します。 ２４． 軽く 3 回 vortex してから適量を培地に添加して下さい。２５． 至適条件で培養後、2∼3 日後に Immunofluorescence 法や Western blot 法などにより、目 的タンパク質の発現を確認します。
[組換え SeV ミニベクターウイルス液濃縮プロトコール]
します。 ２） 回収した上清を 0.45 µm フィルターで濾過します。 ３） 4˚C、∼ 45,000 x g で 2 時間超遠心処理します。 ４） ピペットなどで丁寧に上清を除き、適量（必要な濃縮倍率に合わせます）の D-PBS を 沈殿へ添加し、4˚C で緩やかに懸濁します。量が多い場合は 4˚C で数時間放置してから丁 寧に軽く vortex により懸濁します。 ５） 小分け分注（例えば∼0.2 mL/本など）後、ドライアイス / エタノールを用いて速やかに凍 結後、-80˚C へ保存します。
ＶＩＩ． 参考文献
・ 日 本 語 総 説1) Drug Delivery System 22(6): 636-642 (2007)
「センダイウイルスベクターを利用したワクチン技術の開発」 井上 誠 2) 蛋白質・核酸・酵素 52(10): 1194-1199 (2007) 「センダイウイルス感染と宿主自然免疫」 加藤 篤、清谷 克寛 3) ウイルス 57(1): 29-36 (2007) 「特集. 第 54 回日本ウイルス学会学術集会、2. センダイウイルスベクター：ベクター開発と医療・ バイオ分野への応用」 飯田 章博 4) 蛋白質・核酸・酵素 51(1): 27-37 (2006) 「センダイウイルス工学の展開」 永井 美之、加藤 篤、井上 誠 5) 岩波書店 ISBN4-00-006274-3 C0345 (2006) 「センダイウイルス物語 ---日本発の知と技---」 永井 美之 6) ウイルス 54(2): 179-188 (2004) 「特集 1. ウイルスとインターフェロン、3. 自然免疫に対抗するセンダイウイルス蛋白質」 加藤 篤 7) ウイルス 53(2): 171-175 (2003) 「特集. ウイルスベクター:最新の話題、4. センダイウイルスベクター」 飯田 章博、加藤 篤 8) 蛋白質・核酸・酵素 48(10): 1364-1370 (2003) 「センダイウイルスアクセサリーC 蛋白質の機能」 加藤 篤 9) 蛋白質・核酸・酵素 48(10): 1371-1377 (2003) 「センダイウイルスのリバースジェネティクスを活用した新規遺伝子治療用 RNA ベクター 細胞質遺伝子治療の確立へ向けて」 飯田 章博、長谷川 護 10) Biotherapy, 19(2): 85-92 (2005)
・ 英 文 論 文
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4) Sasaki K et al., Gene Ther. 2005; 12(3): 203-210 : ES cell 5) Inoue M et al., J Gene Med. 2004; 6(10): 1069-1081 : Vector
6) Ferrari S, et al., Gene Ther. 2004; 11(22): 1659-1664 : Airway epithelium 7) Matano T et al., J Exp Med. 2004; 199(12): 1709-1718 : AIDS
8) Kinoh H et al., Gene Ther. 2004; 11(14): 1137-1145 : Vector (Cancer) 9) Shirakura M et al., Gene Ther. 2004; 11(9): 784-790 : Brain ischemia 10) Okano S et al., Gene Ther. 2003; 10(16): 1381-1391 : T cell
11) Inoue M et al., J Virol. 2003; 77(11): 6419-6429 : Vector 12) Jin CH et al., Gene Ther. 2003; 10(3): 272-277 : HSC 13) Tokusumi T et al., Virus Res. 2002;86(1-2):33-38 : Vector
14) Masaki I et al., Circ Res. 2002; 90(9): 966-973 : Critical limb ischemia 15) Yamashita A et al., J Immunol. 2002; 168(1): 450-457 : Rheumatoid arthritis 16) Shiotani A, Gene Ther. 2001; 8(14): 1043-1050 : Skeletal muscle
17) Masaki I et al., FASEB J. 2001; 15(7): 1294-1296 : Vascular system
18) Yonemitsu Y et al., Nat Biotechnol. 2000; 18(9) : 970-973 : Airway epithelium 19) Li HO et al., J Virol. 2000; 74(14): 6564-6569 : Vector
20) Kato A et al., Genes Cells, 1996; 1: 569-579 : Vector
21) Vulliémoz D, Roux L.J Virol. 2001 May;75(10): 4506-18 : Rule of six 22) P Calain and L Roux J Virol. 1993 August; 67(8): 4822‒4830 : Rule of six
VIII． SeV ミニベクター遺伝子地図
・ SeV ミニベ クター 情 報 cDNA plasmid の骨格が pUC18
SeV minigenome：センダイウイルス Z 株に由来し、Leader と Trailer 以外のウイルス構造蛋白をコ ードする遺伝子を全て除去した plasmid
RNA polymerase I Promoter：murine 由来 Ribozyme：肝炎ウイルス由来
ApR：アンピシリン耐性遺伝子
・SeV Miniplasmid の 遺 伝 子 搭 載 近 傍 の 塩 基 配 列
Forward primer
accaaacaagagaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagt
tatacaggattttagtgtcaaagtatccaccctgagg
agcaggttccagaccctaaaaaacatgtatgggatatgtaatgaagttatacaggattttagggtcaaagtatccaccc
tgaggagcaggttccagaccctttgctttgctgccaaagttcac
GCGGCCGC
tagtccctatcgtgcagaacgat
cgaagct
CCGCGG
tacctggaagtcttggacttgtccatatgacaatagtaagaaaaacttacaagaagacaaga
aaatttaaaaggatacatatctcttaaactcttgtctggt
Reverse primer (complementary)
緑色：Leader 配列赤色：NotI site オレンジ色：SacII site
青色：Tailer 配列
インサートの確認を行う場合のシークエンス用 primer には下記の配列をご使用ください。
Forward primer: ACAAGAGAAAAAACATGTATGG Reverse primer: CCAGACAAGAGTTTAAGAGATATG
IX． 組換え SeV ミニベクターを作製するにあたっての注意点
カル タヘ ナ 法 に つ い て ・ 本キットは、「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法 則(カルタヘナ法)」の対象品です。使用の際には、カルタヘナ法に則して適切にお取り扱いく ださい。 ・ 本キットの使用目的は、基礎研究目的のみに限られます。本キットは、ヒトや動物への適用、 臨床診断へは使用できません。 本 キットの 使 用 について ・ 本キットの使用には遺伝子工学と細胞培養に関する基本的な技術が必要です。 ・ 本キットは、BHK-21細胞中で哺乳動物に感染性を有する組換えウイルスを作製するキットで す。本キットの使用には文部科学省の定める省令（「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等 の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置を定める省令」平成16年文部科学省･環 境省令第1号）にあるP2レベル以上の施設が必要です。 ・ 本キットで作製した組換えウイルスは増殖することはできませんが、万一皮膚や気道などに 付着した場合、効率よく細胞内に入り込んで目的遺伝子を発現します。吸入や付着を防ぐた め、必ず、安全キャビネットを使用してください。 ・ 本キットの使用はすべて研究用に限定されています。臨床目的での使用および生体外診断 に使用することはできません。 ・ 本キットご利用の際は省令および組織内の組換えDNA実験安全委員会の指示に従い、安全 には十分ご注意下さい。 ・ 本キットの使用によって生じたいかなる事故、損害について、弊社では責任を負いかねます ので、ご了承の上ご使用下さい。 ・ 本キットを工業的に使用される場合は、個別にライセンス契約の締結が必要です。 付録 1．組換え SeV ミニベクターの取り扱いについて 1．実験施設組換え SeV ミニベクターの取り扱いは、（VI. Day 0[BHK-21 細胞への感染と遺伝子導入] のステップから）P2 の封じ込めレベルの実験施設が必要です。挿入遺伝子によっては、それ 以上の封じ込めレベルが必要となります。組織内の安全委員会の組換え DNA 実験指針に 従って下さい。
ングなどのついたシーリングキャップ付きのマイクロチューブをご使用ください。また、これら のマイクロチューブは、P2 施設内のディープフリーザー（‐80℃）内で保管して下さい。液体 窒素タンク内に保管されることは、チューブが破裂したりすることがあり、危険ですので安全 面上お勧めできません。 3．凍結融解 凍結時は、ウイルス液の入ったマイクロチューブのキャップを強くしめ、ドライアイス/エタノ ール或いはドライアイス/メタノール溶液中で急速に凍結します。また、融解時は、37℃の温 浴に浸けて融解します。そのまま保持し、半分くらい溶けたところで取り出し、余熱で最後ま で溶かします。融解した後は、使用するまで氷上に保持して下さい。 また、凍結融解を繰り返すことにより、力価が下がることがあります。複数回の凍結融解 を避けてご使用下さい。予め、分注してありますので、個々のチューブでの使いきりを推奨 致します。 4．組換えウイルスの保存期間 保存条件により、力価が徐々に低下する可能性があります。調製から 1 年を過ぎて使用 する場合には、力価を再度測定しなおしてからご使用されることをお勧めします。 付録 2．P2 レベルとは 組換え SeV ミニベクターを使用する実験は、「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二 種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定める省令」（平成 16 年文部科学省･環境省令 第 1 号）（平成 16 年 2 月 19 日施行）により、P2 以上の拡散防止措置が求められています。省令 に記載の拡散防止措置に従って実験を行って下さい。 なお、詳細は、各研究施設における組換え DNA 委員会の判断に従って下さい。 ＜参考；省令別表第二（第四条第二号関係）より抜粋＞ 拡散防止の区分：P2/P2A レベル イ、施設等について、次に掲げる要件を満たすこと。 1) 施設等について、実験室が、通常の生物の実験室としての構造及び設備を有すること。 2) 実験室に研究用安全キャビネットが設けられていること（エアロゾルが生じやすい操作をす る場合に限ります。）。 3) 遺伝子組換え生物等を不活化するために高圧滅菌器を用いる場合には、実験室のある建 物内に高圧滅菌器が設けられていること。 ロ、遺伝子組換え実験の実施に当たり、次に掲げる事項を遵守すること。 1) 遺伝子組換え生物等を含む廃棄物（廃液を含みます。以下同じ。）については、廃棄の前に
遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること。 2) 遺伝子組換え生物等が付着した設備、機器および器具については、廃棄又は再使用（あら かじめ洗浄を行う場合にあっては、当該洗浄。以下「廃棄等」という。）の前に遺伝子組換え 生物等を不活化するための措置を講ずること。 3) 実験台については、実験を行った日における実験の終了後、及び遺伝子組換え生物等が 付着したときは直ちに、遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講ずること。 4) 実験室の扉については、閉じておくこと（実験室に出入りするときを除きます。）。 5) 実験室の窓等については、昆虫等の侵入を防ぐため、閉じておく等の必要な措置を講ずる こと。 6) すべての操作において、エアロゾルの発生を最小限にとどめること。 7) 実験室以外の場所で遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を講じようとするときそ の他の実験の過程において遺伝子組換え生物等を実験室から持ち出すときは、遺伝子組 換え生物等が漏出その他拡散しない構造の容器に入れること。 8) 遺伝子組換え生物等を取り扱う者に当該遺伝子組換え生物等が付着し、又は感染すること を防止するため、遺伝子組換え生物等の取り扱い後における手洗い等必要な措置を講ずる こと。 9) 実験の内容を知らない者が、みだりに実験室に立ち入らないための措置を講ずること。 10) エアロゾルが生じやすい操作をするときは、研究用安全キャビネットを用いることとし、当該 研究用安全キャビネットについては、実験を行った日における実験の終了後に、及び遺伝 子組換え生物等が付着したときは直ちに、遺伝子組換え生物等を不活化するための措置を 講ずること。 11) 実験室の入口及び遺伝子組換え生物等を実験の過程において保管する設備（以下「保管 設備」という。）に、「P2 レベル実験中」と表示すること。 12) 執るべき拡散防止措置が P1 レベル、P1A レベル又は P1P レベルである実験を同じ実験室 で同時に行うときは、これらの実験の区域を明確に設定すること、又はそれぞれ P2 レベル、 P2A レベル若しくは P2P レベルの拡散防止措置を執ること。
X．組換えセンダイウイルスミニベクター調整キット使用についての Q&A
Q1 プロトコール中の細胞培養に関するポイントを教えてください。 A1Day0∼5 での培養時の細胞の扱いについてのポイントをまとめました。 ・Day0 の細胞の状態は重要です。（細胞密度が 80%程度） ・コラーゲンでコーティングされたプレートを使用する。 ・培地を使用前に 32℃水浴で暖めてから使う。 ・培地交換のときは丁寧に作業するよう心がける。 ・Day1 から 32℃で培養する。 ・Trypsin の濃度 Q2SeV ミニベクターの生産性について教えてください。 A2 Day３で回収してもほとんどの細胞に効率よく感染していましたが、Day４、Day５ほどではありませ ん。実験目的にもよると思いますが、Day４または Day５の上清をご使用ください。 Q3B 細胞への感染効率はどれくらいでしょうか。 A3 B 細胞へ 90%以上の感染効率を得た実績があります。 Q4 血球系細胞の感染効率はどうでしょうか。 A4 感染効率比較したものではありませんが、ヒト CD34 陽性造血幹細胞、T 細胞、DC に感染して発 現しています。 Q5 センダイウイルスが感染しにくいまたは、感染しやすい細胞にはどんなものがありますか。 A5 導入効率が良くない細胞は ・naive T 細胞（ただし活性化 T では導入がよい） ・一部の癌細胞 ミニゲノムキットで調製されたベクターは基本的に通常のセンダイウイルスベクターと同じ感染性を 有するため、通常のセンダイウイルスベクターの関連論文を確認ください。また、下記にまとめまし た。 遺伝子導入の実績（一部例をとして）があるもの in vitro 肝細胞，肺毛細管内皮細胞，平滑筋細胞等のヒト由来の初代培養細胞 ヒト CD34 陽性造血幹細胞，ラット大脳皮質由来初代神経細胞，後根神経節初代神経細胞 サル由来胚性幹細胞 in vivoマウスやヒツジの気道上皮組織，鼻粘膜上皮細胞 ウサギやサルの骨格筋 ヒトの血管上皮細胞，平滑筋 ラットの滑膜細胞，眼球網膜，角膜，脳実質の神経細胞および脳室上衣細胞 Ex vivo 活性化されたマウス及びヒト T 細胞(CD4, CD8)に感染しやすい。 マウス及びヒト naïve T 細胞の感染しにくい(細胞質内に進入できない)。
Q6SeV Miniplasmid、 F Protein Expression Plasmid は自身で増幅可能でしょうか。 A6plasmid ですので、原理的に増幅可能です。 Q7 発現の持続時間は平均どのくらいになるのでしょうか。 A7 通常のセンダイウイルスベクターの場合、多くの細胞で長期に発現が持続します（持続発現細胞 の樹立可能）。但し、センダイウイルスミニベクターの場合は、in vitro で最低１週間の持続発現が確 認されておりますが、長期の発現持続に関する評価例がありません。 Q8 今回のセンダイウイルスミニベクターは Journal of Virology 1997 78 2813-2820 で発表されて いる論文の配列と何が異なっているのでしょうか。 A8 ご指定の論文は、wild type をベースにした伝播型ベクターです。センダイウイルスミニベクターは、 F 遺伝子を欠失した非伝播型ベクターをベースにしております。伝播型ベクターの場合、大臣申請が 必須になります。 Q9 終止コドンは入れる必要があるのでしょうか。 A9 目的遺伝子 ORF（スタートコドンからストップコドンまでの配列）を搭載するので、終止コドン（ストッ プコドン）はお客様自身で入れていただく必要があります。 Q10 外来遺伝子のセンダイウイルスミニベクター配列への挿入場所における発現量の差はあるので しょうか。 A10 センダイウイルスベクターの場合、Leader に近いほど外来遺伝子を搭載した方が、発現量が高 い傾向となります。しかしセンダイウイルスミニベクターの場合、配列が短く、NotI か SacII のどちらに 挿入しても発現量に大きな違いがないと思われます。 Q11NotⅠなどの挿入の際の方向は正方向/逆方向どちらでもよいのでしょうか。 A11 逆方向の場合は発現しませんので、正方向になる必要があります。
発現量の違いはありますか。
A12GFP などマーカー遺伝子を搭載した場合、通常の SeV ベクターと SeV ミニベクター調製キットで 調製したベクターの発現量において大きな差が見られておりません。 Q13 どのフレームにあわせればよいのでしょうか。 A13 フレームに関してはどのフレームでも発現に問題はありません。 Q14 センダイウイルスミニベクターは大腸菌でも増えるのでしょうか。 増えるのであれば相性のよい 大腸菌情報についてもあわせて教えてください。 A14 センダイウイルスミニベクターの cDNA プラスミドの調製は大腸菌を使用していますが、センダイ ウイルスミニベクター(ウイルス)の調製が能書に記載されている BHK-21 細胞を使用する必要があ り、大腸菌が使えません。また、プロモーターやベクターの相性などで、BHK-21 細胞以外の動物細 胞でもお薦めできません。 センダイウイルスミニベクターcDNA plasmid の調製は弊社では DH5α を使用しており、100ml スケー ルでは数百µg の収量が得られます。特に相性が良いという観点からの検討が行っておりません。 Q151.5Kb がクローニングする断片として最適という表現について教えてください。 A15 ミニゲノムのサイズがヘルパーウイルスゲノムのサイズより短いため、転写複製効率がよく、ヘ ルパーウイルスと共存した環境でよく回収されますが、搭載遺伝子サイズが長くなるほど、ミニゲノ ムの転写複製効率も低くなり、回収量が低下することが予想されます。これまでの実績から 1.5kb ま でのサイズでは効率よく生産できますが、それ以上サイズはお薦め致しておりません。 Q16 センダイウイルスミニベクターで RNAi 用の利用をしているのでしょうか。 （ヘアピンループをとるものなど、ウイルスの増殖に影響がある可能性あり） A16 現時点ではありません。 Q172 次的な感染性がないかを証明するためのウイルス検出キット(市販品)などはありますか。市販 キットがない場合、検出方法について教えてください。 A17 キ ッ ト は あ り ま せ ん 。 ま た 、 今 回 使 用 し て い る ウ イ ル ス は F 遺 伝 子 欠 失 型 で す の で 、 Non-transmissible タイプであり、伝播性はありません。（Li HO et al., J Virol. 2000）
確認方法１）
感染細胞の培養上清を別の非感染細胞へ感染させて、その上清中に 2 次的な感染性ウイルスが含 まれているかを調べる。その確認方法として考えられるのは、
・細胞染色(*) お薦め致します。 ・WB(*)
・PCR ＊MBL 社製 抗 SeV ポリクローナル抗体を用いる。 確認方法２） マウス血漿中の SeV に対する抗体を見る。 センダイウイルスミニベクターキットを使用して、ウイルスを作製する。 ↓ ウイルスを ELISA プレートに固相化させる。 ↓ マウス血漿中（感染マウスゲージに隣接したゲージにいたウイルス無投与群マウス）の センダイウイルス抗体価を測定する。 センダイウイルス の抗原プレートが市販されていますので、それを使用することが可能です。 抗 センダイウイルス 抗体検出用 ELISA： ・プレザイム「生研」HVJ-抗原プレート センダイウイルス抗原越固相化プレート 商品番号 250 155 デンカ生研株式会社 1 セット (96 wells) \20000 関連製品として、下記のものがあります。 ・プレザイム「生研」HVJ-陽性コントロール (マウス)(強陽性・弱陽性) センダイウイルス陽性血清 (マウス) 商品番号 250 193 デンカ生研株式会社 1 セット (0.2ml 各 1 本) \10000 ・プレザイム「生研」発色試薬 (マウス) 商品番号 250 117 デンカ生研株式会社 1 セット (96 wells x3) \35000 Q18 キットで調製したセンダイウイルスミニベクターを目的の細胞に感染させた場合、自然免疫応答 は引き起こるのでしょうか。（本キットを用いて遺伝子導入ではなく、センダイウイルスが細胞に感染 する際の、免疫応答を研究するためのツールとして本キットを使用） A18 本キットで調製したベクターはミニゲノムセンダイウイルスとヘルパーセンダイウイルスが共存し ているものです。目的細胞に感染させた場合、細胞内でベクターがミニゲノムセンダイウイルスと ヘ ルパーセンダイウイルスの両方が発現し、理論上通常のセンダイウイルスベクターと同様な自然免
ができません。 Ｑ19 ウイルス液は再感染して増やすことはできないでしょうか。 Ａ19BHK-21 細胞から本キットを用いて調製したウイルス液には、ウイルスゲノムに F 遺伝子が欠損 されており、また F 発現プラスミドも含まれていません。そのため、そのウイルス液を発現させたい細 胞に感染させた後に再度伝播性のあるウイルスを回収することはできません。（ウイルスの感染性 に必要な F 蛋白が供給されていないため。） センダイウイルスベクターの「2 次感染が無い=安全である」という利点となっているとご理解いただけ ればと思います。 Q20 組換えセンダイウイルスミニベクター調製キットのセンダイウイルスの力価測定方法について教 えてください。 A20 センダイウイルスミニベクターの場合は、感染後、更に細胞全体に 100%ヘルパーウイルスを感 染させる必要があるとともに、センダイウイルスミニベクター感染細胞を同定するためには、抗 SeV 抗体の代わりに、目的遺伝子に対する抗体が必要になります（細胞染色の場合の一次抗体として）。 抗体がない場合は、予め tag 付きで発現し、tag に対する抗体を使用して染色します。定量性を持 って数値を出すことは、簡単ではありません。 Q2１記載のプロトコール通りに実験を行った場合、おおよそどの程度のタイターのウイルスが採取で きますか。 A2１搭載遺伝子（サイズ、機能など）にもよりますが、GFP 搭載の場合、標準プロトコーで 1 10 の 7 乗から 1 10 の 8 乗 CIU/ml の Titer を取得することが可能です。
Q22Helper SeV/ΔF のみ、F Protein Expression Plasmid のみの販売はありますか。
A22Helper SeV/ΔF あるいは F Protein Expression Plasmid のみの販売は行っておりません。
Q23SeV Miniplasmid のみの販売はしていますか。
A23 現在 SeV Miniplasmid のみの販売は行っておりません。
Q24 Q:SeV Miniplasmidの全配列を教えてください。 A24:SeV Miniplasmidの配列については、能書に記載されている一部の配列及び制限酵素サイトの みのご提示でご容赦ください。搭載遺伝子の確認は、遺伝子を搭載した部分の上流及び下流（SeV Miniplasmid部分（15ページ シークエンス用プライマー参照)）や遺伝内部のプライマーを用いて塩基 配列を確認していただければと思います。 参 考 文 献
Hasan MK, Kato A, Shioda T, Sakai Y, Yu D, Nagai Y. J Gen Virol. 1997 Nov;78 ( Pt 11):2813-20. Creation of an infectious recombinant Sendai virus expressing the firefly
luciferase gene from the 3' proximal first locus.
＜2 次感染関連＞
Li HO et al., J Virol. 2000 Jul;74(14):6564-9.
A cytoplasmic RNA vector derived from nontransmissible Sendai virus with efficient gene transfer and expression.
＜導入効率関連＞
ウイルス 第 57 巻 第１号，pp.29-36，2007
センダイウイルスベクター：ベクター開発と医療・バイオ分野への応用、飯田 章博
Gene Therapy (2003) 10, 1381‒1391
RESEARCH ARTICLE Recombinant Sendai virus vectors for activated T lymphocytes.
The Journal of Immunology, 2006, 177: 3564-3576.
Induction of Efficient Antitumor Immunity Using Dendritic Cells Activated by Recombinant Sendai Virus and Its Modulation by Exogenous IFN-Gene.
Gene Therapy (2003) 10, 272‒277
RESEARCH ARTICLE Recombinant Sendai virus provides a highly efficient gene transfer into human cord blood-derived hematopoietic stem cells.
J Gene Med. 2003 Jul;5(7):543-53.
Sendai virus vectors as an emerging negative-strand RNA viral vector system.
Curr Opin Mol Ther. 2005 Aug;7(4):346-52. Sendai virus for gene therapy and vaccination.
