哺乳類細胞用恒温振とう培養器CO2インキュベーションシェーカーCO2-BR-43FLを用いた抗体産生ハイブリドーマの大量培養-香川大学学術情報リポジトリ

哺乳類細胞用恒温振とう培養機 CO

インキュベーションシェーカー CO

-BR-43FLを用いた抗

体産生ハイブリドーマの大量培養法

The mass culture method of the antibody-producing hybridoma using constant temperature concussion

culture machine CO

incubation shaker CO

-BR

-43FL for mammals cells

Osamu Kawamura and Yuka Mitsumoto

Abstract

　In analyses such as the mycotoxins, the immunoaffinity column （IAC）-HPLC method is a superior method. How-ever, the IAC-HPLC method needs relatively a large quantity of antibodies. It becomes the problem to cost for the production of antibodies with time. Therefore, we examined the mass culture method of the antibody-producing hy-bridoma using constant temperature concussion culture machine CO2 incubation shaker CO2-BR-43FL for mammals

cells （Taitec Co., LTD Japan）. The method, using this machine, did not need complicated operation,was able to get a culture supernatant of antibody density at the same level as the flask culture method of 1.6 L in approximately one week, and was cheap running cost. This method is a method suitable for mass production of the monoclonal antibody. Key words : immunoaffinity column, mass production of the monoclonal antibody, mycotoxins

香川大学農学部学術報告　第68巻　33～35，2016 緒 　 言 　マイコトキシンなどの低分子化合物の分析において， イムノアフィニティーカラム（IAC）－HPLC法（１）_は，す ぐれた方法であり，公定法（２）_{にも採用されている．し} かし，IACには，１検体の分析に1～2 mg程度の比較的 大量の抗体を必要とし，抗体の生産に時間とコストがか かることが１番のネックとなっている．抗体産生ハイブ リドーマの大量培養法としては，マウス腹腔内で培養 し，腹水として回収する方法が以前から用いられてき た．しかし，この方法では，マウスからの腹水採取時期 をコントロールするのが難しく計画的な抗体生産には向 かないこと，ハイブリドーマによっては腹水をほとんど 回収できないケースがあること，腹水にはマウス由来の 蛋白質を多く含み煩雑な精製操作が必要なこと，加え て，動物愛護の観点から問題のある方法であることなど から，あまり行われなくなってきた．現在は，無血清 培地に馴化させ，フラスコ培養法，ローラーボトル法， 培養バック法（３）_{などが行われている．これらの方法は，} 既存のCO2インキュベーターを使用できるので，初期費 用はあまりかからないが，操作が煩雑でランニングコス トが高く抗体生産費用を安く抑えることが難しい．そこ で，ランニングコストが培地と0.2 µmのフィルター以外 ほとんど必要としない哺乳類細胞用恒温振とう培養機 CO2インキュベーションシェーカー CO2-BR-43FL（タイ テック株式会社）を用いた抗体産生ハイブリドーマの大 量培養法について検討を行った． 方 　 法 培養条件の設定 　オクラトキシン AとBに同程度に反応するモノクロー ナル抗体産生ハイブリドーマOTB.2（４）_{を無血清培地であ}

るhybridoma-SFM培 地（Gibco，Life Technologies Corpo-ration）に数日間かけて馴化した後，対数増殖期を維持し ながらT-75培養フラスコで30 mLで5×105_{細胞/mLまで，} 5% CO2，37℃で培養した．滅菌した１Lフラスコに細胞 濃度5×104_{細胞/mLになるように300，400と500 mLずつ} OTB.2細胞懸濁hybridoma-SFM培地加え，回転数を60， 80と100 rpmで行い5% CO2，37℃で3日間培養した．培 養上清を回収し，それぞれの条件での抗体濃度を以下の 間接ELISAで抗体価を測定し，各培養条件での抗体濃度

香川大学農学部学術報告　第68巻，2016 Fig. 1　各培養容量と回転数での抗体濃度の比較 0 10 20 30 40 50 60 抗 体 濃 度 (µ g/ m L) 回転数 300 mL 400 mL 500 mL 60 rpm 80 rpm 100 rpm Fig.1 を比較した． 　間接ELISAは，まず，96-ウェルマイクロプレート （NUNC immunoplate II）の各ウエルに100 µLずつオク ラトキシンB-ウシ血清アルブミン結合体（４）_{（200 ng/mL，} 0.01M 炭酸緩衝液（pH 9.6）溶液）を加え，４℃で一晩 静置し，コーティングを行った．0.05%のTween 20を含 むダルベッコのPBS（PBS/Tween）で２回洗浄後，各ウ エルに125 µLずつ0.1% オブアルブミンPBS溶液を加え， 室温で１時間静置しブロッキングを行った．PBS/Tween で３回洗浄後，精製OTB.2抗体と各培養上清のPBSでの 希釈液（1/10-1/105_{）を各ウエルに100 µLずつ加え，室} 温で45分間反応させた．PBS/Tweenで３回洗浄後，西洋 わさびペルオキシダーゼ標識ヤギ抗マウスIg抗体（PBS/ Tweenで4,000倍希釈）を各ウエルに100 µLずつ加え，室 温で45分間反応させた．PBS/Tweenで３回洗浄を２回繰 り 返 し た 後，0.1 mg/mL の3, 3’，5, 5’-tetramethylbenzi-dine （和光純薬）と0.005%の過酸化水素を含む0.1 M酢酸 緩衝液（pH 5.0）を加え，室温で30分間酵素反応を行っ た．１M硫酸50 µLを加え反応を停止したのち，450 nm の吸光度を測定した． 培養期間の検討とフラスコ培養法との比較 　最適培養期間を決定するため，上記の条件で最もよ かった培養容量400 mLで振とう数80 rpmの条件を用い， 10日間培養を行った。毎日，細胞数を計数し，また，培 養上清を一部を採取し，間接ELISAで抗体価を測定し た．さらに，大量振とう培養７日目の培養上清とフラス コ培養法７日目の培養上清の抗体価を比較した． 結果および考察 培養条件の設定 　各培養容量と振とう数での抗体濃度をFig.1に示した． 培養容量400 mL，回転数80 rpmのときが抗体濃度55.5 µg/mLが最も高く，次いで，培養容量300 mL，振とう数 60 rpmの31.3 µg/mLであった．培養１Lあたりの抗体生 産量は、培養容量400 mL、振とう数80 rpmのときが52.2 mg/Lであった． 培養期間の検討とフラスコ培養法との比較 　培養日毎の抗体濃度，総細胞濃度と生細胞濃度の変 化をFig. 2に示した．抗体濃度は，７日目で抗体濃度が 40.1 µg/mLでほぼピークに到達し，その後ほぼ変わらな かった．総細胞濃度は，８日目が最大で2.4×106_細胞/ mLであった．また、生細胞数は、４日目にピークを迎 え、９日目には、ほとんどが死滅していた．培養期間が 長くなると、死細胞が増え、細胞内容物が培地中に放出 される可能性があり、抗体を精製する際に問題となる。 よって、培養期間は７～８日間程度がよいと考えられ た． フラスコ培養法との比較 　CO2インキュベーションシェーカーとT-75フラスコで ７日間培養した上清中の抗体価を測定した結果をFig. 3 に示した．両者の抗体価はほぼ同じであり，CO2イン キュベーションシェーカー培養法とフラスコ培養法で得 られる培地中の抗体濃度はほぼ同じであった．CO2イン キュベーションシェーカー CO2-BR-43FLでは，１度に１ Lフラスコ４本，1.6 Lを培養できる．これは，T-75フラ スコでは，１本当たり30 mL培養できるので，53.3本に 相当し，ほぼ１台のCO2インキュベーターを占拠してし まう．一方，CO2インキュベーションシェーカーでは， 前培養にT-75フラスコが４本と0.2 µmのフィルターが８ 個のみ必要であり，ランニングコストをかなり抑えるこ とができる．また，T-75フラスコで50本以上への植え継 ぎ，維持・管理の手間は膨大な作業量であり，１度セッ Fig. 2 培養日数毎の抗体濃度、総細胞濃度と生細胞濃 度の変化 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 抗 体 濃 度 (µ g/ m L) 培養日数（日） 抗体濃度 総細胞 生細胞 細 胞 濃 度 （ × 1 0 5 細 胞 / ｍ L ) Fig.2 34

川村　理　他：抗体生産ハイブリドーマの大量培養法 トしたら，７～８日間放置できるCO2インキュベーショ ンシェーカーとの作業量との差は絶大である． 　今回は，１つのマウスハイブリドーマでの実験であ り，他のハイブリドーマでの実験が必要であるが，CO2 インキュベーションシェーカーを用いる方法は，初期費 用が240万程度とやや高額であるが，ランニングコスト は低く，作業量も少なく，優れた抗体産生ハイブリドー マの大量培養法と言える． 摘 　 要 　マイコトキシンなどの分析において，IAC-HPLC法 は，すぐれた方法であるが，比較的大量の抗体を必要 とし，抗体の生産に時間とコストがかかることが問題 となっている．そこで，哺乳類細胞用恒温振とう培養 機 CO2インキュベーションシェーカー CO2-BR-43FLを用 いた抗体産生ハイブリドーマの大量培養法について検討 を行った．この方法は，ランニングコストが低く，煩雑 な操作を必要とせず，約１週間で1.6 Lのフラスコ培養法 と同程度の抗体濃度の培養上清を得ることができた．モ ノクローナル抗体の大量生産に適した方法である． Fig. 3 CO2インキュベーションシェーカーを用いた方 法とフラスコ培養法でそれぞれ７日間培養した 培養上清中の抗体価の比較 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 10 100 1,000 10,000 100,000 A 4 50 n m 希釈倍率 CO2インキュベーション シェーカー培養 フラスコ培養

Fig.3

column clean-up techniques in food analysis: A review. J. Chromatogr. B, 878, 115-132 （2010）． ⑵ 厚生労働省医薬食品局食品安全部長：乳に含まれ るアフラトキシン M１の試験法について，食安発 0723第５号，平成27年７月23日 ⑶ 関根俊昭，鈴木小城，木下博保，吉田芳哉，橋本正 勝：培養バッグを用いた簡便かつ効率的なモノク ローナル抗体の生産，生物工学会誌，87，437–441 （2009）． ⑷ 川村　理，鈴木祐介：オクラトキシンBに対するモ ノクローナル抗体の作製，香川大学農学部学術報 告，65，25-28（2013）． 35