ラットとウサギを用いた遺伝子改変技術とバイオリソース作出に関する研究

Title

ラットとウサギを用いた遺伝子改変技術とバイオリソース

_{作出に関する研究( 本文(Fulltext) )}

Author(s)

高橋, 利一

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 乙第146号

Issue Date

2016-09-26

Type

博士論文

Version

ETD

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/55523

ラットとウサギを用いた遺伝子改変技術と

バイオリソース作出に関する研究

2016 年

岐阜大学大学院連合獣医学研究科

目 次 頁 諸 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 1 第 一 章 CAG/EGFP Tg ウ サ ギ 系 統 の 作 出 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 5 材 料 及 び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 7 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 11 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 12 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 16 第 二 章 温 度 感 受 性 SV40 ラ ー ジ T 抗 原 （ SV40 tsA58） Tg ラ ッ ト の 作 出 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 27 材 料 及 び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 29 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 33 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 34 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 37 第 三 章 YAC/BAC DNA 導 入 Tg ラ ッ ト の 作 出 と そ の 作 出 効 率 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 44 材 料 及 び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 46 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 49 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 50 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 54 第 四 章 凍 結 前 核 期 受 精 卵 に よ る Tg ラ ッ ト の 作 出 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 61 材 料 及 び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 62 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 65

考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 66 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 69 第 五 章 免 疫 寛 容 誘 発 ラ ッ ト の 検 証 序 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 72 材 料 及 び 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 73 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 76 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 76 図 表 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 80 結 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 85 謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 87 引 用 ・ ・ ・ ・ ・ ・ 89

1 諸 言 1970 年 代 の 遺 伝 子 工 学 技 術 の 急 速 な 発 展 に よ り ，現 在 ま で に 様 々 な 遺 伝 子 組 換 え 生 物 が 作 出 さ れ て い る 。 生 命 科 学 研 究 の 領 域 に お い て は ， そ の 対 象 動 物 と し て 主 に マ ウ ス が 使 わ れ て き た 。 マ ウ ス は 遺 伝 学 的 に も 微 生 物 学 的 に も 最 も 統 御 さ れ て い る 実 験 動 物 で あ り ， 遺 伝 子 改 変 動 物 作 出 の 基 盤 で あ る 生 殖 工 学 技 術 も 整 備 さ れ ，ト ラ ン ス ジ ェ ニ ッ ク（ Tg），ノ ッ ク ア ウ ト ，ノ ッ ク イ ン ， コ ン デ ィ シ ョ ナ ル ノ ッ ク ア ウ ト の 自 由 自 在 な 遺 伝 子 改 変 技 術 の 手 法 を 用 い て in vivo に お け る 遺 伝 子 機 能 解 析 が 行 わ れ ， さ ら に 多 様 な ヒ ト 疾 患 モ デ ル 動 物 の 開 発 が な さ れ て い る 。ま た ，遺 伝 子 ト ラ ッ プ 法 を 用 い た ES 細 胞 の 網 羅 的 な 遺 伝 子 破 壊 の 国 際 的 な プ ロ ジ ェ ク ト や ， N-ethyl-N-nitrosourea （ ENU） よ る 点 突 然 変 異 に よ る 飽 和 突 然 変 異 体 作 製 プ ロ ジ ェ ク ト な ど の よ う に ， 症 状 の 有 無 に か か わ ら な い 網 羅 的 な 遺 伝 子 変 異 の 研 究 資 源 作 り も 行 わ れ て い る 。 世 界 中 で 作 出 さ れ た 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス 系 統 は ， 各 国 の リ ソ ー ス プ ロ ジ ェ ク ト に

よ り 収 集・保 管 が 行 わ れ ，こ れ ら 情 報 は International Mouse Strain Resource

（ http://www.findmice.org/ ） に 登 録 ・ 公 開 さ れ て い る こ と か ら ， 実 験 モ デ ル マ ウ ス の 検 索 か ら 入 手 ま で を ス ム ー ズ に お こ な う こ と が で き る 。 マ ウ ス が 最 も 優 れ た 実 験 動 物 で あ る こ と は 間 違 い な い 。し か し ，「 実 験 モ デ ル 動 物 は マ ウ ス だ け で 充 分 か ？ 」 と い う 質 問 に 「 充 分 で あ る 」 と 明 言 す る 研 究 者 は そ う 多 く は な い 。 そ の 原 因 を 考 え て み る と ， 一 つ に は 「 ヒ ト へ の 外 挿 」 が あ る 。 外 挿 と は ， い く つ か の 実 験 動 物 の 反 応 （ 実 験 点 ） か ら ， そ の 延 長 線 上 に あ る ヒ ト の 反 応 を 推 定 す る こ と で あ る 。 特 に 医 薬 品 開 発 の 薬 理 試 験 や 毒 性 試 験 に は こ の 視 点 に 重 き が 置 か れ る 。 も う 一 つ は 「 ヒ ト 臨 床 応 用 へ の 橋 渡 し の 実 験 モ デ ル 」 で あ る 。 採 取 可 能 な サ ン プ ル 量 が 少 な く ， 反 復 採 血 が で き な い な ど の 「 生 体 試

2 料 採 取 の 限 界 」，臓 器 移 植 研 究 な ど で 血 管 吻 合 手 術 が 困 難 と い う「 外 科 的 手 術 の 限 界 」，同 じ 遺 伝 子 の 変 異 を 有 し て い て も ヒ ト と 同 じ 表 現 型 に な ら な い と 言 っ た 「 動 物 の 有 す る 特 性 の 限 界 」 な ど が 橋 渡 し 研 究 へ の 障 壁 に な っ て い る 場 合 が あ る 。 こ の よ う な 観 点 か ら ，in vivo 実 験 医 学 に お け る 遺 伝 子 改 変 動 物 作 出 に お い て マ ウ ス 以 外 の 動 物 種 を 用 い る こ と は ，よ り 適 確 な ヒ ト へ の 外 挿 に 寄 与 し ， ヒ ト の 症 状 に 近 似 の 動 物 実 験 モ デ ル 開 発 の 可 能 性 も 有 し て い る 。 ま た ， 臓 器 移 植 研 究 ， 再 生 医 療 研 究 用 の 実 験 モ デ ル と し て ， よ り 大 型 の 動 物 種 を 用 い た 遺 伝 子 改 変 動 物 が 利 用 可 能 と な れ ば ， 様 々 な 橋 渡 し 研 究 に お い て ， 適 合 す る 動 物 種 の 選 択 肢 が 増 す も の と 考 え ら れ る 。 本 研 究 で 対 象 と し た 動 物 種 は ラ ッ ト と ウ サ ギ で あ り ， 双 方 に 共 通 す る 点 と し て ， 動 物 実 験 の 再 現 性 を 高 め る た め の 重 要 な 要 件 で あ る 遺 伝 学 ， 微 生 物 学 的 に 統 御 さ れ た 均 質 な 動 物 で あ る 点 ， さ ら に こ れ ら 動 物 は ブ リ ー ダ ー か ら 容 易 に 購 入 で き る と い う 点 が あ る 。 ラ ッ ト は マ ウ ス に 次 ぐ 遺 伝 学 的 ，微 生 物 学 的 に 統 御 さ れ た 実 験 動 物 で あ り ， 近 交 系 ， 自 然 発 症 変 異 ラ ッ ト が 存 在 し ， 基 本 的 な 生 殖 工 学 技 術 が あ る 程 度 確 立 し て い る 。ま た ，成 体 重 量 が マ ウ ス に 比 べ て 約 10 倍 大 き い こ と か ら ，解 析 に 充 分 な 量 の 生 体 試 料 を 確 保 す る こ と ， 血 液 の 反 復 採 取 が 可 能 で あ り ， 様 々 な 外 科 的 手 術 処 置 を 施 す こ と な ど が 可 能 で あ る 。 こ の 背 景 よ り 生 理 学 ， 薬 理 学 ， 毒 性 学 的 研 究 で 広 く 用 い ら れ て き て お り ， 外 挿 性 を 高 め る た め 選 択 さ れ る 動 物 種 で も あ る 。 こ の 優 位 性 か ら ヒ ト HLA-B21 遺 伝 子 を 導 入 し た Tg ラ ッ ト の リ ュ ウ マ チ モ デ ル（ 42），ヒ ト レ ニ ン 遺 伝 子 を 導 入 し た Tg ラ ッ ト の 高 血 圧 モ デ ル （ 95） な ど ， マ ウ ス で は 樹 立 す る こ と が で き な か っ た 病 態 を 示 す 遺 伝 子 改 変 ラ ッ ト が 研 究 に 使 用 さ れ て い る 。ま た ，生 体 試 料 採 取 の 優 位 性 か ら ， 乳 汁 中 に 医 薬 品 と な る タ ン パ ク 質 を 作 ら せ る Bioreactor（ 動 物 工 場 ） で は ，

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家 畜 （ 主 に ウ シ ） へ の 適 用 を 目 指 し た 実 験 モ デ ル と し て ラ ッ ト が 選 択 さ れ て

い る （ 55， 83）。 ま た ， 全 身 性 に Green Fluorescent Protein （ GFP） を 発 現

さ せ る Tg ラ ッ ト（ 40）は ，臓 器 移 植 に お け る in vivo メ ー ジ ン グ の 実 験 モ デ ル と し て ，様 々 な 臓 器 の 移 植 実 験 に 利 用 さ れ て い る（ 3，62，64，102，113）。 ウ サ ギ は 非 げ っ 歯 類 で あ り 、 モ ル モ ッ ト に 次 い で 使 用 さ れ て い る 動 物 で あ る 。 ま た 、 ク ロ ー ズ ド コ ロ ニ ー で 維 持 さ れ ， バ リ ア 施 設 を 使 っ て Specific-Pathogen-Free（ SPF）環 境 下 で 生 産 さ れ て い る 点 か ら ，マ ウ ス ，ラ ッ ト に 次 い で 遺 伝 学 的 ， 微 生 物 学 的 に 整 備 さ れ た 実 験 動 物 で あ る 。 さ ら に ， 脂 質 代 謝 が ヒ ト に 近 似 （ LDL に 富 む ） し て お り ， 高 コ レ ス テ ロ ー ル 食 負 荷 に よ っ て 動 脈 硬 化 が 好 発 し ，し か も そ の 病 変 が ヒ ト に 類 似 し て い る（ 26）。こ れ ら の 特 性 か ら ヒ ト 肝 臓 リ パ ー ゼ （ 25）， ヒ ト ア ポ リ ポ タ ン パ ク A（ 27）， ヒ ト リ ポ キ シ ゲ ナ ー ゼ（ 106），ヒ ト コ レ ス テ ロ ー ル ア シ ル ト ラ ン ス フ ェ ラ ー ゼ（ 11） 導 入 Tｇ ウ サ ギ な ど ， 高 コ レ ス テ ロ ー ル 血 症 や ア テ ロ ー ム 性 動 脈 硬 化 の 病 態 モ デ ル が 開 発 さ れ て い る 。 ま た ， 心 臓 疾 患 の QT 延 長 症 候 群 モ デ ル （ 12）， 網 膜 変 性 の ロ ド プ シ ン 遺 伝 子 変 異 モ デ ル （ 70） が 開 発 さ れ て い る と と も に ， ヒ ト HLA-A2.1 遺 伝 子 を 導 入 し た Tg ウ サ ギ （ 57） で は ヒ ト パ ピ ロ ー マ ウ イ ル ス の 免 疫 応 答 を 再 現 で き て い る 。 本 研 究 は ， マ ウ ス よ り 大 型 で あ り ， 実 験 動 物 と し て の 遺 伝 学 的 な 統 御 に よ り 均 質 な 遺 伝 的 要 件 を 備 え ， 動 物 実 験 に 必 要 な 再 現 性 を 担 保 し て い る ラ ッ ト と ウ サ ギ に 着 目 し ， そ れ ら 動 物 の マ ウ ス と の 生 殖 学 的 ， 発 生 学 的 相 違 を 基 礎 と し た 遺 伝 子 改 変 技 術 の 確 立 を 行 う こ と ， お よ び そ れ ら 技 術 を 用 い て ， バ イ オ リ ソ ー ス と し て 有 用 な 動 物 の 作 出 を 行 う こ と を 目 的 と し て ， 以 下 5 つ の 実 験 を 行 っ た 。 第 一 章 で は ， 臓 器 移 植 研 究 に お い て 外 科 的 手 術 の 容 易 な 大 型 の 細 胞 標 識 遺 伝 子 改 変 動 物 の 開 発 を 目 的 と し て ，前 核 期 受 精 卵 の 前 核 内 へ の DNA 顕 微 注 入（ 前

4 核 期 注 入 法 ）に よ っ て CAG/EGFP 遺 伝 子 断 片 を 導 入 し ，紫 外 線 の 励 起 光 の 照 射 に よ り 全 身 が 蛍 光 発 光 す る Tg ウ サ ギ 系 統 樹 立 に 取 り 組 ん だ 。 第 二 章 で は ，in vitro の 発 生 ・ 再 生 研 究 に お い て ， 細 胞 の 持 つ 機 能 を 残 し た ま ま 細 胞 を 不 死 化 （ 株 化 ） す る こ と を 可 能 と す る 実 験 モ デ ル の 開 発 を 目 的 と し て ，前 核 期 注 入 法 に よ っ て 温 度 感 受 性 SV40 ラ ー ジ T 抗 原 遺 伝 子 を 導 入 し ， 温 度 感 受 性 細 胞 増 殖 を 示 す Tg ラ ッ ト 系 統 樹 立 に 取 り 組 ん だ 。 第 三 章 で は ， 導 入 遺 伝 子 の 発 現 が 宿 主 染 色 体 の 導 入 位 置 に 影 響 を 受 け ず ，

発 現 の 安 定 化 が 期 待 で き る 長 鎖 DNA [Yeast Artificial Chromosome（ YAC）

/Bacterial Artificial Chromosome（ BAC） ] を 前 核 期 注 入 法 に よ っ て 導 入 す

る 際 に 問 題 視 さ れ る 長 鎖 DNA の 断 片 化 に つ い て ， 注 入 用 長 鎖 DNA の 精 製 方 法 と 染 色 体 上 に 導 入 さ れ た DNA の 断 片 化 と の 評 価 を 行 っ た 。 第 四 章 で は ，前 核 期 注 入 法 に よ る Tg ラ ッ ト の 作 出 に 対 し て ，凍 結・融 解 し た 前 核 期 受 精 卵 を 使 用 す る 実 験 に 取 り 組 み ，効 率 的 な Tg ラ ッ ト 作 出 法 を 検 討 し た 。 第 五 章 で は ， 新 生 児 期 に 一 過 性 に 発 現 す る 乳 汁 タ ン パ ク 質 プ ロ モ ー タ ー の 発 現 特 性 を 利 用 す る こ と で ， 異 種 た ん ぱ く に 対 し て よ り 免 疫 寛 容 が 成 立 す る と 考 え ，bα S1CN プ ロ モ ー タ ー に よ り ヒ ト 成 長 ホ ル モ ン（ hGH）を 産 生 す る Tg ラ ッ ト を 用 い て ， ラ ッ ト に と っ て 異 種 タ ン パ ク と な る hGH に 対 す る 免 疫 寛 容 成 立 を 検 証 し た 。

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第 一 章 CAG/EGFP Tg ウ サ ギ 系 統 の 作 出

序 論

GFP（ Green Fluorescent Protein ） は オ ワ ン ク ラ ゲ (Aequorea victoria) が 有 す る 緑 色 蛍 光 タ ン パ ク 質 で ， 細 胞 ， 組 織 ， 臓 器 を 染 色 す る こ と な く 容 易 に 識 別 で き る こ と か ら 蛍 光 マ ー カ ー と し て 研 究 に 幅 広 く 活 用 さ れ て い る 。 ま た ， 特 異 の 波 長 の 光 （ 励 起 光 ） を 照 射 す る の み で 蛍 光 発 光 す る 特 性 を 有 し て い る た め ， 補 助 因 子 や 基 質 な ど を 必 要 と せ ず ， リ ア ル タ イ ム に か つ 非 侵 襲 的 に 遺 伝 子 発 現 の 検 出 や 細 胞 の 動 態 を 観 察 で き る こ と か ら ，in vivo イ メ ー ジ ン グ の レ ポ ー タ ー と し て 多 用 さ れ て い る 。全 身 的 に あ る い は 組 織 特 異 的 に GFP を 発 現 さ せ た 遺 伝 子 改 変 動 物 種 と し て ，マ ウ ス（ 17，91，130），ラ ッ ト（ 40， 63）， ウ サ ギ （ 19， 116）， ブ タ （ 72） さ ら に は マ ー モ セ ッ ト （ 101） な ど が 樹 立 さ れ ， 臓 器 移 植 研 究 や 幹 細 胞 治 療 や 再 生 医 療 研 究 な ど 様 々 な 先 端 研 究 領 域 に 活 用 さ れ つ つ あ る 。 と く に ， 臓 器 移 植 研 究 領 域 に お い て は ， ヒ ト 臨 床 へ の 橋 渡 し 研 究 を 目 的 と し て マ ウ ス よ り も 大 き い サ イ ズ の 実 験 モ デ ル が 望 ま れ て い る 。 す な わ ち ， 臓 器 を 受 け 入 れ る レ シ ピ エ ン ト に ド ナ ー の 臓 器 を 移 植 す る 際 に は ， 血 管 吻 合 等 の 外 科 的 手 術 が 必 要 と な る が ， 体 サ イ ズ の 小 さ い マ ウ ス で は こ れ が 極 め て 困 難 で あ る 。 ま た ， ド ナ ー と レ シ ピ エ ン ト の 臓 器 を in vivo イ メ ー ジ ン グ に よ っ て 容 易 に 識 別 す る に は ， GFP を 全 身 性 に 発 現 し ， 様 々 な ド ナ ー 臓 器 が 標 識 さ れ て い る 遺 伝 子 改 変 動 物 が 求 め ら れ て き た 。

EGFP（ Enhanced Green Fluorescent Protein）を 全 身 性 に 発 現 す る CAG/EGFP

6 113）。 し か し ， ラ ッ ト と い え ど も 外 的 科 手 術 に は 顕 微 鏡 下 で の 繊 細 で 高 度 な 技 術 を ， 時 間 を か け て 習 得 す る 必 要 が あ る こ と か ら ， 研 究 者 に 幅 広 く 活 用 さ れ る 動 物 実 験 モ デ ル と は 言 い 難 く ， 橋 渡 し 研 究 の た め に は ， さ ら に 体 サ イ ズ の 大 き い 動 物 種 で の 遺 伝 子 改 変 動 物 が 望 ま れ て い た 。 ウ サ ギ は 中 型 の 実 験 動 物 と し て ， 日 本 国 内 で は 非 げ っ 歯 類 で 最 も 多 く 使 用 さ れ て い る 。 日 本 白 色 種 (Japanese White) や ニ ュ ー ジ ー ラ ン ド ･ホ ワ イ ト 種

（ New Zealand White） な ど は ， ブ リ ー ダ ー に よ っ て ク ロ ー ズ ド コ ロ ニ ー の 繁

殖 方 法 に よ り 遺 伝 学 的 な 均 質 性 を 担 保 す る 生 産 体 制 が 整 備 さ れ ， Specific Pathogen Free(SPF)の 環 境 下 で 生 産 さ れ ， だ れ で も 均 一 な 動 物 を 購 入 可 能 で あ る 。 さ ら に は 「 実 験 動 物 の 飼 養 及 び 保 管 等 に 関 す る 規 準 」 の ガ イ ド ラ イ ン に よ り ， ケ ー ジ サ イ ズ や 飼 育 環 境 条 件 も 統 一 ， 整 備 さ れ て い る 。 こ の こ と か ら ， 家 畜 あ る い は 他 の 中 型 実 験 動 物 に は な い 実 験 動 物 と し て の 主 要 要 件 で あ る 遺 伝 学 的 な 統 御 ， 微 生 物 学 的 な 統 御 お よ び 飼 育 環 境 統 御 を 満 た し て い る 。 さ ら に ウ サ ギ に 関 す る 臓 器 移 植 や 細 胞 治 療 研 究 に つ い て は ， 肺 （ 128）， 心 臓 （ 34），骨（ 67，74，90），肝 臓 細 胞（ 7）を 対 象 と し た 報 告 が な さ れ て い る こ と か ら ， 動 物 種 と し て ウ サ ギ を 選 択 す る に 至 っ た 。 一 方 で ， 過 去 の GFP 使 用 し た Tg ウ サ ギ の 論 文 は（ 16，19，116），ク ロ ー ン 動 物 の セ レ ク シ ョ ン マ ー カ ー や 遺 伝 子 発 現 の レ ポ ー タ ー な ど が 目 的 で 利 用 さ れ て お り ，in vivo イ メ ー ジ ン グ の た め の 全 身 性 発 現 の 系 統 樹 立 と は 研 究 目 的 が 異 な っ て い る 。 ま た ， フ ァ イ バ ー 共 焦 点 顕 微 鏡 (FCFM) を 用 い た 観 察 で 細 部 組 織 構 造 や 細 胞 形 態 を GFP で 可 視 化 す る こ と に 成 功 し て い る が （ 4）， 胎 子 ― 胎 盤 に 限 局 し た 観 察 で あ り ， 様 々 な 臓 器 で の 発 現 特 性 に つ い て は 検 討 さ れ て は い な い 。 す な わ ち ， こ れ ま で 臓 器 移 植 研 究 に 有 効 な GFP を 全 身 性 に 発 現 さ せ た Tg ウ サ ギ は 調 査 の 限 り 存 在 し な い 。 そ こ で 本 研 究 で は 臓 器 移 植 研 究 領 域 の CAG/EGFP ラ ッ ト に 次 ぐ 実 験 モ デ ル

7 動 物 と し て ，CAG/EGFP 遺 伝 子 を 用 い て 全 身 性 に EGFP を 発 現 す る Tg ウ サ ギ の 系 統 樹 立 を 試 み た 。 材 料 及 び 方 法 ウ サ ギ 前 核 期 受 精 卵 の 採 卵 本 実 験 は ，実 施 場 所 で あ る 北 山 ラ ベ ス（ 株 ）（ 現 オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業（ 株 ）， 長 野 県 ） の 組 換 え DNA 実 験 安 全 指 針 お よ び 動 物 実 験 委 員 会 の ガ イ ド ラ イ ン を 遵 守 し て 行 な っ た 。 バ リ ア 環 境 下 の SPF グ レ ー ド で 飼 育 生 産 さ れ た 日 本 白 色 種 雌 ウ サ ギ （ Kbs:JW， 体 重 3～ 4kg） を 使 用 し た 。 飼 育 環 境 は 20±3℃ ， 60±15％ ， 12 時 間 の 明 期 周 期 で ， 固 形 ウ サ ギ 飼 料 （ LRC4， ウ サ ギ ・ モ ル モ ッ ト 飼 育 繁 殖 用 ， オ リ エ ン タ ル 酵 母 工 業 （ 株 ） , 東 京 都 板 橋 区 ） と 濾 過 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。 過 剰 排 卵 処 理 は 10％ PVP (ポ リ ビ ニ ー ル ピ ロ リ ド ン , K90, 和 光 純 薬 , 東 京 都 中 央 区 )(43)あ る い は ア ル ミ ニ ウ ム ゲ ル (1.6 ま た は 3.2 mg ア ル ミ ニ ウ ム )（ 44） に 溶 解 し た FSH（ 卵 胞 刺 激 ホ ル モ ン ，ア ン ト リ ン R，現 ・ 共 立 製 薬（ 株 ）, 東 京 都 千 代 田 区 ） を 皮 下 に 3 AU 単 回 投 与 し ，72 時 間 後 に hCG（ ヒ ト 絨 毛 性 性 腺 刺 激 ホ ル モ ン , ゴ ナ ト ロ ピ ン 1000, 現 ・ あ す か 製 薬 （ 株 ） , 東 京 都 港 区 ） を 75 IU あ る い は 150 IU を 耳 静 脈 投 与 し ， 同 系 雄 ウ サ ギ と 交 配 さ せ た 。 徐 放 剤 と し て 用 い た ア ル ミ ニ ウ ム ゲ ル は AlCl3に NaOH 水 溶 液 を 加 え る こ と で 作 製 し た（ 44)。hCG 投 与 後 16～ 18 時 間 後 に ，10％ ウ シ 胎 子 血 清（ FBS，EquitechBio

Inc., Kerrville, Texas, USA） を 添 加 し た TCM199（ GIBCO®, Thermo Fisher

Scientific,Waltham, Massachusetts, USA） 培 地 を 用 い ， 卵 管 灌 流 し て 前 核

期 受 精 卵 受 精 卵 を 採 取 し た 。回 収 し た 前 核 期 受 精 卵 は 同 培 地 に て 38.5℃ ，5％

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Tg ウ サ ギ の 作 出

Tg ウ サ ギ 作 出 の た め に 用 い た 導 入 遺 伝 子 CAG/EGFP は ， CAG ベ ク タ ー

（ cytomegalovirus enhancer と chicken β -actin promoter を つ な げ た 構 造

に ，ウ サ ギ の β -グ ロ ビ ン 遺 伝 子 の polyA signal が 付 加 さ れ た 発 現 ベ ク タ ー ）

に よ っ て ，導 入 し た EGFP 遺 伝 子 を ほ ぼ 全 身 性 に 過 剰 発 現 さ せ る こ と が で き る

構 築 で あ り ，本 研 究 で は Tg ラ ッ ト（ 40）で 用 い ら れ た 同 一 の 遺 伝 子 構 築 を 使

用 し た 。 す な わ ち ， pEGFP ベ ク タ ー （ #6077-1, Clontech Laboratories Inc.,

Mountain View, CA, USA） を Eco RI 制 限 酵 素 切 断 後 ， EGFP 遺 伝 子 を 含 む Eco

RI 断 片 （ 3.0kb） を 精 製 し ， pCXN2（ 84） ベ ク タ ー の ク ロ ー ニ ン グ サ イ ト へ

Eco RI リ ン カ ー を 使 っ て 導 入 し た 。 制 限 酵 素 切 断 （ Sal I-Pst I） に よ り プ

ラ ス ミ ド ベ ク タ ー 部 分 を 除 去 し た 直 鎖 DNA を 5 ng/µl の 濃 度 と な る よ う に

TE0.1（ 10mM Tris-HC (pH7.6), 0.1mM EDTA-2Na） に て 調 整 し た 。 顕 微 鏡 （ ノ

マ ル ス キ ー 微 分 干 渉 装 置 付 倒 立 顕 微 鏡 ，TMD300, ニ コ ン , 東 京 都 港 区 ）に マ イ ク ロ マ ニ ュ ピ ュ レ ー タ ー （ MO102， MO103, ナ リ シ ゲ , 東 京 都 世 田 谷 区 ） を 装 着 し ， 200 倍 の 倍 率 下 で ウ サ ギ 前 核 期 受 精 卵 の 雄 性 前 核 内 に 微 細 ガ ラ ス ピ ペ ッ ト を 用 い て 前 核 が 完 全 に 膨 化 す る ま で DNA 溶 液 を 注 入 し た 。 レ シ ピ エ ン ト は ， 実 験 前 日 に 同 系 雌 ウ サ ギ に 対 し て 75 IU の hCG を 単 回 投 与 す る こ と で 準 備 し た 。DNA 注 入 後 の 生 存 受 精 卵 を 回 収 し ，静 脈 留 置 カ テ ー テ ル （ 388433,

Becton, Dickinson and Company , Franklin Lakes, NJ, USA） に 実 体 顕 微 鏡

下 で 充 填 し ， 耳 静 脈 麻 酔 下 の レ シ ピ エ ン ト の 卵 管 内 に 外 科 的 に 移 植 し た 。 出

産 は 自 然 分 娩 さ せ た 。

Tg の 選 抜

Tg ウ サ ギ の 選 抜 は お よ び 導 入 コ ピ ー 数 は サ ザ ン 法 に て 判 定 し た 。死 産 産 子 ，

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サ ン プ ル と し て 採 取 し ，使 用 ま で デ ィ ー プ フ リ ー ザ ー（ -80℃ ）内 に 保 管 し た 。

サ ン プ ル か ら の ゲ ノ ム DNA 抽 出 は 蛋 白 分 解 酵 素 （ Proteinase K お よ び

Actinase E） に よ り 組 織 を 溶 解 し ， RNA 分 解 酵 素 処 理 後 に ク ロ ロ フ ォ ル ム 処

理 で 除 蛋 白 を 行 い ， エ タ ノ ー ル 沈 殿 に て ヒ モ 状 の 高 分 子 ゲ ノ ム DNA を 回 収 し

た 。ゲ ノ ム DNA を 制 限 酵 素 Eco RI で 切 断 後 に ア ガ ロ ー ス ゲ ル 上 で 電 気 泳 動 し ，

泳 動 後 ，ナ イ ロ ン メ ン ブ レ ン（ Hybond-N+）へ 転 写 し ，サ ザ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ

を 行 っ た 。プ ロ ー ブ CAG/EGFP の Nco I-Not I 断 片 を 用 い ，放 射 性 同 位 元 素 3 2_P

dCTP を ラ ン ダ ム プ ラ イ ム 法 に て ラ ベ ル を 行 っ た 。コ ン ト ロ ー ル と し て 野 生 型

ウ サ ギ（ Kbs:JW）の ゲ ノ ム DNA を 用 い て 1,5,10,20,50 お よ び 100 コ ピ ー の 数

濃 度 標 準 を 作 製 し ， オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー に よ る X 線 フ ィ ル ム を デ ン シ ト

メ ー タ ー （ Model GS-670, Bio-Rad, Hercules, CA, USA） を 用 い て 数 値 化 し ，

濃 度 標 準 曲 線 よ り 各 Tg ラ イ ン の 導 入 コ ピ ー 数 を 算 出 し た 。 Tg ウ サ ギ の 繁 殖 継 代 フ ァ ウ ン ダ ー Tg ウ サ ギ の 繁 殖 は 人 工 授 精 （ 68） で 行 っ た 。 す な わ ち ， 雄 ウ サ ギ か ら 人 工 膣（ 手 製 ，45-50℃ 温 水 ）を 用 い て 射 出 精 子 を 採 取 し た 。射 出 精 子 は ，リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水 に て 10 倍 希 釈 し ，そ の 精 子 懸 濁 液 0.5ml を ガ ラ ス ピ ペ ッ ト （ 手 製 ， 外 径 6mm， 内 径 4mm， 長 さ 30cm， 先 端 4cm を 曲 げ る ） を 使 っ て 膣 よ り 挿 入 し 注 入 し た 。 人 工 膣 と ガ ラ ス ピ ペ ッ ト は Fig. 1-１ に 示 し た 。 Tg ウ サ ギ の 発 現 確 認 EGFP の 蛍 光 発 光 の 確 認 は F1 世 代 8 匹 の 中 か ら 無 作 為 に 選 抜 し た 雄 1 匹 と 雌 1 匹 を 用 い て 行 っ た 。対 照 動 物 と し て 野 生 型 の Kbs:JW を 用 い た 。外 貌 観 察 は 暗 室 に て UV 照 射 を 行 い ，画 像 を 撮 影 し た 。安 楽 死 後 に 各 臓 器 を 摘 出 し ，蛍

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光 実 体 顕 微 鏡 （ 489-nm ， MZFL III, Leica, Leica Microsystems K.K.

Takadanobaba, Tokyo）を 用 い て 蛍 光 発 光 の 確 認 を 行 っ た 。ま た ， そ れ ら 臓 器

を IVIS® Imaging System（ Xenogen, Alameda,CA, USA） を 用 い て 測 定 し ， 蛍

光 量 の 数 値 化 を 行 っ た 。 骨 髄 お よ び 末 梢 血 の 細 胞 解 析 は フ ロ ー サ イ ト メ ー タ

ー （ FACS Calibur; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA） を 用 い て

実 施 し た 。 肝 臓 に つ い て は ， 凍 結 切 片 を 作 製 し ， 蛍 光 顕 微 鏡 に よ る 撮 像 を 行

っ た 。 脾 臓 に つ い て は 撮 像 後 た だ ち に Fluorescence In Situ Hybridization

(FISH)解 析 の た め に RPMI1640 培 地 に 浸 漬 し ，財 団 法 人 実 験 動 物 中 央 研 究 所 へ 発 送 し た 。 Tg ウ サ ギ の FISH 解 析 CAG/EGFP が 導 入 さ れ た 染 色 体 導 入 部 位 の 同 定 は ，財 団 法 人 実 験 動 物 中 央 研 究 所 ICLAS モ ニ タ リ ン グ セ ン タ ー に 依 頼 し て ，脾 臓 細 胞 を 用 い て FISH 解 析 に よ り 行 っ た (119)。 す な わ ち ， ス ラ イ ド グ ラ ス の フ ロ ス ト 部 分 2 枚 に 脾 臓 を 挟 み つ け ， し ご い て 細 胞 を 単 離 後 ， 血 球 を 回 収 し ， 細 胞 数 0.2 〜 0.5×106 cell/ml で 総 量 50ml と な る よ う に 調 節 し ，フ ラ ス コ で 37℃ CO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で 培 養 を 開 始 し た 。44〜 45 時 間 ，コ ン フ ル エ ン ト に 満 た な い 場 合 は 62 〜 63 時 間 後 に コ ル セ ミ ド (Sigma, D-7385)を 100 µl（ 最 終 濃 度 0.02 µg/ml） を 加 え て ，30 分 放 置 処 理 を 行 い 細 胞 分 裂 を M 期 で 停 止 さ せ ， 染 色 体 標 本 を 作 製 し た 。 EGFP プ ロ ー ブ は biotin-16-dUTP で ラ ベ ル し た 。 染 色 体 標 本 は 70% ホ ル ム ア ミ ド に よ る 二 本 鎖 DNA の 変 性 後 に ビ オ チ ン 標 識 プ ロ ー ブ と の ハ イ ブ

リ ダ イ ゼ ー シ ョ ン を お こ な っ た 。CAG/EGFP の 同 定 に は Avidin-FITC (A-2001，

Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA)を 用 い た 。 染 色 体 の 同 定 は QH

バ ン ド 染 色 法 (Hoechst33258 と Quinacrine mustard の 二 重 染 色 )を 用 い た 。

11 （ 45） に 従 っ て 決 定 し た 。 結 果 Tg フ ァ ウ ン ダ ー ウ サ ギ の 作 出 70 匹 の ド ナ ー ウ サ ギ よ り 回 収 し た 945 個 の 前 核 期 受 精 卵 に CAG/EGFP の DNA 断 片 を 注 入 し ， 注 入 後 に 正 常 な 形 態 を 保 っ て 生 存 し た と 考 え ら れ る 867 個 の 受 精 卵 を 34 匹 の レ シ ピ エ ン ト に 移 植 し た 。う ち 21 匹 が 出 産 し ，81 匹 の 産 子 が 得 ら れ た 。そ の う ち 7 匹 が サ ザ ン 法 に よ り Tg で あ る こ と が 確 認 さ れ た 。注 入 処 理 受 精 卵 当 た り 0.74％（ 7/945）の 効 率 で Tg 産 子 を 作 出 す こ と が で き た （ Table 1-1）。 し か し ， 7 匹 の う ち 3 匹 に つ い て は 出 産 確 認 時 に 死 亡 し て 発 見 さ れ た 。 哺 育 を 確 認 し た 4 匹 の う ち ， 2 匹 は 可 視 光 の 室 内 で も 毛 や 目 が 緑 色 を 呈 し 容 易 に 識 別 で き る ほ ど 強 発 現 で あ り ， 繁 殖 に 至 る 以 前 に 死 亡 し た 。 繁 殖 に 至 っ た 2 匹 に つ い て は ， 1 匹 は 可 視 光 の 室 内 に お い て 僅 か に 緑 色 を 呈 し た が ，産 子 を 得 る こ と が で き ず 不 妊 と 考 え ら れ た 。最 終 的 に 1 匹 の Tg 雄 ウ サ ギ （ ラ イ ン 番 号 ： #GFP-1） が F1 世 代 に 導 入 遺 伝 子 を 伝 え る こ と が で き 系 統 化 で き た 。 CAG/EGFP の Tg 系 統 樹 立 に 関 す る 最 終 的 な 作 出 効 率 は 注 入 処 理 受 精 卵 945 個 か ら 1 系 統 （ 0.11％ ） と な っ た （ Table 1-2）。 Tg ウ サ ギ 系 統 樹 立 #GFP-1 フ ァ ウ ン ダ ー Tg ウ サ ギ の 精 子 を 使 っ た 人 工 授 精 に よ る F1 世 代 へ の 継 代 繁 殖 で ，42 匹 の 産 子 を 得 る こ と が で き た 。し か し ，サ ザ ン 法 に よ り そ れ ら 産 子 へ の CAG/EGFP の 伝 達 を 調 べ た 結 果 ， メ ン デ ル 遺 伝 の 期 待 値 50％ を 大 き く 下 ま わ り CAG/EGFP 陽 性 ウ サ ギ は 8 匹 に す ぎ な か っ た （ 19％ ）。 次 世 代 へ の 伝 達 を 確 認 で き た こ と か ら ，F2 世 代 の 産 子 取 得 を 進 め つ つ ，導 入 染 色 体 部 位 の 同 定 と 発 現 解 析 を 行 っ た 。 F2 世 代 へ の 継 代 は ， #GFP-1-4（ F1 世 代 の 雄

12 Tg ウ サ ギ ）を 用 い た 人 工 授 精 に よ る 継 代 繁 殖 を 実 施 し た 。そ の 結 果 ，39 匹 の 産 子 が 得 ら れ ， う ち 19 匹 が CAG/EGFP を 伝 達 し た 。 F2 世 代 へ の 伝 達 は 49%で メ ン デ ル 遺 伝 の 期 待 値 50％ に 近 似 し た 。 サ ザ ン 解 析 の 結 果 ， F１ 産 子 8 匹 ， F2 産 子 19 匹 ， す べ て の オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー の シ グ ナ ル 強 度 は 均 一 で あ っ た こ と か ら ， 染 色 体 上 の 1 か 所 に CAG/EGFP が 導 入 さ れ い る と 推 察 し た 。 Tg ウ サ ギ の EGFP 発 現 確 認 CAG/EGFP を 伝 達 し た 8 匹 の F1 ウ サ ギ か ら ，Tg 雄 １ 匹 と Tg 雌 １ 匹 を 無 作 為 に 選 抜 し て ， 臓 器 及 び 血 液 を 採 取 し て 蛍 光 顕 微 鏡 に よ る 観 察 を 行 っ た 。 そ の 結 果 ， 蛍 光 発 光 レ ベ ル に は 臓 器 間 で 若 干 の 強 弱 は あ る も の の ， CAG プ ロ モ ー タ ー で 期 待 さ れ る 全 身 性 の EGFP の 蛍 光 発 光 を 確 認 す る こ と が で き た （ Fig. 1-2a～ c）。IVIS の 解 析 で は ，蛍 光 発 光 強 度 を 数 値 化 す る こ と が で き ，測 定 し た 全 臓 器 で 対 照 の 野 生 型 ウ サ ギ 臓 器 よ り も 高 い 数 値 が 得 ら れ た （ Fig. 1-4）。 ま た ， 血 液 塗 抹 標 本 で 有 核 細 胞 の 白 血 球 の 蛍 光 発 光 が 確 認 で き （ Fig. 1-3）， さ ら に 骨 髄 お よ び 末 梢 血 リ ン パ 球 の FACS 解 析 で EGFP の ピ ー ク を 確 認 し た （ Fig. 1-5）。肝 臓 を 用 い た 組 織 切 片 の 解 析 で も 均 一 な 蛍 光 発 光 を 確 認 す る こ と が で き た （ Fig. 1-6）。 Tg ウ サ ギ の FISH 解 析 CAG/EGFP の 染 色 体 上 の 導 入 位 置 を 確 認 す る た め 脾 臓 細 胞 を 用 い た FISH 解 析 を 行 っ た 結 果 ， Tg 雄 お よ び Tg 雌 と も に 7 番 染 色 体 の 長 腕 (7q11)に ， 導 入 遺 伝 子 の シ グ ナ ル を ヘ ミ 接 合 体 と し て 確 認 す る こ と が で き た （ Fig. 1-7）。 考 察

13 Tg ウ サ ギ 系 統 樹 立 我 々 の 過 去 の Tg ウ サ ギ 作 出 実 験 に お け る 作 出 効 率 は ，bα S1casein/hGH 遺 伝 子 を 用 い た 場 合 ， 注 入 処 理 受 精 卵 当 た り 0.8 ％ で あ っ た （ 52 ）。 今 回 の CAG/EGFP の 注 入 で 得 ら れ た Tg 産 子 の 作 出 効 率 は 0.74％ と bα S1casein/hGH の 効 率 と 近 似 で あ っ た 。本 実 験 で 精 製 し た CAG/EGFP 溶 液 は ，精 製 度 確 認 の た め ， マ ウ ス と ラ ッ ト 前 核 期 受 精 卵 へ へ マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し た が ， Tg マ ウ ス 産 子 で 2.1 ％ （ 4/192 ）， Tg 産 子 ラ ッ ト が 3.2 ％ （ 3/95 ） で あ っ た （ unpublished data）こ と か ら ， 明 ら か に Tg ウ サ ギ の 作 出 効 率 は 低 く ， 数 匹 の Tg フ ァ ウ ン ダ ー を 得 る た め に は マ ウ ス ， ラ ッ ト の 2～ 3 倍 の 前 核 期 受 精 卵 数 を 用 い た 注 入 実 験 を 実 施 す る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。 ま た ， ウ サ ギ 受 精 卵 に 対 し て 顕 微 操 作 を 行 っ た 場 合 に は ， 出 生 直 後 の 産 子 死 亡 が 増 加 す る こ と が 過 去 に 指 摘 さ れ て い る（ 26，28）。今 回 の 結 果 で も 81 匹 中 20 匹 の 産 子 が 分 娩 発 見 時 に 死 亡 し て お り ，う ち 3 匹 が Tg で あ っ た 。マ ウ ス や ラ ッ ト で は ，出 生 時 死 亡 を 避 け る た め 帝 王 切 開 で 産 子 を 摘 出 し ， 里 親 を 使 用 し て 哺 育 さ せ る 手 段 が 選 ば れ る が ， 今 後 ウ サ ギ に お い て も 帝 王 切 開 術 や 里 子 操 作 の 技 術 開 発 に よ っ て ， 初 期 死 亡 を 抑 え る こ と が 必 要 と 思 わ れ る 。 ま た ， 今 回 の 実 験 で 繁 殖 を 開 始 す る 前 の 死 亡 や 不 妊 に よ り 系 統 化 で き な か っ た 3 匹 は ，全 て 可 視 光 で EGFP 発 現 が 判 定 で き る ほ ど の 強 発 現 で あ っ た 。こ の よ う な 強 発 現 と 離 乳 前 の 産 子 死 亡 は マ ウ ス や ラ ッ ト で あ ま り 見 ら れ な い 。 全 身 性 発 現 の 特 性 を 有 す る CAG プ ロ モ ー タ ー は 特 に 筋 肉 系 の 細 胞 に 蛍 光 発 光 が 強 く ， 瞬 発 力 に 優 れ ， 筋 肉 が 発 達 し て ウ サ ギ で は ， マ ウ ス や ラ ッ ト よ り も 強 発 現 と な る の か も し れ な い 。 今 後 in vivo イ メ ー ジ ン グ の た め に 新 た な 蛍 光 マ ー カ ー を 有 す る ウ サ ギ 系 統 を 作 出 す る 場 合 に は ， CAG プ ロ モ ー タ ー の 使 用 を 見 直 し ， 別 の 全 身 性 発 現 の 特 性 を 有 す る Rosa26 遺 伝 子 （ 69） の プ ロ モ ー タ ー へ の 変 更 ， あ る い は よ り 生 体 へ の 影 響 の 低 い 蛍 光 マ ー カ ー を 選 択 す る

14 な ど の 改 善 が 必 要 か も し れ な い 。 遺 伝 子 を 次 世 代 産 子 に 伝 え る こ と が で き た フ ァ ウ ン ダ ー Tg ウ サ ギ （ #GFP-1） は ， 可 視 光 で EGFP 発 現 は 確 認 さ れ な か っ た 。 F1 へ の 伝 達 率 は 12％ （ 5/42） で あ り ， F1 世 代 (#GFP-1-4)で は 49％ （ 19/39） 匹 に 改 善 し た こ と か ら ， 得 ら れ た Tg フ ァ ウ ン ダ ー は CAG/EGFP が モ ザ イ ク で 導 入 さ れ ， Tg 細 胞 と Non-Tg 細 胞 が 混 在 す る こ と が F1 へ の 伝 達 率 が 低 い 原 因 と 考 え ら れ る 。 し か し ， F2 世 代 以 降 は メ ン デ ル 遺 伝 の 期 待 値 50％ に 近 似 で 安 定 的 な 継 代 が で き て お り ， サ ザ ン 解 析 の シ グ ナ ル 強 度 は 均 一 で あ り ，出 産 時 の UV 照 射 に よ る 外 観 観 察 で も い ず れ の 産 子 も 同 等 の 蛍 光 発 光 が 確 認 で き た 。 ま た 導 入 遺 伝 子 の 染 色 体 位 置 に 関 し て は ，F1 世 代 の 雄 1 匹 と 雌 1 匹 と も に 7 番 染 色 体 に ト ラ ン ス ジ ー ン を 確 認 し た 。 以 上 の 結 果 か ら ， 7 番 染 色 体 の 長 腕 (7q11) に CAG/EGFP 遺 伝 子 が 導 入 さ れ ， 安 定 的 に EGFP を 蛍 光 発 光 す る Tg ヘ テ ロ ウ サ ギ 系 統 の 樹 立 に 成 功 す る こ と が で き た 。 Tg ウ サ ギ の 発 現 解 析 本 章 で 作 出 さ れ た CAG/EGFP ウ サ ギ 系 統 は 臓 器 に よ り 蛍 光 発 光 の 程 度 に 強 弱 は あ る が ， 発 現 分 布 は 岡 部 ら の マ ウ ス （ 91） や ， 袴 田 ら の ラ ッ ト （ 40） の 報 告 と 一 致 し ， 全 身 性 の 発 現 を 確 認 す る こ と が で き た 。 Tg 雄 と Tg 雌 間 の 蛍 光 発 光 の 比 較 で は 蛍 光 顕 微 鏡 観 察 お よ び IVIS の 解 析 か ら 性 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 ま た IVIS 解 析 で は ， EGFP 輝 度 の 数 値 化 に よ り 対 照 で あ る 野 生 型 の バ ッ ク グ ラ ウ ン ド と の 明 確 な 差 が 確 認 さ れ ， 臓 器 移 植 実 験 時 の in vivo イ メ ー ジ ン グ に 十 分 適 用 で き る と 判 断 で き た 。 骨 髄 や 末 梢 血 リ ン パ 球 の 蛍 光 発 光 が FACS 解 析 で 識 別 可 能 な こ と か ら ，移 植 臓 器 後 に ホ ス ト に 流 入 す る ド ナ ー リ ン パ 球 の モ ニ タ リ ン グ に も 適 用 可 能 で あ る と 判 断 で き た 。 ま た ， 肝 臓 移 植 の 実 験 モ デ ル を 想 定 し た 組 織 レ ベ ル の 解 析 に お い て も ， 肝 臓 内 部 ま で 均 一 な 蛍

15 光 発 光 が 確 認 で き ，肝 臓 移 植 後 に ド ナ ー 肝 臓 と ホ ス ト 肝 臓 の 経 過 観 察 を IVSI や 肝 臓 エ コ ー 検 査 を 用 い て 診 断 で き る と 判 断 で き た 。 こ れ ら 詳 細 な 発 現 特 性 の 情 報 か ら ， 臓 器 移 植 実 験 に お い て 様 々 な 用 途 へ の 活 用 が 期 待 さ れ る と 考 え ら れ た （ 81）。 遺 伝 子 改 変 ウ サ ギ の 現 状 と 展 望 近 年 ， 脂 質 代 謝 系 の 研 究 で は ヒ ト の ア ポ リ ポ プ ロ テ イ ン C-III (118) や A-II (22)の Tg ウ サ ギ が 新 た な リ ソ ー ス と し て 加 わ り ， 発 生 再 生 研 究 で は Oct4/EGFP(127)の Tg ウ サ ギ が 報 告 さ れ て い る 。作 出 技 術 に 関 す る 報 告 も レ ン チ ウ イ ル を 使 っ て EGFP を 導 入 す る 新 た な 試 み（ 54）や ，プ ロ モ ー タ ー や 別 種 の GFP を 使 っ た 遺 伝 子 構 築（ CMVIE-EGFP，CMVIE-rhGFP，PGK-EGFP 間 で 比 較 ） で Tg 作 出 効 率 を 比 較 す る 報 告（ 20）が な さ れ て い る 。さ ら に は ，ゲ ノ ム 編 集 技 術 に よ っ て ， ノ ッ ク ア ウ ト （ KO） ウ サ ギ の 作 出 が 可 能 と な り 免 疫 系 遺 伝 子 （ 124）， 小 眼 症 モ デ ル （ 129）， チ ロ シ ナ ー ゼ の ア ル ビ ノ 変 異 （ 56） 等 が 報 告 さ れ て い る 。 こ れ ら 状 況 か ら ， 臓 器 移 植 研 究 領 域 に 限 ら ず ， 発 生 学 や 再 生 学 領 域 の 研 究 あ る い は ヒ ト 疾 患 モ デ ル 動 物 の 作 出 に 対 し て ， そ の 動 物 種 の 選 択 肢 と し て Tg/KO ウ サ ギ を 用 い た 実 験 モ デ ル が 有 効 で あ る と 考 え ら れ た 。

16

Figure 1-1. Equipment for artificial insemination

for the rabbit. A: The artificial vagina warmed at

45-50℃ in a water bath before use. Collected sperm was

ten-hold diluted with phosphate buffered saline .B: A

30 cm handmade glass pipette (bent 4 cm at t he tip) for

sperm injection

17

Table 1-1. Production efficiency of CAG/EGFP transgenic rabbit

Number of pronuclear- : Injected 945

stage zygotes : Survived 876

: Transferred 876

Pregnant/Transferred 21/34

Number of pups : Born 81

: Weaned 61

: Integration analyzed 81

Number of transgenic pups＊ 7

18

Table 1-2. Establishment of CAG/EGFP transgenic rabbit line

Number of transgenic rabbit obtained

7

Died before weaning

3

Died before mating

2

Not transmitted to next generation

1

Number of established transgenic rabbit line

1

Overall efficiency of transgenic line (/injected)

0.11%

19

Figure 1-2a. EGFP expression patterns in various tissues. All

images were taken under the same intensity of 489nm excitation

light (left slide) and visible light (right slide).

20

Figure 1-2b. EGFP expression patterns in various tissues. All

images were taken under the same intensity of 489nm excitation

light (left slide) and visible light (right slide).

21

Figure 1-2c. EGFP expression patterns in various tissues. All

images were taken under the same intensity of 489nm excitation

light (left slide) and visible light (right slide).

22

Figure 1-3. Hemogram of peripheral blood in a

CA/EGFP Tg rabbit. Leukocytes but not red blood

cells extremely expressed under 489nm excitation

light. (Original magnification: x200)

23

Figure 1-4. Quantification of excitation light using

in vivo

imaging system (IVIS). A: Luminescent image, B: Digitized data

using image processing software.

24

Figure 1-5. Flow cytometric pattern of bone marrow cells and

peripheral lymphocytes. Green arrow indicates EGFP signals.

25

Figure 1-6. EGFP expression in hepatocytes.

The images were taken under the same intensity

of 489 nm excitation light (left slide) and

visible light after HE staining (right slide).

26

Figure 1-7. FISH analysis of the transgene. The entire CAG/EGFP DNA

fragment was labeled with FITC. The hybridization signal(indicated by

arrow) was detected at 7q11 on a large centormeric chromosome #7. The

27 第 二 章 温 度 感 受 性 SV40 ラ ー ジ T 抗 原 （ SV40 tsA58） Tg ラ ッ ト の 作 出 序 論 in vitro の 実 験 系 で 用 い ら れ る 種 々 の 培 養 細 胞 は ， 元 来 は 体 を 構 成 す る 細 胞 を 起 源 に し て い る 。こ れ ら 体 を 構 成 す る 多 種 多 様 な 細 胞 は ，細 胞 同 士 の 密 接 な 関 係 に よ っ て 組 織 や 器 官 を 形 成 し ，さ ら に は 個 体 を 形 作 っ て い る 。こ の 体 を 構 成 す る 細 胞 を ，本 来 持 つ 細 胞 の 機 能 を そ の ま ま 維 持 し た 状 態 で 培 養 細 胞 （ 機 能 保 持 細 胞 ） と し て 単 離 ， 維 持 す る こ と が で き れ ば ，in vitro の 実 験 系 の 成 果 と ，高 い 精 度 で in vivoへ 外 挿 す る こ と が 期 待 で き る 。医 薬 品 開 発 に お い て は ， ハ イ ス ル ー プ ッ ト ス ク リ ー ニ ン グ と し て in vitro の 実 験 系 が 多 く 採 用 さ れ て い る が ，機 能 保 持 細 胞 を 活 用 す る こ と で ，新 規 化 学 物 質 に 対 す る 有 効 性 や 毒 性 ，安 全 性 に 関 し て よ り 合 理 的 な 評 価 が 可 能 に な る 。発 生 ，再 生 の 基 礎 研 究 領 域 に お い て も ，機 能 性 保 持 細 胞 は 分 化 マ ー カ ー の 検 索 や 共 培 養 に よ る in vitro で の 組 織 ・ 臓 器 の 再 構 築 ， あ る い は 分 化 誘 導 実 験 に 利 用 す る こ と が で き る 。 ま た ， 近 年 の 生 命 科 学 の 実 験 で は ， 動 物 を 使 用 し な い 方 法 に 置 き 換 え る （ Replacement），利 用 す る 動 物 の 数 を 減 ら す（ Reduction），動 物 に 与 え る 苦 痛 を 少 な く す る（ Refinement）と い う 3R の 順 守 が 求 め ら れ て い る 。 動 物 実 験 代 替 法（ 代 替 法 ）と は ，科 学 研 究 や 教 育 ，毒 性 試 験 や 生 産 等 の 目 的 の た め に 動 物 個 体 を 用 い る 方 法 を ， 動 物 個 体 を 用 い な い 方 法 に 置 き 換 え る こ と （ Replacement）で あ り ，動 物 使 用 数 の 削 減（ Reduction）を も 含 む も の で（ 100）， で あ る 。こ れ ら の 時 代 背 景 を 元 に ，動 物 実 験 代 替 法 の 見 地 か ら 機 能 保 持 細 胞 株 樹 立 の 取 り 組 み は 極 め て 重 要 な 課 題 で あ る 。

28 し か し な が ら ，生 体 内 に 存 在 す る 本 来 の 機 能 を 保 持 し た 細 胞 を 株 化 細 胞 と し て 培 養 ，維 持 す る こ と は 技 術 的 に 大 変 難 し い と さ れ て い る（ 46）。一 般 に ， 生 体 組 織 か ら 採 取 し た 初 代 細 胞 は 最 初 の 植 え 継 ぎ 段 階 で は よ く 増 殖 す る が ， 継 代 と と も に 次 第 に 増 殖 を 失 い ，や が て は 細 胞 老 化 に よ っ て 増 殖 を 停 止 し て 死 滅 し て し ま う 。 ご く 一 部 の 細 胞 は こ の 細 胞 老 化 を 免 れ て 増 殖 を 続 け る が ， そ れ ら は 本 来 保 有 し て い た 形 態 あ る い は 機 能 の 一 部 ま た は す べ て を 継 代 と と も に 失 っ て し ま っ た 細 胞 の 集 団 に な っ て し ま う 。一 方 ，人 為 的 な 不 死 化 遺 伝 子 の 導 入 に よ っ て 通 常 の 細 胞 老 化 を 回 避 し ，連 続 的 な 細 胞 分 裂 能 力 を 獲 得 し た 株 化 細 胞 は ，本 来 の 分 化 形 質 を 維 持 で き る こ と か ら 機 能 保 持 細 胞 株 の 樹 立 が 可 能 と な る 。不 死 化 の 方 法 と し て は ，組 織 か ら 取 り 出 し た 初 代 正 常 細 胞 に in vitro で 不 死 化 遺 伝 子 を 導 入 す る 方 法 が あ る 。 し か し ， 細 胞 に よ っ て は 初 代 培 養 か ら 不 死 化 ま で の 間 に 機 能 の 一 部 を 欠 落 し て し ま う 。こ の こ と か ら ，不 死 化 遺 伝 子 を 染 色 体 の 一 部 に 安 定 的 に 組 み 込 ん だ 遺 伝 子 改 変 マ ウ ス を 作 出 し ，個 体 発 生 途 上 の 任 意 の 段 階 で 効 率 よ く 細 胞 株 を 樹 立 す る 手 法 が 採 用 さ れ て い る （ 66, 125）。 こ れ ら Tg マ ウ ス で 不 死 化 遺 伝 子 と し て 用 い ら れ る SV40 温 度 感 受 性 変 異 株 ラ ー ジ T 抗 原 は ，p53 と ヘ テ ロ ダ イ マ ー を 形 成 し p53 の 不 活 化 に よ る 不 死 化 誘 導 の メ カ ニ ズ ム を 有 す る が ， 温 度 感 受 性 変 異 株 （ tsA58）は 37℃ で は ラ ー ジ T 抗 原 タ ン パ ク の 構 造 が 変 化 し 不 活 化 の 状 態 に あ る 。従 っ て ，原 理 的 に ラ ー ジ T 抗 原 は マ ウ ス 生 体 に 対 し て は 無 影 響 で あ る 。 し か し ， 本 マ ウ ス よ り 採 取 し た 細 胞 を 33℃ で 培 養 す る こ と で ， ラ ー ジ T 抗 原 タ ン パ ク の 構 造 が 回 復 し ， 不 死 化 遺 伝 子 と し て 活 性 化 さ れ る （ 65, 79）。 こ の マ ウ ス を 用 い る こ と で ，様 々 な 不 死 化 細 胞 株 が 樹 立 で き る こ と が 報 告 さ れ て い る (86, 87) 。し か し な が ら ，胎 生 期 の 脳 血 液 関 門 な ど ，マ ウ ス の 体 サ イ ズ が 小 さ い た め に 組 織 か ら 回 収 で き る 細 胞 数 が 僅 か で 数 個 で あ る た め ， 機 能 保 持 細 胞 株 の 樹 立 に 至 ら な い こ と が 示 唆 さ れ て い た 。

29 ラ ッ ト は ，マ ウ ス に 次 ぐ 遺 伝 学 ，微 生 物 学 的 に 統 御 さ れ た 実 験 動 物 で ，遺 伝 子 改 変 動 物 作 出 の た め の 基 本 的 な 生 殖 工 学 技 術 が 確 立 し て い る 。特 に ，マ ウ ス に 比 べ て 体 サ イ ズ が 10 倍 程 度 あ り ， 生 体 試 料 が 多 く 得 ら れ る と い う 優 位 性 を 有 し て お り ，ま た ，安 全 性 試 験 で の 薬 理 や 生 化 学 の 基 礎 デ ー タ が 豊 富 で あ る 。そ の た め ，不 死 化 ラ ッ ト が 開 発 さ れ れ ば マ ウ ス で は 得 難 い 細 胞 株 樹 立 の た め の 遺 伝 子 改 変 動 物 と し て 期 待 で き る 。そ こ で 本 研 究 で は ，温 度 感 受 性 変 異 tAS58 遺 伝 子 を 導 入 し た Tg ラ ッ ト の 作 出 及 び そ の 系 統 化 を 試 み た 。 材 料 及 び 方 法 ラ ッ ト 前 核 期 受 精 卵 の 採 卵 実 験 は ，実 施 場 所 で あ る ワ イ エ ス ニ ュ ー テ ク ノ ロ ジ ー 研 究 所（ 現 社 名：特 殊 免 疫 研 究 所 ）の 組 換 え DNA 実 験 安 全 指 針 お よ び 動 物 実 験 委 員 会 の ガ イ ド ラ イ ン を 遵 守 し て 行 わ れ た 。日 本 チ ャ ー ル ズ リ バ ー 社（ 神 奈 川 県 横 浜 市 ）に よ り ク ロ ー ズ ド コ ロ ニ ー の Crj:Wistar（ 現 系 統 名 ： Crlj:WI） 雄 8 週 齢 ， 雌 6 週 齢 で 購 入 し ， 2 週 間 の 順 化 期 間 を 経 て 以 降 の 実 験 に 使 用 し た 。 飼 育 環 境 は 23±2℃ ， 55±10％ ， 12 時 間 明 期 （ 04： 00～ 16： 00）， 12 時 間 暗 期 （ 16：

00～ 04： 00） で ， 固 形 試 料 （ Lab Diet 5L65, PMI feed inc., St. Louis, MO,

USA） と 濾 過 滅 菌 水 を 自 由 摂 取 さ せ た 。 雌 ラ ッ ト は 膣 ス メ ア に よ り 性 周 期 を モ ニ タ ー し ，4 日 周 期 の 発 情 周 期 を 示 し た 雌 ラ ッ ト の 発 情 休 止 期 の 9：00 に PMSG（ PMS 全 薬 , 日 本 全 薬 工 業 , 福 島 県 郡 山 市 ）150 IU/Kg を 腹 腔 内 投 与 し ， 48 時 間 後 に hCG（ プ ベ ロ ー ゲ , 三 共 エ ー ル , 東 京 都 品 川 区 ） 75 IU/kg を 腹 腔 内 投 与 す る ホ ル モ ン 投 与 プ ロ ト コ ル（ 80）に よ り 過 剰 排 卵 を 誘 起 し た 。hCG 投 与 直 後 に 同 系 統 雄 ラ ッ ト に 交 配 さ せ た 。翌 日 プ ラ グ の 有 無 に よ り 交 尾 の 確 認 を 行 い ， そ の 日 の 16： 00（ hCG 投 与 後 18 時 間 後 ） よ り 卵 管 灌 流 に て 前 核

30

期 受 精 卵 を 採 取 し た 。

Tg ラ ッ ト の 作 出

Tg ラ ッ ト 作 出 の た め の 前 核 期 受 精 卵 へ の DNA マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン

は ，保 地 ら の 方 法（ 55）に 準 じ て 行 っ た 。導 入 遺 伝 子 で あ る 翻 訳 開 始 点 を 欠

落 し た 温 度 感 受 性 の SV40 DNA（ pSVtsA58ori(-)-2） (89)を Bam HI 制 限 酵 素

切 断 に よ り pBR322 ベ ク タ ー 部 分 を 除 去 し ，5 ng/µl と な る よ う に TE0.1（ 10

mM Tris pH8.0, 0.1 mM EDTA-2Na） に て 調 整 し た （ Fig. 2-1）。 顕 微 鏡 （ ノ

マ ル ス キ ー 微 分 干 渉 装 置 付 倒 立 顕 微 鏡 , TMD300, ニ コ ン , 東 京 都 港 区 ） に マ イ ク ロ マ ニ ュ ピ ュ レ ー タ ー （ MO102， MO103, ナ リ シ ゲ , 東 京 都 世 田 谷 区 ） を 装 着 し ， 200 倍 の 倍 率 下 で ラ ッ ト 前 核 期 受 精 卵 の 雄 性 前 核 内 に 微 細 ガ ラ ス ピ ペ ッ ト を 用 い て DNA 溶 液 を 注 入 し た 。 DNA を 注 入 し た 受 精 卵 は mKRB 培 地 に 入 れ ， CO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で 翌 日 の 10： 00 ま で 5% CO2-95% air の 湿 度 飽 和 の 条 件 下 で 一 晩 培 養 を 行 っ た 。死 滅 や 異 常 を 除 く 1 細 胞 期 あ る い は 2 細 胞 期 ま で 発 生 し た 胚 を 移 植 に 供 し た 。 レ シ ピ エ ン ト ラ ッ ト は 同 系 統 の Crj:wistar を 用 い ， 膣 ス メ ア に よ り 性 周 期 を モ ニ タ ー し ， 発 情 前 期 と 確 認 さ れ た 雌 を 精 管 結 紮 雄 に 交 配 し ，翌 日 に 膣 栓 が 確 認 さ れ た 雌 ラ ッ ト を レ シ ピ エ ン ト と し て 実 験 に 供 し た 。出 産 は 自 然 分 娩 さ せ た 。死 産 産 子 ，哺 育 途 上 で 死 亡 し た 産 子 の 後 肢 の 一 部 ，又 は 4 週 齢 以 降 で 離 乳 ま で に 至 っ た 産 子 よ り 生 検 し た 尾 サ ン プ ル を DNA 解 析 の た め に 用 い た 。サ ン プ ル は DNA 抽 出 の た め に 液 体 窒 素 で 急 速 に 凍 結 し ， 使 用 ま で デ ィ ー プ フ リ ー ザ ー （ -80℃ ） 内 に 保 管

し た 。 DNA 抽 出 は 常 法 に 従 い 蛋 白 分 解 酵 素 （ Proteinase K + Actinase E ）

に よ り 溶 解 し ， RNA 分 解 酵 素 処 理 後 に ク ロ ロ フ ォ ル ム 処 理 で 除 蛋 白 を 行 い ，

エ タ ノ ー ル 沈 殿 に て ヒ モ 状 の 高 分 子 染 色 体 DNA を 回 収 し た 。 得 ら れ た DNA

31

ー は tsA58-1A［ 5’-TCCTAATGTGCAGTCAGGTG-3’（ 1365～ 1384）］，tsA58-1B，

[5’ -ATGACGAGCTTTGGCACTTG -3’（ 1571～ 1590）］を 用 い た 。両 プ ラ イ マ ー 間 で 増 幅 さ れ る サ イ ズ 225bp の シ グ ナ ル の 検 出 に よ っ て 陽 性 と 判 断 し た 。樹 立 さ れ た Tg ラ イ ン の 導 入 コ ピ ー 数 の 判 定 に は サ ザ ン 法 を 用 い て 行 っ た 。 注 入 に 用 い た 全 長 （ 5.24kb ） を プ ロ ー ブ と し て 用 い て 放 射 性 同 位 元 素 3 2_{P dCTP} を ラ ン ダ ム プ ラ イ ム 法 に て ラ ベ ル を 行 っ た 。コ ン ト ロ ー ル と し て 野 生 型 ラ ッ ト (Crj:Wistar)の ゲ ノ ム DNA を 用 い て 1,5,10,20,50 お よ び 100 コ ピ ー 数 濃 度 標 準 を 作 製 し ，オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ ー に よ る X 線 フ ィ ル ム を デ ン シ ト メ

ー タ （ Model GS-670, Bio-Rad, Hercules, CA, USA） を 用 い て 数 値 化 し ， 濃

度 標 準 曲 線 よ り 各 Tg ラ イ ン の 導 入 コ ピ ー 数 を 算 出 し た 。ま た ，Tg の 交 配 に よ る ホ モ 化 の 際 の ホ モ・へ テ ロ の 候 補 選 抜 に は ，サ ザ ン 法 を 用 い て 陽 性 シ グ ナ ル の 強 弱 よ り ホ モ 候 補 を 絞 り 込 ん だ 。な お ，こ の 結 果 は 確 定 判 断 と し て で は な く ， 野 生 型 都 の 交 配 に よ る 後 代 検 定 に よ り 確 認 し ， さ ら に FISH 解 析 に て ホ モ を 断 定 し た 。 Tg 初 代 培 養 線 維 芽 細 胞 の 培 養 樹 立 さ れ た Tg ラ ッ ト 4 系 統 に つ い て ， 同 系 統 の Crj:wistar と の 交 配 後 18 日 目 で 胎 子 を 採 材 し ， 線 維 芽 細 胞 の 初 代 培 養 株 を 樹 立 し た 。 各 胎 子 は 個 体 ご と に 個 別 に 扱 い ，頭 部 及 び 腹 腔 内 の 臓 器 を 滅 菌 濾 紙 上 で 取 り 除 い た 上 で

細 切 し た 後 ，0.05％ trypsin(w/v)，0.02％ EDTA・ 4Na(w/v)(Gibco BRL)を 添

加 し た Hanks’ solution（ pＨ 7.4） 中 で 30 分 間 ， 37℃ 処 理 で 細 胞 単 離 を 行

い ，遠 心 に て 細 胞 を 回 収 し た 。Hanks’ solution で 洗 浄 後 に 回 収 し た 線 維 芽

細 胞 は ， 10 ％ ウ シ 胎 子 血 清 (FBS, GIBCO®, Thermo Fisher

Scientific,Waltham, Massachusetts, USA ) 含 有 Dulbecco’ s modified

32

Massachusetts, USA） に て 5% CO2-95% air の 湿 度 飽 和 の 37℃ 条 件 下 で 培 養

し た 。 培 地 交 換 は 3～ 4 日 毎 に 行 っ た 。 1 週 間 後 に コ ン フ ル エ ン ト に な っ た 細 胞 の 1/10 を 継 代 し ， 残 り の 細 胞 で PCR 法 に よ る Tg の 判 定 を 行 い ， Tg 初 代 培 養 細 胞 を 選 抜 し た 。 T 抗 原 の 発 現 Tg 初 代 培 養 線 維 芽 細 胞 の T 抗 原 の 発 現 は ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト 法 で 解 析 し た 。 90 mmØ の シ ャ ー レ に 37℃ 培 養 に て し た 細 胞 が コ ン フ ル エ ン ト に な っ た

時 点 で，培 養 液 除 去 後に 1ml の RIPA buffer（ 150 mM NaCl, 1% NP40,0.5%

deoxycholate-Na, 0.1% sodium dodecylsulfate( SDS), 50 mM Tris-HCl,

pH8.0 ） を 添 加 し タ ン パ ク 質 を 抽 出 し た 。 得 ら れ た タ ン パ ク 質 の 濃 度 は

Protein Assay Kit II（ Bio-Rad， Hercules, CA, USA） を 用 い て 測 定 し ， 20

µg の 蛋 白 質 を SDS-polyacrylamide gel に ア プ ラ イ し て 100 V に て 電 気 泳 動

後 ， ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 に ト ラ ン ス フ ァ ー し た 。 3%ス キ ム ミ ル ク で 室 温 1

時 間 の ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 後 ， anti-SV40 T ag mouse monoclonal IgG

（ Calbiochem, San Diego, CA, USA）で 抗 原 抗 体 反 応 を し た 後 に ，ECL Western

blotting detection kit (Amersham, Buckinghamshire, UK)を 用 い て 化 学 発

光 さ せ ， X 線 フ ィ ル ム に 露 光 さ せ た 。 温 度 感 受 性 細 胞 増 殖 の 検 定 樹 立 し た Tg 初 代 培 養 線 維 芽 細 胞 を 3～ 5 世 代 継 代 後 に ， 4 x 103_{の 細 胞 数} に な る よ う 96 ウ ェ ル プ レ ー ト に 播 種 し ，SV40 ラ ー ジ T 抗 原 が 活 性 化 さ れ る 33℃ と ，ラ ッ ト 体 温 の 37 度 よ り 高 い 39℃ の 温 度 条 件 下 で そ れ ぞ れ 培 養 し た 。 培 養 開 始 の 翌 々 日 よ り 細 胞 の 増 殖 を 1〜 ２ 日 毎 に WST-1 キ ッ ト (Dojin, 熊 本 県 上 益 城 郡 益 城 町 )を 用 い て 450nm の 吸 光 度 で 測 定 し た 。

33 Tg ラ ッ ト の ホ モ 化 上 記 の 検 定 で 温 度 感 受 性 増 殖 を 示 し た #1507-5 及 び #1519-8 の Tg ラ ッ ト 系 統 に つ い て ，交 配 に よ り 導 入 さ れ た Tg の ホ モ 化 を 試 み た 。F2 世 代 の 産 子 の ヘ テ ロ Tg 雌 お よ び ヘ テ ロ Tg 雄 ラ ッ ト で ペ ア を 作 り 産 子 を 取 得 し た 。得 ら れ た 産 子 の サ ザ ン 法 で シ グ ナ ル の 強 い 個 体 を ホ モ 候 補 と し て 選 抜 し た 。ホ モ 個 体 の 確 定 の た め ， さ ら に 後 代 検 定 を 実 施 し た 。 す な わ ち ， 選 抜 し た Tg 産 子 （ F3）が 繁 殖 適 期 に 至 っ た 時 点 で ，野 生 型 の 雌 あ る い は 雄 と 交 配 さ せ ，得 ら れ た 産 子（ あ る い は 胎 子 ）の PCR 検 定 に よ り 全 産 子 個 体 が 導 入 遺 伝 子 を 持 つ 個 体 を ホ モ と 同 定 し た 。 同 定 さ れ た F3 世 代 の ホ モ 雌 雄 ラ ッ ト を 用 い て 以 降 の 継 代 を 行 っ た 。さ ら に ，確 立 さ れ た Tg ホ モ 接 合 体 系 統 に つ い て ，FISH 法 （ 119）を 用 い て Tg が ホ モ で あ る こ と を 確 認 す る と と も に 導 入 遺 伝 子 座 位 を 決 定 し た 。 結 果 Tg ラ ッ ト 系 統 樹 立 564 個 の 注 入 操 作 受 精 卵 か ら 23 匹 の Tg フ ァ ウ ン ダ ー ラ ッ ト が 得 ら れ ，作 出 効 率 は 注 入 処 理 受 精 卵 当 た り 4.1%（ 23/564）の 効 率 で Tg 系 統 の 候 補 を 作 出 こ と が で き た （ Table 2-1）。 し か し ， 23 匹 の う ち 10 匹 に つ い て は ， 分 娩 か ら 離 乳 ま で に 死 亡 し ，さ ら に 2 匹 は 交 配 適 期 に 到 達 す る 前 に 死 亡 し た 。交 配 に 至 る こ と が で き た 11 匹 の う ち ， 2 匹 は 不 妊 で ， 2 匹 は 産 子 に Tg 個 体 が 得 ら れ な か っ た 。さ ら に F1 世 代 の Tg 産 子 の み が 離 乳 前 に 死 亡 を 示 す 2 匹 も あ り ， 最 終 的 に 導 入 遺 伝 子 を 次 世 代 に 伝 え る こ と が で き た Tg フ ァ ウ ン ダ ー は 5 系 統 で 作 出 効 率 は 注 入 処 理 受 精 卵 564 個 か ら 5 系 統（ 0.89％ ）と な っ

34 た （ Table 2-2）。 5 系 統 の Tg ラ イ ン の 表 現 型 を Table 2-3 に ま と め た 。 #1507-2 は Tg フ ァ ウ ン ダ ー で は 皮 下 お よ び 腎 臓 に 生 後 170 日 頃 よ り 良 性 腫 瘍 化 が 認 め ら れ た が ， 次 世 代 で は 腫 瘍 が 認 め ら れ な く な っ た 。 #1507-5 及 び #1511-6 は フ ァ ウ ン ダ ー で は 腫 瘍 化 が 認 め ら れ な か っ た が ， F1 代 産 子 以 降 で 生 後 130 日 頃 に 前 後 か ら 皮 下 の 良 性 腫 瘍 が 確 認 さ れ た 。#1509-7，#1519-8 は Tg フ ァ ウ ン ダ ー 及 び 次 世 代 ラ ッ ト い ず れ か ら も 腫 瘍 発 生 は 認 め ら れ な か っ た 。#1511-6 系 統 は F1 代 産 子 は 生 後 21 日 よ り 皮 下 に 良 性 腫 瘍 発 生 と と も に 繁 殖 が 困 難 と な り ， 系 統 選 抜 か ら 除 外 し た 。 #1511-6 系 統 を 除 く 4 系 統 か ら ，Tg 初 代 胎 子 線 維 芽 細 胞 を 樹 立 し ，T 抗 原 の 発 現 を ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト で 確 認 し た と こ ろ ，4 系 統 と も に 導 入 遺 伝 子 の 発 現 を 認 め ら れ た（ Fig.2-2）。次 に 温 度 感 受 性 細 胞 増 殖 の 確 認 の た め ，SV40 ラ ー ジ T 抗 原 が 不 活 化 状 態 に あ る 39℃ お よ び 活 性 化 状 態 に あ る 33℃ で 培 養 し た と こ ろ ，#1507-5 及 び #1519-8 系 統 で 39℃ の 培 養 条 件 に 比 べ て 33℃ の 細 胞 増 殖 が 温 度 感 受 性 増 殖 を 示 し た （ Fig.2-3）。 こ の 2 ラ イ ン で Tg の ホ モ 化 を 試 み ，後 代 検 定 及 び FISH 法 に よ り Tg ホ モ で あ る こ と を 確 認 で き た 。ま た ， Tg が 導 入 さ れ た 染 色 体 座 位 は ，#1507-5 は 第 16 番 染 色 体（ q.1.2），#1519-8 系 統 は 第 8 番 染 色 体 （ q.1.3） で あ っ た 。 考 察 我 々 の 過 去 の Tg ラ ッ ト の 作 出 実 験 で は ， 作 出 効 率 は 注 入 受 精 卵 あ た り 2 ～ 3％ で あ っ た （ 50）。 今 回 の Tg ラ ッ ト 作 出 効 率 は 4％ で あ っ た が ， 産 子 の 初 期 死 亡 な ど の 様 々 な 段 階 で Tg 系 統 化 の 候 補 が 脱 落 し ， 安 定 し て 次 世 代 産 子 が 得 ら れ た の は 4 系 統 で ，注 入 受 精 卵 当 た り の Tg 系 統 化 率 が 0.89％ と な

35 っ た 。同 遺 伝 子 の 導 入 を 試 み た マ ウ ス の 報 告 は ，33 匹 の Tg フ ァ ウ ン ダ ー の 多 数 が 死 亡 し て お り ，１ 系 統 の み ラ イ ン 化 に 至 っ た と さ れ て い る（ 125）。し か も ， こ の Tg マ ウ ス 系 統 は 脳 内 脈 絡 膜 細 胞 の 良 性 腫 瘍 を 原 因 と し た 水 頭 症 を 発 症 し ， 生 後 12 週 齢 頃 に 死 亡 す る こ と か ら ， 自 然 交 配 で は 継 代 で き ず 体 外 受 精 を 用 い て 系 統 維 持 さ れ て い る 。 組 織 特 異 的 な H2Kb class I 抗 原 の プ ロ モ ー タ ー を 用 い て 温 度 感 受 性 SV40 ラ ー ジ Ｔ 抗 原 を 発 現 さ せ た Tg マ ウ ス で も ， Tg フ ァ ウ ン ダ ー の 多 数 が 死 亡 し ， Tg ラ イ ン の ホ モ 化 に ま で 至 っ た も の は １ ラ イ ン に 過 ぎ な い と さ れ て い る (66)。in vitro に お い て 37℃ で は T 抗 原 は 不 活 化 状 態 に あ る と さ れ て い る 温 度 感 受 性 T 抗 原 だ が ， 体 温 が 37℃ で あ る マ ウ ス ，ラ ッ ト の 生 体 内 に お い て T 抗 原 の 不 活 化 の 制 御 は 不 十 分 で あ る の か も し れ な い 。 体 温 が 38.5℃ と マ ウ ス ラ ッ ト に 比 べ て 体 温 の 高 い ウ サ ギ で は ，T 抗 原 活 性 の 温 度 制 御 性 が 向 上 し ，Tg ウ サ ギ を 効 率 よ く 得 ら れ る と 予 想 し ， ウ サ ギ 胚 816 個 を 用 い て Tg ウ サ ギ の 作 出 を 試 み た が ， 得 ら れ た 36 匹 の 産 子 の う ち ， 1 匹 が Tg 産 子 で あ っ た も の の ， 哺 育 中 に 死 亡 し た （ unpublished data）。 こ の こ と か ら ， 温 度 感 受 性 の T 抗 原 活 性 の 制 御 は ウ サ ギ の 体 温 は 38.5℃ で も 不 十 分 で あ り ， 温 度 感 受 性 T 抗 原 遺 伝 子 を 用 い て 継 代 可 能 な 不 死 化 Tg 系 統 を 樹 立 す る た め に は ，や は り よ り 多 く の Tg フ ァ ウ ン ダ ー を 作 出 し ，発 現 解 析 を 含 め て 系 統 化 ま で 適 切 な 系 統 を 選 抜 す る 必 要 が あ る こ と を 示 し て い る 。今 後 は ，よ り 効 率 的 な 不 死 化 動 物 の 開 発 に は 温 度 感 受 性 制 御 の 改 良 や ，テ ロ メ ラ ー ゼ 伸 長 に 関 わ る hTERT 遺 伝 子 の 活 性 化 ，組 織 の 老 化 に 伴 っ て 上 昇 す る p16I N K 4 a_{の 抑 制 な ど と の 複 合 化 に よ る 改 善 が 考 え ら} れ る（ 39）。本 実 験 で 用 い た 遺 伝 子 は SV40 初 期 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー の 制 御 下 に あ る 。 SV40 初 期 遺 伝 子 プ ロ モ ー タ ー は 全 身 性 に 発 現 す る 強 い プ ロ モ ー タ ー 活 性 を 持 つ こ と か ら ， CMV プ ロ モ ー タ ー と と も に Tg 動 物 で 強 制 発 現 に よ く 用 い ら れ て い る 。 本 実 験 で 系 統 化 さ れ た 4 ラ イ ン の す べ て で SV40 ラ ー ジ

36 Ｔ 抗 原 の 発 現 が 確 認 で き た 。し か し ，顕 著 に 温 度 感 受 性 の 細 胞 増 殖 を 示 し た の は 2 系 統 で ，残 る 2 系 統 は 明 確 な 温 度 感 受 性 の 細 胞 増 殖 は 観 察 で き な か っ た 。そ の 理 由 を 明 確 に 説 明 す る こ と が で き な い が ，導 入 遺 伝 子 の 変 異 や 発 現 量 ，あ る い は 翻 訳 後 修 飾 に つ い て ，こ の 2 種 類 の 系 統 を 比 較 し て 行 く こ と が 今 後 の 課 題 と し て 挙 げ ら れ る 。#1507-5 で 生 後 130 日 頃 に は 皮 下 や 腎 臓 に 良 性 腫 瘍 が 発 生 し た 。 し か し ， こ の Tg 雌 ラ ッ ト に お い て は ， 腫 瘍 発 生 後 も ， 転 移 な ど 増 悪 化 す る こ と な く ，生 殖 能 力 も 維 持 し 2 産 子 目 の 産 子 ま で 離 乳 す る こ と が 可 能 で あ っ た 。従 っ て 1 産 目 で 後 代 検 定 で 確 認 で き た ホ モ 雌 雄 同 士 の ペ ア リ ン グ を 進 め た 結 果 ， ホ モ 接 合 体 系 統 の 樹 立 に 成 功 し た 。 ホ モ Tg 系 統 を 確 立 す る こ と に よ り ， ホ モ 雄 に 対 し て Crj:Wistar 雌 を 交 配 す れ ば 産 子 の す べ て が ヘ テ ロ Tg と な り ， 産 子 の 遺 伝 子 判 定 が 不 要 に な り ， 胎 子 か ら の 細 胞 株 樹 立 に 有 利 で あ る 。 ま た 他 系 統 と の 交 雑 で も 有 利 な 点 が あ り ,我 々 が 別 に 樹 立 し て い た CAG/EGFP Tg ラ ッ ト （ 40） と の 交 雑 で 得 ら れ た ダ ブ ル Tg ラ ッ ト か ら ， 光 る 細 胞 株 の 樹 立 に も 至 っ て い る （ 77）。 ま た ， マ ウ ス の 10 倍 の 体 サ イ ズ を 持 つ ラ ッ ト は ， 少 な い 細 胞 数 か ら の 細 胞 樹 立 に 優 れ て い る 。こ の 優 位 性 を 生 か し て ，脳 血 管 内 の 細 胞 や 脈 絡 叢 上 皮 細 胞 ，網 膜 ミ ュ ラ ー 細 胞 な ど 非 常 に 少 な い 細 胞 数 で 構 成 さ れ た 器 官 か ら の 細 胞 株 樹 立 が 新 た に 成 功 し て い る (Tale 2-4)。さ ら に 発 生 途 上 に お け る 幹 細 胞 ， 前 駆 細 胞 な ど か ら 細 胞 株 が 樹 立 で き る こ と が 期 待 で き る 。こ れ ら 樹 立 さ れ た 細 胞 株 は 現 在 ， 株 式 会 社 フ ァ ク ト （ http://www.fact-sv40.com/） に よ っ て 収 集 ， 保 管 お よ び 頒 布 が 行 わ れ て ， 種 々 の 研 究 活 動 に 用 い ら れ て い る 。

37

Figure 2-1. DNA construction of transgene. The

replication origin（ Ori） of SV40 virus was inactivated

by Sac II digestion and ligated by Klenow enzyme filling.

CCGCGG

CCGCGC

GG

GGCGCC

GGCGCGCC

←　　　　SV40tsA58 Ori(-)-2 5.24kb　　　　　→

Bam HI

Bam HI

38

Number of pronuclear- : Injected

564

stage zygotes

: Survived

503

: Transferred

500

Pregnant/Transferred

18/20

Number of pups

: Born

133

: Weaned

99

: Integration analyzed

110

23

＊

_{incduding postpartum death}

Table 2-1. Production efficiency of SV40- tsA58 transgenic rats

39

Number of transgenic rat obtained

23

Died before weaning

10

Died before mating

2

Not transmitted to next generation

: Infertility

2

: Mosaic

2

Premature death of F1 pups

2

Number of established transgenic rat line

5

Overall efficiency of transgenic line(/injected)

0.89%

Table 2-2. Establishment of SV40-tsA58 transgenic rat line

40

Transgene copy

number Days Site

F0 + 170～ Subcutis, Kidney Normal

F1 - Normal

F2 - Normal

F0 - Normal

F1 + 130～ Subcutis, Kidney Normal

F2 + 130～ Subcutis, Kidney Normal

F0 - Normal

F1 - Normal

F2 - Normal

F0 - Low

F1 + 21～ Subcutis, Kidney Low

F2 + 21～ Subcutis, Kidney Low

F0 - Normal

F1 - Normal

F2 - Normal

Table 2-3. Characteristics of SV40-tsA58 Tg rats lines in 6 months

Line Generation Characteristics Reproductivity Tumorigenesis #1507-2 14 #1507-5 190 #1519-8 26 #1509-7 3 #1511-6 17

41

Figure 2-2. Expression of transgene in fetal

fibroblast cells from Tg transgenic rats . SV40

large T antigen was detected by western bolt

analysis. The mouse TBR59 cell line is used as

a positive control (92).

kd

112

84

53

T

B

R

59

#1519

-8

#1509

-7

#1507

-5

#1507

-2

42

Figure 2-3. Cell growth under different

temperature conditions. Cells were cultured at

33 ℃ （ ○ ） and 39 ℃ （ ● ） , and the growth was

monitored by a colorimetric tetrazolium method.

Ab

so

rb

an

c

e

(4

5

9n

m

)