メディシナルフラワーの機能性成分を指標とした品質評価―茶花, 蝋梅花および蓮花―

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

メ デ ィ シ ナ ル フ ラ ワ ー

の 機 能 性 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価

― 茶 花 , 蝋 梅 花 お よ び 蓮 花 ―

北

北

北

北

川

川

川

川

仁

仁

仁

仁

一

一

一

一

朗

朗

朗

朗

メ デ ィ シ ナ ル フ ラ ワ ー の 機 能 性 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 北 川 仁 一 朗

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

博 士 学 位 論 文

メ デ ィ シ ナ ル フ ラ ワ ー

の 機 能 性 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価

― 茶 花 , 蝋 梅 花 お よ び 蓮 花 ―

平 成 28 年 11 月 19 日

北

北

北

北

川

川

川

川

仁

仁

仁

仁

一

一

一

一

朗

朗

朗

朗

目

目

目

目

次

次

次

次

緒 論 ··· 1 本 論 ··· 10 第一章 茶花 (Camellia sinensis 花蕾部) の生体機能成分を指標とした品質評価 ··· 10 第一節 含有成分の抽出・単離 ··· 10 第二節 LC-MS を用いたポリフェノール成分の定量分析 ··· 13 第三節 HPLC を用いたサポニン成分の定量分析 ··· 23 第二章 蝋梅花 (Chimonanthus praecox 花蕾部) の生体機能成分を指標とした品質評価·· 30 第一節 含有成分の抽出・単離 ··· 30 第二節 HPLC を用いたアルカロイド成分の定量分析 ··· 33 第三節 HPLC を用いたフラボノイド成分の定量分析 ··· 37 第四節 含有成分の脂肪蓄積抑制活性 ··· 41 第三章 蓮花 (Nelumbo nucifera 花蕾部) の生体機能成分を指標とした品質評価 ··· 42 第一節 含有成分の抽出・単離 ··· 42 第二節 含有アルカロイド nornuciferine (32) の安定性評価 ··· 44 第三節 LC-MS を用いたアルカロイド成分の定量分析 ··· 48 第四節 含有成分のメラニン産生抑制活性 ··· 53 結 論 ··· 59 謝 辞 ··· 62 実験の部 ··· 63 第一章の実験 ··· 63 第一節の実験 ··· 63 第二節の実験 ··· 68 第三節の実験 ··· 70 第二章の実験 ··· 72 第一節の実験 ··· 72 第二節の実験 ··· 75 第三節の実験 ··· 77 第四節の実験 ··· 79

第三章の実験 ··· 80 第一節の実験 ··· 80 第二節の実験 ··· 81 第三節の実験 ··· 82 第四節の実験 ··· 86 引用文献 ··· 89

1

緒

緒

緒

緒

論

論

論

論

花 は , 胚 珠 を 有 す る 種 子 植 物 の 生 殖 器 官 と 定 義 さ れ て い る . し か し , 裸 子 植 物 の 花 に は , 花 弁 や が く 片 が な く , 胚 珠 も む き 出 し に な っ て い る こ と か ら 一 般 的 な 概 念 で は 花 に は 見 え な い . そ の た め , 花 弁 ( 花 冠 ), が く 片 , 雄 蕊 , 雌 蕊 を 有 す る 被 子 植 物 の 生 殖 器 官 を 狭 義 に 花 と 呼 ぶ こ と が 多 い . 人 類 は な ぜ か 花 を 好 む 傾 向 が あ り , 例 え ば , 旧 人 類 の ネ ア ン デ ル タ ー ル 人 は 死 者 を 花 で 飾 っ た こ と や , 古 代 エ ジ プ ト 人 が 墳 墓 を 花 で 飾 っ た こ と な ど が 発 掘 か ら 明 ら か に な っ て い る . 人 類 は 花 に 美 し さ だ け で な く , 神 聖 性 と 象 徴 性 を 感 じ て い た と 言 わ れ て い る . ま た , 花 を 観 賞 用 に 供 す る だ け で な く , 香 粧 品 や 食 品 , 薬 用 な ど に も 利 用 し て き た . 古 代 エ ジ プ ト で は , 花 を 原 料 と し た 香 料 や 化 粧 品 が 作 ら れ , ロ ー マ や ギ リ シ ャ な ど に 輸 出 し て い た . ま た , 中 国 伝 統 医 学 や 漢 方 医 学 で は , 紅 花 , 槐 花 , 菊 花 , 金 銀 花 な ど の 花 部 由 来 の 生 薬 が 方 剤 中 に 配 剤 さ れ て い る . 西 洋 生 薬 と し て も , デ イ ジ ー , マ リ ー ゴ ー ル ド , エ バ ー ラ ス テ ィ ン グ な ど の 薬 用 花 が 知 ら れ て い る . 欧 州 に お い て は , ア ロ マ セ ラ ピ ー な ど に お い て 花 の 精 油 が し ば し ば 用 い ら れ て い る . ま た , イ ギ リ ス 人 医 師 の エ ド ワ ー ド ・ バ ッ チ の 提 唱 し た “ フ ラ ワ ー レ メ デ ィ ー ” の 考 え 方 で は , 花 の エ ネ ル ギ ー で 人 の 心 を 癒 し , 花 の エ キ ス で 人 の ネ ガ テ ィ ブ な 感 情 を ポ ジ テ ィ ブ な 感 情 に 変 え る こ と が 出 来 る と 論 じ て い る . 近 年 , 人 の 精 神 的 な 面 も 包 含 し た 全 人 的 な 医 療 が 求 め ら れ て お り , 欧 米 を 中 心 に し て バ ッ チ の フ ラ ワ ー レ メ デ ィ ー は 広 く 信 奉 さ れ て い る . し か し , 薬 用 花 な ど に お け る 花 の 機 能 性 に 関 す る マ テ リ ア ル サ イ エ ン ス , す な わ ち 成 分 レ ベ ル で の 科 学 的 な 解 明 研 究 は ほ と ん ど 行 わ れ て い な い . こ れ ま で に 著 者 ら の 研 究 グ ル ー プ は , 薬 用 花 を メ デ ィ シ ナ ル フ ラ ワ ー と 称 し , そ の 科 学 的 解 明 を 目 指 し て , 種 々 の 薬 用 お よ び 有 用 植 物 の 花 の 生 体 機 能 の 開 拓 と 機 能 性 成 分 の 解 明 お よ び 応 用 研 究 を 進 め て き た . し か し , 天 然 薬 物 に は 気 候 風 土 な ど に よ る 成 分 の 変 動 の あ る こ と が 知 ら れ て お り , 特 に , 花 類

2 生 薬 は 不 安 定 で 取 り 扱 い が 難 し く , 乾 燥 処 理 な ど の 加 工 調 製 法 の 違 い や 保 存 期 間 な ど に よ っ て 精 油 成 分 の 減 少 や 分 解 , 二 次 的 な 化 学 変 化 の 可 能 性 が あ り , 厳 密 な 品 質 評 価 法 の 確 立 が 必 要 と さ れ て い る . そ こ で , 著 者 は ト レ ー サ ビ リ テ ィ の 観 点 か ら 産 地 の 同 定 や 均 一 な 品 質 を 担 保 す る こ と を 目 的 と し , 茶 花 , 蝋 梅 花 お よ び 蓮 花 に つ い て 新 し い 機 能 性 の 解 明 と と も に , そ れ ら の 活 性 寄 与 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 法 の 開 発 に 着 手 し た . 茶 花 茶 花 茶 花 茶 花 (Camellia sinensis 花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部 ) の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 チ ャ (Camellia sinensis) は , ツ バ キ 科 (Theaceae) ツ バ キ 属 の 常 緑 性 木 本 で , 葉 が 小 さ く 樹 高 2～ 3 m な ど の 灌 木 の 耐 寒 性 の 強 い 中 国 種 と , 葉 が 大 き く 8～ 15 m に も な る 喬 木 の ア ッ サ ム 種 に 大 別 さ れ る .1 ) 中 国 種 は , 雲 南 , 四 川 , 貴 州 省 な ど の 中 国 西 南 部 か ら 福 建 , 浙 江 省 な ど の 中 部 地 域 及 び 台 湾 , 日 本 の 暖 地 な ど で 栽 培 さ れ て お り , イ ン ド や ア フ リ カ (ケ ニ ヤ な ど ), 南 ア メ リ カ (ア ル ゼ ン チ ン な ど ) へ も 移 植 さ れ て い る . ア ッ サ ム 種 は , イ ン ド や ス リ ラ ン カ , イ ン ド ネ シ ア な ど の 熱 帯 , 亜 熱 帯 地 域 で 栽 培 さ れ て い る . ま た , イ ン ド シ ナ 半 島 に は 両 種 の 交 雑 種 と 考 え ら れ て い る 種 の 存 在 や , 日 本 や 中 国 な ど で 多 数 の 栽 培 品 種 が 作 出 さ れ て い る . チ ャ の 葉 部 (茶 葉 ) を 用 い た 喫 茶 の 歴 史 は , 少 な く て も 2000 年 以 前 に 遡 り , 当 初 は 薬 用 が 中 心 で あ っ た と 考 え ら れ て い る . 茶 葉 の 薬 効 と し て , 頭 と 目 を 清 め る , 煩 渇 を 除 く , 食 を 消 す , 利 尿 す る , 解 毒 す る な ど が 伝 承 さ れ , 頭 痛 や 目 く ら み , 多 眠 , 激 し い 口 渇 を 治 し , 去 痰 , 消 化 , 利 尿 作 用 が あ り , 解 毒 作 用 が あ っ て 下 痢 や 二 日 酔 い を 治 療 す る な ど と 薬 効 が 記 載 さ れ て い る . 近 年 , カ フ ェ イ ン に 中 枢 興 奮 , 鎮 静 , 血 管 拡 張 作 用 な ど の 薬 理 作 用 の あ る こ と や , カ テ キ ン 類 に 抗 が ん 作 用 , 抗 酸 化 作 用 , コ レ ス テ ロ ー ル 上 昇 抑 制 作 用 , 血 糖 値 降 下 作 用 , 抗 菌 及 び 抗 酒 作 用 , 血 圧 降 下 作 用 な ど が 報 告 さ れ て お り , 茶 葉 の 主 薬 効 成 分 は , カ フ ェ イ ン と カ テ キ ン 類 と 言 っ て も 過 言 で は な い .2 ) 一 方 , チ ャ の 花 部 (茶 花 ) に つ い て は , 伝 統 医 学 に お い て 薬 用 と し た 記 載 は 認 め ら れ な い が , 日 本 に お い て 古 く か ら 食 用 に さ れ て き た . 例 え ば , 島 根 県 で は 茶 花 を 用 い た “ 花 番 茶 ” と そ れ を 点 じ て 食 す る “ ぼ て ぼ て 茶 ” と 言 う

3 お 茶 漬 け の よ う な 料 理 が 知 ら れ て い る .3 , 4 ) 花 番 茶 は , 茶 葉 に 干 し た 茶 花 を 入 れ た も の で , 茶 花 が “ ぼ て ぼ て 茶 ” に 必 要 な 泡 立 ち を 作 り 出 す . 花 番 茶 で 点 じ た も の を , 先 端 部 に 塩 を 付 け た 茶 筌 で 泡 立 て , そ れ に 冷 や 飯 や 赤 飯 , 煮 豆 , 漬 物 な ど の 具 を 入 れ て 食 し て き た . “ ぼ て ぼ て 茶 ”は , タ タ ラ (製 鉄 ) 職 人 や 漁 師 な ど の 重 労 働 者 の 空 腹 時 の し の ぎ 飯 や , 飢 饉 の 際 の 食 い 延 ば し と 呼 ば れ る 食 糧 消 費 の 節 約 を 図 る 救 荒 食 と し て 用 い ら れ て お り , 茶 花 が そ れ ら の 効 能 に 寄 与 し て い る と 伝 え ら れ て い た . し か し , 茶 花 の 機 能 性 や 含 有 成 分 な ど の 科 学 的 研 究 は こ れ ま で 全 く 研 究 さ れ て い な か っ た . 最 近 , 著 者 ら の グ ル ー プ に よ っ て 茶 花 抽 出 エ キ ス に , 抗 高 脂 血 症 作 用 ,5 - 8 ) シ ョ 糖 負 荷 マ ウ ス に お け る 血 糖 値 上 昇 抑 制 作 用 ,7 , 8 ) 高 脂 肪 食 飼 育 マ ウ ス お よ び TSOD マ ウ ス に お け る 体 重 増 加 抑 制 作 用 ,9 ) マ ウ ス で の 胃 排 出 能 抑 制 作 用 ,8 ) ア ル ド ー ス 還 元 酵 素 阻 害 作 用 ,7 , 8 ) お よ び 小 腸 内 輸 送 亢 進 作 用 7 - 9 ) な ど の 抗 肥 満 , 抗 糖 尿 病 な ど の メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム 予 防 作 用 関 連 の 生 体 機 能 が 明 ら か に さ れ る と と も に , エ タ ノ ー ル お よ び イ ン ド メ タ シ ン 誘 発 の 胃 粘 膜 損 傷 抑 制 作 用 7 ) _{や 抗 ア レ ル ギ ー 作 用 ,}1 0 , 1 1 ) な ど が 見 だ さ れ て い る . ま た , 茶 花 の 含 有 成 分 と し て , フ ラ ボ ノ ー ル 配 糖 体 お よ び カ テ キ ン 類 , 芳 香 族 配 糖 体 , メ ガ ス テ ィ グ マ ン 配 糖 体 , サ ポ ニ ン 類 お よ び カ フ ェ イ ン が 単 離 同 定 さ れ る と と も に , 新 規 成 分 と し て サ ポ ニ ン 類 16 種 (floratheasaponin A ― J, chak as ap on i n I― V I), フ ラ ボ ノ ー ル 配 糖 体 2 種 (ch aka fl avo n os i d e A お よ び B) お よ び 芳 香 族 配 糖 体 2 種 (chak anos i de I お よ び II) が 明 ら か に さ れ て い る .5 , 7 , 8 , 1 0 , 1 2 - 1 4 ) _{既 知 成 分 の う ち カ テ キ ン 類 5 種 と 主 フ ラ ボ ノ イ ド 配 糖 体 類 ,} カ フ ェ イ ン は 茶 葉 と 共 通 し て お り , 茶 花 が 茶 葉 と 共 通 す る 機 能 性 を も 有 し て い る こ と も 判 明 し た . さ ら に , 茶 花 エ キ ス で 認 め ら れ た 抗 肥 満 作 用 や 抗 糖 尿 病 作 用 の 活 性 成 分 は chakasaponin 類 な ど の サ ポ ニ ン で あ り , そ れ ら の 作 用 メ カ ニ ズ ム に つ い て も , 食 欲 抑 制 物 質 の 遊 離 促 進 お よ び 迷 走 神 経 求 心 路 を 介 す る 食 欲 亢 進 シ グ ナ ル の 減 少 で あ る こ と な ど が 明 ら か に な っ て い る .9 ) こ の よ う な 科 学 的 エ ビ デ ン ス の も と に , 救 荒 食 か ら 見 い だ さ れ た 茶 花 は , 新 し い 抗 メ タ ボ 食 品 素 材 と し て 認 識 さ れ て い る . 今 日 で は , 日 本 の み な ら ず 台 湾 や 中 国 な ど で 利 用 さ れ て い る が , 機 能 性 成 分 の 含 量 が 低 い な ど の 茶 花 エ

4 キ ス の 品 質 に 問 題 が 生 じ て い る . そ こ で , 著 者 は 茶 花 お よ び そ の 抽 出 エ キ ス の 品 質 評 価 法 の 確 立 を 目 的 に , 茶 花 に 含 ま れ る 生 体 機 能 成 分 の 網 羅 的 な 定 性 お よ び 定 量 分 析 を 開 発 す る こ と と し た . す な わ ち , LC-MS を 用 い た 5 種 の カ テ キ ン 類 (1― 5), 10 種 の フ ラ ボ ノ イ ド 類 (6― 15) を 含 む 計 15 種 の ポ リ フ ェ ノ ー ル に 加 え , カ フ ェ イ ン (16) の 同 時 定 量 分 析 法 (Figure 1)1 5 ) お よ び 9 種 の サ ポ ニ ン 成 分 (17 ― 2 5 ) の HP LC 定 量 法 を 確 立 し ( Fi gur e 2 ) ,1 6 ) ト レ ー サ ビ リ テ ィ の 観 点 か ら , 産 地 に よ る 成 分 変 動 を 明 ら か に す べ く 定 量 分 析 を 実 施 し た .

Figure 1. Structures of catechins (1—5), flavonols (6—15) and caffeine (16) from tea flower.

そ の 結 果 , 中 国 福 建 省 , 四 川 省 お よ び イ ン ド と い っ た 中 国 西 部 お よ び 東 南 ア ジ ア 産 の 茶 花 で は , 主 要 フ ラ ボ ノ イ ド 含 量 に お い て , kaempferol 3 -O-

β

-D-gl u co p yr an o s yl - (1→3) -

α

-L- rh a m nop yr ano s yl -(1→6 )-

β

-D-gl uco p yr a n o s i d

R1 _R2

(–)-epicatechin (2) H H (–)-epigallocatechin (3) H OH (–)-epicatechin 3-O-gallate (4) galloyl H (–)-epigallocatechin 3-O-gallate (5) galloyl OH O HO OH OH OH OH O HO OH OH OH OR1 R2 galloyl = C O OH OH OH (+)-catechin (1) R1 _R2 kaempferol (6) H H kaempferol 3-O-Glc (7) Glc H kaempferol 3-O-Gal (8) Gal H kaemferol 3-O-Rut (9) S1 H

kaempferol 3-O-Glc-(1→3)-Rha-(1→6)-Glc (10) S2 H

kaempferol 3-O-Glc-(1_→3)-Rha-(1_→6)-Gal (11) S₃ H quercetin (12) H OH quercetin 3-O-Glc (13) Glc OH quercetin 3-O-Gal (14) Gal OH rutin (15) S1 OH O HO OH O OH OR1 R2 Glc: Gal: Rha: Rut: β-D-glucopyranosyl β-D-galactopyranosyl α-L-rhamnopyranosyl rutinoside S1= Glc6ー1Rha S2= Glc6ー1Rha3ー1Glc S3= Gal 6ー1Rha3ー1Glc caffeine (16) N N N N O O

5

e (10 ) の 方 が k aem p fero l 3 -O -

β

-D-gl uc o p yr anos yl -(1→3) -

α

-L-rh am n op yr ano s yl - (1→6 )-

β

-D-g al a ct o p yr a n o s i d e ( 11) よ り も 多 い と い う 特 徴 が 認 め ら れ , ま た , サ ポ ニ ン に つ い て は , chakasaponin 類 [chakasaponin I— III (17—19)] が fl o rat h eas ap o n i n 類 [ fl orat h eas apo ni n A— F (2 0— 25 )] よ り も 多 く 含 有 し て い る と い う 特 徴 が 認 め ら れ た . 一 方 , 安 徽 省 お よ び 日 本 産 の 茶 花 は , 10 と 11 を ほ ぼ 同 程 度 含 有 し て お り , ま た , floratheasaponin 類 の 方 が chakasaponin 類 と 比 べ て 多 く 含 有 さ れ て い る と い う 特 徴 が 認 め ら れ た . 地 理 的 に そ れ ら の 地 域 の 中 間 に 位 置 す る 台 湾 に お い て は , 上 記 で 述 べ た 二 つ の 地 域 の 特 徴 が 混 在 し て お り , 台 湾 に お け る チ ャ 栽 培 の 歴 史 を 考 え る 上 で 興 味 深 い 結 果 と 思 わ れ る .

Figure 2. Structures of saponins (17—25) from tea flower.

R1 _R2 chakasaponin I (17) Ac H chakasaponin II (18) Tig OH chakasaponin III (19) Ac OH R1 _R2 _R3 floratheasaponin A (20) Ac H Xyl floratheasaponin B (21) Ang OH Xyl floratheasaponin C (22) 2MB OH Xyl floratheasaponin D (23) Ac H Rha floratheasaponin E (24) Ang OH Rha floratheasaponin F (25) 2MB OH Rha C O CH₃ Ac = C O C H3C C H CH3 Tig = C O C H3C C CH3 H Ang = C O CH CH₂ CH3 CH₃ 2MB = Xyl: Rha: β-D-xylopyranosyl α-L-rhamnopyranosyl O OR3 OH HO H O CH2OH OH O COOH HO O O H O H OH OH HO HO OR1 OAng R2 H O O OH HO H O CH2OH OH O COOH HO O O H O H OH OH HO HO OR1 OTig R2 H O HO OH OH H

6 蝋 梅 花

蝋 梅 花 蝋 梅 花

蝋 梅 花 (Chimonanthus praecox 花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部 ) の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価花 蕾 部 の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 ロ ウ バ イ ( 蝋 梅 , Chimonanthus praecox) は , ロ ウ バ イ 科 (Cal ycanthaceae) ロ ウ バ イ 属 の 落 葉 低 木 で , 中 国 が 原 産 地 で 日 本 へ は 江 戸 時 代 の 初 め に 渡 来 し た と 言 わ れ て い る . 蝋 梅 と 言 う 漢 名 は , 花 弁 が 蝋 細 工 を 思 わ せ る よ う な 独 特 な 光 沢 と 質 感 が あ る こ と に 由 来 す る . 中 国 か ら 伝 来 し た こ と や , 花 が 梅 の 花 に 似 た 香 り を 有 す る こ と か ら , 別 名 を 唐 梅 や 黄 梅 花 と も 称 す る . 学 名 の 属 名 C hi mo na nt h u s は , ギ リ シ ャ 語 の chei m on ( 冬 ) と an t h o s ( 花 ) に 由 来 し , 種 小 名 の praecox は ラ テ ン 語 で “ 早 咲 き の ” を 意 味 し て お り , ロ ウ バ イ が 春 に 先 駆 け て 花 を 咲 か す こ と を 指 し て い る . 英 名 の Wintersweet は 花 が な い 寒 い 冬 に ロ ウ バ イ の 花 の 甘 い 芳 し い 香 り を 感 じ る こ と に 因 ん だ 名 前 と 言 わ れ , ロ ウ バ イ は 中 国 や 日 本 の み な ら ず , 欧 米 に お い て も 好 ま れ る 花 木 と し て 知 ら れ て い る . ロ ウ バ イ の 花 蕾 は , 蝋 梅 花 , 黄 梅 花 , 鉄 筷 子 花 な ど と 称 さ れ , 中 国 伝 統 医 学 (中 医 学 ) で は , 暑 気 あ た り で 胸 が つ か え て 苦 し く 喉 が 渇 く 症 状 や , 百 日 咳 な ど の 長 期 に わ た る 咳 , 気 滞 ( イ ラ イ ラ , 多 怒 , 不 眠 , 胸 苦 し さ , 嘔 気 な ど ) と 胃 の む か つ き な ど の 治 療 に 煎 じ 液 を 内 服 す る .1 7 ) ま た , 風 邪 や 高 血 圧 , リ ウ マ チ の 治 療 お よ び 鎮 咳 を 目 的 に 使 用 さ れ る .1 8 , 1 9 )

7 Figure 3. S t r u c t u r e s o f a l k a l o i d s ( 2 6 ― 2 9 ) a n d f l a v o n o i d s ( 6 , 9 , 1 2 , 1 5 a n d 3 0 ) f r o m t h e f l o w e r b u d s o f C . p r a e c o x . こ れ ま で に , 中 国 四 川 省 産 の 蝋 梅 花 を 抽 出 し て 得 ら れ る エ キ ス に B16 m el ano m a 4 A5 細 胞 に お け る テ オ フ ィ リ ン 刺 激 に よ る メ ラ ニ ン 産 生 を 顕 著 に 抑 制 す る こ と を 見 い だ さ れ て い る . ま た , そ の 活 性 成 分 が , (—)-chimonanthine (26) や ( — )- fo l i ca n t h i n e (2 7 ) な ど の ア ル カ ロ イ ド 成 分 で あ り , そ の 作 用 メ カ ニ ズ ム と し て t yrosinase お よ び TRP-1 mRNA の 発 現 を 抑 制 し て い る 事 を 明 ら か に し て い る .2 0 ) 著 者 は , 蝋 梅 花 の フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 に H epG2 細 胞 に お け る 脂 肪 蓄 積 の 抑 制 活 性 を 明 ら か に し た . ま た , こ れ ら の 知 見 か ら , 蝋 梅 花 は , 美 白 , ダ イ エ ッ ト 素 材 と し て 香 粧 品 や 健 康 食 品 素 材 と し て の 利 用 が 期 待 さ れ て い る . そ こ で , 蝋 梅 花 の 品 質 評 価 を 行 う 目 的 で , 主 要 活 性 成 分 で あ る 4 種 の ア ル カ ロ イ ド 成 分 (2 6― 2 9 ) と 5 種 の フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 (6, 9 , 1 2 , 1 5 お よ び 30) の HPLC を 用 い た 一 斉 定 量 法 を 開 発 し , 蝋 梅 花 の 市 場 品 の 品 質 評 価 を 行 っ た (Figure 3). そ の 結 果 , ア ル カ ロ イ ド 成 分 で は 産 地 の 違 い に よ る 顕 著 な 含 有 量 の 差 は 認 め ら れ な か っ た . 一 方 , フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 で は 四 川 省 産 の 検 体 に お い て rutin (15) が 他 の 産 地 と 比 較 し て 3 倍 以 上 多 く 含 有 さ れ て い た . Rutin (15) に は , ビ タ ミ ン P 作 用 な ど の 種 々 の 機 能 性 が 知 ら れ て N H N N H N H H H N N H N N meso-chimonanthine (28) (+)-calycanthine (29) R1 _R2 kaempferol (6) H H kaemferol 3-O-Rut (9) S1 H quercetin (12) H OH rutin (15) S1 OH

isorhamnetin 3-O-Rut (30) S1 OCH3

O HO OH O OH OR1 R2 S1= Glc6ー1Rha Glc: Rha: Rut: β-D-glucopyranosyl α-L-rhamnopyranosyl rutinoside R (–)-chimonanthine (26) H (–)-folicanthine (27) CH3 N N N H N H R R

8 お り , 蝋 梅 花 の 優 良 品 種 の 選 定 や 産 地 を 同 定 す る 指 標 と な り 得 る 結 果 と 考 え ら れ る . 蓮 花 蓮 花 蓮 花 蓮 花 (Nelumbo nucifera 花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部 ) の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 ハ ス (Nelumbo nucifera) は ハ ス 科 (Nelumbonaceae) ハ ス 属 の 多 年 生 の 水 生 植 物 で , 陸 上 生 活 に 適 応 し て 進 化 し た 高 等 植 物 で あ り な が ら 水 中 生 活 を す る よ う に な っ た 特 異 な 植 物 群 に 属 す る . イ ン ド が 原 産 地 と 言 わ れ る が , ア ジ ア か ら オ ー ス ト ラ リ ア に お よ ぶ 広 範 な 地 域 に 生 育 が 認 め ら れ , 日 本 に も 自 生 し て い た と も 考 え ら れ て い る . 花 期 は 7 月 か ら 8 月 で 早 朝 か ら 咲 き 始 め , 昼 に は 閉 じ , こ れ を 数 日 間 繰 り 返 し た 後 に 花 弁 が 散 り 花 托 が 残 る . ハ ス の 花 ( 蓮 花 ) は , 清 ら か さ や 聖 性 の 象 徴 と し て 神 話 や 聖 典 に 記 さ れ て い る . 中 国 北 宋 時 代 の 儒 学 者 の 著 書 の 中 に , 「 ハ ス は 泥 よ り 出 で て 泥 に 染 ま ら ず 」 と あ る よ う に , 沼 の 泥 の 中 か ら 生 え て 貴 高 く 咲 く 花 と , ロ ー タ ス 効 果 で 泥 水 が か か っ て も 弾 き 飛 ば す 凛 と し た 葉 を 持 つ 姿 が , 世 俗 の 欲 に ま み れ ず に 清 ら か に 生 き る こ と を 示 し て い る と 考 え ら れ て き た . ハ ス は 世 界 中 で 広 く 食 用 あ る い は 薬 用 に ，様 々 な 部 位 が 利 用 さ れ て お り , 種 子 を 蓮 子 ,2 1 ) 種 皮 を 蓮 衣 ,2 2 ) 胚 芽 を 蓮 子 芯 ,2 3 ) 雄 蕊 を 蓮 髭 ,2 3 ) 花 托 を 蓮 房 ,2 4 ) 葉 部 を 荷 葉 2 5 ) と 称 さ れ る . ま た , 日 本 薬 局 方 収 載 生 薬 で も あ る 蓮 肉 は ， 強 壮 ， 止 瀉 ， 止 渇 ， 鎮 嘔 ， 健 胃 薬 と し て 用 い る ほ か ， 啓 脾 湯 ， 清 心 蓮 子 飲 な ど の 漢 方 処 方 に 配 合 さ れ て い る . 花 蕾 部 で あ る 蓮 花 は , 中 医 学 で 血 流 を 改 善 し , 抗 炎 症 作 用 や 強 壮 作 用 が 伝 承 さ れ て お り ,2 6 ) ア ー ユ ル ヴ ェ ー ダ 医 学 で は 腹 部 の 疝 痛 や 血 性 帯 下 の 改 善 や 強 心 剤 と し て も 利 用 さ れ て い る .2 7 ) 著 者 は , 蓮 花 の 品 質 評 価 を 目 的 に , LC-MS を 用 い た 10 種 (31― 40) の ア ル カ ロ イ ド 成 分 の 一 斉 定 量 法 を 開 発 し た . 本 法 を 応 用 し て 蓮 花 に お け る ア ル カ ロ イ ド の 存 在 部 位 を 検 討 し た と こ ろ , 主 と し て 花 弁 に ア ル カ ロ イ ド が 存 在 す る と 言 っ た 興 味 深 い 知 見 を 得 た . 短 期 間 に 散 り 落 ち る 花 弁 に 強 い 生 物 活 性 を 有 す る ア ル カ ロ イ ド な ど の 二 次 代 謝 産 物 が 蓄 積 さ れ る こ と は 植 物 生 理 を 考 え る う え で も 興 味 深 い 結 果 で あ る と 考 え る . ま た , 蓮 花 の MeOH 抽 出 エ キ ス の ア ル カ ロ イ ド 含 量 と メ ラ ニ ン 産 生 抑 制 活 性 の 活 性 強 度 の 相 関 に つ い

9 て 検 討 し た 結 果 , 良 好 な 相 関 が 得 ら れ た こ と か ら , 蓮 花 の 品 質 評 価 に お い て , こ れ ら 含 有 ア ル カ ロ イ ド 成 分 (31― 40) を 定 量 分 析 す る こ と が 有 用 で あ る こ と を 示 す 結 果 で あ る と 考 え る . Figure 4. A p o r p h i n e a n d b e n z y l i s o q u i n o l i n e a l k a l o i d s ( 3 1 ― 4 0 ) f r o m l o t u s f l o w e r . ま た , 蓮 花 含 有 ア ル カ ロ イ ド の う ち , 特 に nornuciferine (32) な ど の N-ノ ル 型 ア ル カ ロ イ ド が 中 性 お よ び 塩 基 性 溶 液 中 で 非 常 に 不 安 定 で , 活 性 試 験 中 や 物 理 デ ー タ の 測 定 中 に お い て も 一 部 分 解 す る こ と が 判 明 し た . そ こ で , N- ノ ル 型 ア ル カ ロ イ ド の 安 定 性 を 評 価 す る 目 的 で 32 の 分 解 経 路 の 解 明 に 着 手 し た 結 果 , 大 気 中 の CO2 を 吸 収 し , カ ル バ ミ ン 酸 塩 が 形 成 さ れ る こ と を 明 ら か に し た . ま た , 得 ら れ た カ ル バ ミ ン 酸 塩 に つ い て MeOH で 溶 解 後 , HP LC に よ る 分 取 を 行 い 得 ら れ た カ ル バ ミ ン 酸 メ チ ル 体 に つ い て メ ラ ニ ン 産 生 抑 制 活 性 に つ い て 評 価 し た と こ ろ , nornuciferine と 比 較 し て そ の 活 性 強 度 が 5 分 の 1 に 減 弱 し た こ と か ら , ア ミ ド カ ル ボ ニ ル 構 造 に よ り 活 性 が 減 弱 し た こ と が 示 唆 さ れ た . こ の 結 果 , 蓮 花 ア ル カ ロ イ ド を 塩 酸 塩 に し て 定 量 用 の 標 品 と す る と と も に , 美 白 効 果 な ど の 活 性 評 価 を 再 検 討 す る 事 に よ っ て よ り 正 確 な 定 量 値 と メ ラ ニ ン 産 生 抑 制 活 性 値 を 明 ら か に す る こ と が で き た . N H3CO R2O H HO R1 N O CH3 H H3CO H3CO NH H3CO H OH HO norjuziphine (40) pronuciferine (35) R1 _R2 nuciferine (31) CH3 CH3 nornuciferine (32) H CH3 N-methylasimilobine (33) CH3 H asimilobine (34) H H N R2O H3CO H R 1 R1 _R2 armepaninel (36) CH₃ CH₃ norarmepavine (37) H CH₃ N-methylcoclaurine (38) CH₃ H coclaurine (39) H H

10

本

本

本

本

論

論

論

論

第 一 章 第 一 章 第 一 章 第 一 章 茶 花茶 花茶 花 (Camellia sinensis 花 蕾 部茶 花 花 蕾 部花 蕾 部花 蕾 部 ) の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価の 生 体 機 能 成 分 を 指 標 と し た 品 質 評 価 第 一 節 第 一 節 第 一 節 第 一 節 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離 第 一 項 第 一 項 第 一 項 第 一 項 福 建 省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離福 建 省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離福 建 省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離 福 建 省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離 近 年 , 日 本 や 台 湾 を は じ め と し た ア ジ ア 諸 国 に お い て , 抗 メ タ ボ 効 果 を 期 待 し た 茶 花 抽 出 物 を 含 有 し た 飲 料 や 機 能 性 食 品 な ど が 広 く 上 市 さ れ て い る . 茶 花 製 品 の 機 能 性 や 均 一 性 を 担 保 す る た め に 主 な 活 性 寄 与 成 分 で あ る ポ リ フ ェ ノ ー ル お よ び サ ポ ニ ン 含 量 の 定 量 法 の 開 発 が 求 め ら れ て い た . す で に , 日 本 お よ び 中 国 (福 建 省 , 安 徽 省 ) 産 茶 花 の 成 分 研 究 か ら , 既 知 成 分 と し て , フ ラ ボ ノ ー ル 配 糖 体 8 種 ， カ テ キ ン 類 5 種 ， 芳 香 族 配 糖 体 7 種 ， メ ガ ス テ ィ グ マ ン 配 糖 体 1 種 , サ ポ ニ ン 1 種 お よ び カ フ ェ イ ン を 単 離 同 定 さ れ る と と も に , 16 種 の サ ポ ニ ン 類 (chakasaponin I― VI, floratheasaponin A― J), フ ラ ボ ノ ー ル 配 糖 体 2 種 (chakaflavonoside A お よ び B) お よ び 芳 香 族 配 糖 体 2 種 (chakanoside I お よ び II） が 報 告 さ れ て い る . 5 , 7 , 8 , 1 0 , 1 2 - 1 4 ) 茶 花 の 産 地 別 の 成 分 変 動 な ど の 品 質 評 価 に 関 す る 知 見 を 得 る 目 的 で , 茶 花 の 血 中 中 性 脂 質 上 昇 抑 制 作 用 お よ び 抗 肥 満 作 用 な ど の メ タ ボ リ ッ ク シ ン ド ロ ー ム 予 防 効 果 が 明 ら か に さ れ て い る ポ リ フ ェ ノ ー ル 類 お よ び サ ポ ニ ン 類 に つ い て の 定 量 分 析 法 の 開 発 研 究 に 着 手 し た . 既 報 に 従 っ て , 定 量 分 析 に 供 す る 主 要 成 分 の 標 準 品 を 得 る た め の 抽 出 , 単 離 を 行 っ た .1 5 , 1 6 ) す な わ ち , 中 国 福 建 省 産 C . s i n en s i s 花 蕾 部 を M eO H で 加 熱 還 流 し た . 残 渣 を さ ら に 抽 出 し ， 抽 出 液 を 減 圧 下 で 溶 媒 を 留 去 し て MeOH 抽 出 エ キ ス (乾 燥 原 料 か ら の 収 率 23.1%) を 得 た ．

MeOH 抽 出 エ キ ス を EtOAc と H2O で 分 配 抽 出 し , E t OAc 移 行 部 (3 . 3 % )

お よ び H2O 移 行 部 を 得 た . 得 ら れ た H2O 移 行 部 を Di ai on HP -20 カ ラ ム ク

ロ マ ト グ ラ フ ィ ー (H2O → M eOH) に 付 し , H2O 溶 出 部 (1 0.5 %) お よ び M eOH 溶 出 部 (8 . 3 %) を 得 た .

11

フ ィ ー お よ び 逆 相 HPLC で 繰 り 返 し 分 離 精 製 し , 9 種 の フ ラ ボ ノ イ ド k aem p f ero l (6 , 0 . 0 0 0 8 0 %),2 8 ) k a em pfe ro l 3-O-

β

-D-gl u co p yr a no s i d e (7 , 0.2 1 %),2 8 ) k aem pf ero l 3 - O-

β

-D-g al a ct o p yr ano s i de ( 8, 0.11 %),2 9 ) k aem p ferol 3- O- ru t i n o s i d e (9 , 0.0 9 3% ),3 0 ) k aem p fero l 3 -O -

β

-D_{-gl uc op yr anos yl -(1 →3)-}

α

-L-rh am n op yr ano s yl - (1 →6)-β-D- gl u co p yr an o s i d e (1 0 , 0 .40 9% ),3 1 ) kaem pfe ro l 3-O -

β

-D-gl u cop yr ano s yl - (1 →3)-

α

-L- rh am n o p yr a n o s yl - (1→6)-β-D-g al a ct op yr an o s i de (11 , 0.0 47 %),3 1 ) q uer cet i n 3 -O -

β

-D- gl u co p yr an os i de (1 3 , 0 .00 6 3%),2 9 ) q uerc et i n 3 -O-

β

-D-g al a ct o p yr a n os i d e (1 4, 0 .00 32% )2 9 ) お よ び ru t i n (1 5 , 0 .02 1 % ),3 2 ) 4 種 の サ ポ ニ ン chakasaponin I (17, 0.207%),8 ) II (18 , 0 .15 3 %),8 ) お よ び III ( 1 9, 0. 194%)8 ) お よ び f l o rat h e as ap o ni n A (2 0 , 0.0 38%)5 )を 得 た (Chart 1). C h a r t 1 第 二 項 第 二 項 第 二 項 第 二 項 安 徽安 徽安 徽 省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離安 徽省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離省 産 茶 花 か ら の 含 有 成 分 の 抽 出 ・ 単 離 中 国 安 徽 省 産 C. sinensis, 花 部 を MeOH で 福 建 省 産 の 場 合 と 同 様 に 抽 出 し

Dried flower buds of C. sinensis collected in Fujian province (5.07 kg) MeOH, ∆, 3 h x 3 MeOH ext. (23.1%) EtOAc/H2O EtOAc layer (3.3%) Diaion HP-20 column (3.0 kg, H2O→MeOH)

MeOH eluate (8.3%) H₂O eluate (10.5%) SiO2column: CHCl3–MeOH–H2O

ODS column: MeOH–H2O

HPLC (ODS): MeOH–1% aqueous AcOH, CH3CN–1% aqueous AcOH

Flavonoids (9)

kaempferol (6, 0.00080%)

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (7, 0.21%) kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (8, 0.11%) kaempferol 3-O-rutinoside (9, 0.093%)

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L

-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-glucopyranoside (10, 0.409%) kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L

-rhamnopyranosyl-(1_→6)-β-D-galactopyranoside (11, 0.047%)

quercetin 3-O-β-D-glucopyranoside (13, 0.0063%) 3-O-β-D-galactopyranoside (14, 0.0032%) rutin (15, 0.021%) Saponins (4) chakasaponins I (17, 0.207%) chakasaponins II (18, 0.153%) chakasaponins III (19, 0.194%) floratheasaponin A (20, 0.038%)

12

て MeOH 抽 出 エ キ ス (38.5%) を 得 た . MeOH 抽 出 エ キ ス を EtOAc と H2O

で 分 配 抽 出 し , EtOAc 移 行 部 (7.7%) お よ び H2O 移 行 部 を 得 た . 水 移 行 部

に つ い て , BuOH で 分 配 抽 出 し , BuOH 移 行 部 (12.8 %) お よ び H2O 移 行 部 (18.1 % ) を 得 た .

Bu OH 移 行 部 を 順 相 シ リ カ ゲ ル , 逆 相 ODS カ ラ ム ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー お よ び 逆 相 HPLC で 繰 り 返 し 分 離 精 製 し , 5 種 の フ ラ ボ ノ イ ド kaempferol 3 -O-

β

-D-gl u co p yr an o s i d e (7 , 0 .0 0 64 % ), kaem pf erol 3 - O-

β

-D-g al act op yr an o s i d e (8 ,

0 .0 74 2 %), k aem p f ero l

3 -O-

β

-D_{-gl u co p yr an o s yl - (1→3)-}

α

-L_{-rh a m nop yr an os yl -(1 →6)-}

β

-D-gl u cop yr a no s i d e (10 , 0 . 3 6%), k a em p fero l 3 -O -

β

-D-gl u c op yr an os yl -(1 →3)-α-L-rh am n o p yr an o s yl - (1 →6)-β-D- gal a ct o p yr a n o s i d e (11, 0. 38 %) お よ び 3-O-

β

-D- gal act op yr ano s i d e (14 , 0. 00 2 4 %) お よ び ca ff ei n e (1 6 , 0.36 24 % ),3 3 ) 6 種 の サ ポ ニ ン fl orat h eas ap o n i n A (2 0, 0 . 0 1 3 %), B (2 1 , 0.11 %),5 ) C (2 2, 0 .0 54 % ),5 ) D (2 3 , 0 .1 2%),1 1 ) E (2 4, 0 . 2 5 %)1 1 ) お よ び F ( 2 5 , 0.13%)1 1 ) を 得 た (Chart 2).

C h a r t 2

Dried flower buds of C. sinensis collected in Anhui province (1.8 kg) MeOH, ∆, 3 h x 3

MeOH ext. (38.5%) EtOAc/H2O

EtOAc layer (7.7%)

BuOH eluate (12.8%) H2O eluate (18.1%) SiO2column: CHCl3–MeOH–H2O

ODS column: MeOH–H2O

HPLC (ODS): MeOH–1% aqueous AcOH, CH3CN–1% aqueous AcOH Flavonoids (5)

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranoside (7, 0.0064%) kaempferol 3-O-β-D-galactopyranoside (8, 0.0742%) kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L

-rhamnopyranosyl-(1_→6)-β-D-glucopyranoside (10, 0. 36%)

kaempferol 3-O-β-D-glucopyranosyl-(1→3)-α-L

-rhamnopyranosyl-(1→6)-β-D-galactopyranoside (11, 0.38%) 3-O-β-D-galactopyranoside (14, 0.0024%) Saponins (6) floratheasaponin A (20, 0.013%) floratheasaponin B (21, 0.11%) floratheasaponin C (22, 0.054%) floratheasaponin D (23, 0.12%) floratheasaponin E (24, 0.25%) floratheasaponin F (25, 0.13%) BuOH/H2O

13 第 二 節 第 二 節 第 二 節 第 二 節 LC-MS を用いたポリフェノール成分を用いたポリフェノール成分を用いたポリフェノール成分を用いたポリフェノール成分 (1―――15) および― およびおよびおよび caffeine (16) の定量分析の定量分析の定量分析 の定量分析 茶 花 の 品 質 評 価 お よ び 産 地 別 の 成 分 変 動 に 関 す る 知 見 を 得 る 目 的 で , 15 種 の 主 要 ポ リ フ ェ ノ ー ル 成 分 を 一 斉 定 量 す る た め , LC-MS を 用 い て 検 討 し た . そ の 結 果 , 5 種 類 の カ テ キ ン (1—5) お よ び 10 種 類 の フ ラ ボ ノ イ ド (6 — 1 5 ) お よ び c affei n e (1 6 ) の LC -M S 定 量 法 を 開 発 し た . 第 一 項 第 一 項 第 一 項 第 一 項 被 験 サ ン プ ル被 験 サ ン プ ル被 験 サ ン プ ル 被 験 サ ン プ ル 分 析 に は 24 種 の サ ン プ ル [ 中 国 種 (CSS) ： 中 国 福 建 省 産 6 検 体 (C S S -F1 — F6 ), 四 川 省 産 1 検 体 (C S S -S 1), 安 徽 省 産 1 検 体 (C S S -A1 ), 日 本 滋 賀 県 産 1 検 体 (CSS-J1), 台 湾 阿 里 山 産 1 検 体 (CSS-T1), 南 投 県 松 柏 嶺 産 翠 玉 茶 3 検 体 (CSS-T2 ― T4), 南 投 県 松 柏 嶺 産 金 萱 茶 2 検 体 (CSS-T5, T6), 南 投 県 松 柏 嶺 産 四 季 春 茶 3 検 体 (C S S -T7 ― T9 ), 台 東 県 鹿 野 郷 産 2 検 体 (CSS-T10, T11), 台 北 県 坪 林 郷 産 1 検 体 (CSS-T12) お よ び イ ン ド 産 2 検 体 (CSS-I1, I2) ； ア ッ サ ム 種 (CSA) ： イ ン ド 産 (CSA-I1)] を 使 用 し た (Fi gu re 5 ). 各 サ ン プ ル の 採 取 時 期 は , C S S -F3 , J 1 が 20 05 年 , C S S -F1, F2 , S 1 お よ び A1 が 2006 年 , CSS-T1― T12 が 2008 年 , CSS-F4― F6, I1, I2 お よ び CSA-I1 が 2010 年 で あ る (Table 1).

14

Table 1. Collection area and period of tea flower samples.

Sample No. Collecting area C o l l e c t i n g ye a r Camellia sinensis ( L. ) O . Ku n t z e CSS-F1 Fujian, China 2006 CSS-F2 Fujian, China 2006 CSS-F3 Fujian, China 2005 CSS-F4 Fujian, China 2010 CSS-F5 Fujian, China 2010 CSS-F6 Fujian, China 2010 CSS-S1 Sichuan, China 2006

CSS-A1 Anhui, China 2006

CSS-J1 Shiga, Japan 2005

CSS-T1 Alishan Township, Chiayi County 2008 CSS-T2 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Cui Yu tea) 2008 CSS-T3 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Cui Yu tea) 2008 CSS-T4 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Cui Yu tea) 2008 CSS-T5 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Chin Hsuan tea) 2008 CSS-T6 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Chin Hsuan tea) 2008 CSS-T7 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Sijichun tea) 2008 CSS-T8 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Sijichun tea) 2008 CSS-T9 Song Bo Ling, Mingjian Township, Nantou County (Sijichun tea) 2008 CSS-T10 Luye Township, Taitung County 2008 CSS-T11 Luye Township, Taitung County 2008 CSS-T12 Pinglin District, New Taipei City 2008

CSS-I1 Assam, India 2010

CSS-I2 Darjeeling, India 2010

Camellia sinensis L. var. assamica P i e r r e

CSA-I1 Assam, India 2010

南 投 県 松 柏 嶺 産 の サ ン プ ル で あ る 翠 玉 茶 (Cui Yu tea), 金 萱 茶 (Chin Hsuan tea) お よ び 四 季 春 茶 (Sijichun tea) は 台 湾 茶 の ブ ラ ン ド の 一 つ で あ り , 翠 玉 茶 は 別 名 台 茶 13 号 と も 呼 ば れ , ジ ャ ス ミ ン に 似 た 香 り と す っ き り と し た 味 を も ち , 金 萱 茶 は 別 名 台 茶 12 号 と 呼 ば れ , 際 立 つ 乳 香 が 特 徴 の 茶 で あ る . 四 季 春 茶 は 年 中 収 穫 が 可 能 で あ る た め こ の 名 が 付 け ら れ た .

15

Figure 5. Tea flower samples obtained from different regions.

第 二 項 第 二 項 第 二 項 第 二 項 試 料 調 製試 料 調 製試 料 調 製試 料 調 製 お よ び 分 析 条 件 の 検 討お よ び 分 析 条 件 の 検 討お よ び 分 析 条 件 の 検 討お よ び 分 析 条 件 の 検 討 被 験 サ ン プ ル を ミ ル ミ キ サ ー に て 粉 末 化 し , 18 号 ふ る い に か け 得 ら れ た 粉 末 サ ン プ ル に つ い て , 第 十 七 改 正 日 本 薬 局 方 試 験 法 の 乾 燥 減 量 の 項 に 従 っ て 乾 燥 減 量 を 算 出 し た (Table 2).

Ta b l e 2 . Loss of drying for tea flower samples.

Loss of drying (%)

CSS-F1 CSS-F2 CSS-F2 CSS-F4 CSS-F5 CSS-F6 CSS-S1 CSS-A1 CSS-J1 CSS-T1 CSS-T2 CSS-T3 9 . 7 6 9 . 9 0 11 . 3 5 1 0 . 8 0 1 0 . 3 7 9 . 7 6 11 . 0 2 1 2 . 4 3 1 5 . 7 5 11 . 5 4 6 . 8 3 6 . 2 3

Loss of drying (%)

CSS-T3 CSS-T5 CSS-T6 CSS-T7 CSS-T8 CSS-T9 CSS-T10 CSS-T11 CSS-T12 CSS-I1 CSS-I2 CSA-I1 6 . 6 0 6 . 4 2 6 . 5 1 6 . 8 1 6 . 2 0 6 . 5 7 8 . 5 5 8 . 9 4 9 . 2 9 11 . 1 2 8 . 9 8 1 7 . 7 8

16

分 析 に 用 い た 標 準 品 の う ち , 5 種 類 の カ テ キ ン (+)-catechin (1, MW: 290), (–)- ep i c at ec h i n (2 , M W: 2 90 ), (– )- epi ga l l o cat e chi n (3 , M W: 30 6), (– )- epi c at ec h i n 3 -O- g al l at e (4 , M W: 4 4 2 ) お よ び (–) -e pi gal l ocat echi n 3 -O- gal l at e (5, M W: 4 5 8 ) , k aem pf erol ( 6 , M W: 2 8 6 ), qu er cet i n (1 2 , M W: 3 02 ), qu e rcet i n 3 -O-

β

-D-gl uco p yr an o s i d e (1 3, M W: 464), rut i n (1 5 , M W: 6 10 ) お よ び ca ff ei n e (1 6) は 市 販 品 を 用 い た . そ の 他 の フ ラ ボ ノ イ ド 配 糖 体 で あ る k aem p fe r o l 3-O-

β

-D-gl uco p yr an o s i d e (7 , M W: 44 8) , kaem pf ero l 3 - O-

β

-D-gal act op yr an os i d e (8, M W: 4 4 8 ), k aem p f ero l 3 -O- ru t i nos i de (9, M W: 5 94 ), k a em p fe ro l 3 -O-

β

-D_{-gl uco p yr an o s yl - (1→3)-}

α

-L_{- rha m nop yr an os yl -(1 →6)-}

β

-D-gl u co p yra n o s i d

e (1 0 , M W: 75 6 ), kaem p fero l

3 -O-

β

-D_{-gl uco p yr an o s yl - (1→3)-}

α

-L_{- rha m nop yr an os yl -(1 →6)-}

β

-D-gal act op yr an o s i de (11 , M W: 7 56 ) お よ び q u e rc et i n 3- O-

β

-D-gal act o p yr an os i d e (1 4 , M W: 4 6 4 ) は , 福 建 省 産 茶 花 か ら 単 離 ・ 同 定 し た も の を 用 い た ( 第 一 章 , 第 一 節 参 照 ).1 5 , 1 6 )

各 標 準 溶 液 に つ い て は 精 密 に 秤 量 し , 50 % M e OH に て 1 .0, 2 .5 , 5 . 0 , 1 0

µ

g/ m L の 濃 度 に 希 釈 し た も の を 用 い , Tabl e 3 に 示 す 条 件 で 分 析 し た .

Table 3. Analytical conditions of catechins (1—5), flavonols (6—15), and caffeine (16).

Instrument Shimadzu LCMS-2010EV + Prominence Column Inertsil ODS-3 (2.1 mm i.d. × 100 mm, 3 µm) Detection UV (268 nm)

Mobile phase MeOH/0.1% aqueous formic acid (0 min, 10/90 → 20 min, 35/65 → 30–45 min hold, 70/30, v/v)

Flow rate 0.2 mL/min Column temp. 40°C Injection vol. 1 µL Ionization negative ESI

Fi gur e 6 に 示 す よ う に , k aem p fer ol 3-O-

β

-D-gl u co p yran o s i de (7 ) と k aem pf ero l 3 -O -ru t i n o s i d e (9 ) お よ び quer cet i n 3 - O-

β

-D-gl uco p yr an os i d e (1 3) と rutin (15) を 除 き , 良 好 な 分 離 が 得 ら れ る こ と が 確 認 さ れ た . 上 記 に つ い て は , 分 子 量 が 異 な る こ と か ら , LC-MS 分 析 の 適 用 に よ り 定 量 分 析 が 可 能 で あ る .

17

Figure 6. A typical LC-MS chromatogram of a standard solution mixture (each 10 ng) of catechins

(1—5), flavonols (6—15), and caffeine (16).

a) SIM chromatogram (negative ESI); b) HPLC chromatogram (UV: 268 nm)

バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 と し て , 検 量 線 作 成 , 繰 り 返 し 精 度 試 験 お よ び 添 加 回 収 試 験 を 実 施 し た . 各 濃 度 に 希 釈 し た 標 準 溶 液 (1—10 ng) を 用 い 作 成 し た 検 量 線 は , Table 4 に 示 す よ う に 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ た . す な わ ち , 化 合 物 1 — 15 に つ い て n eg at i v e ES I モ ー ド に お い て イ オ ン 強 度 と 濃 度 に 良 好 な 相 関 (R2 > 0 . 9 9 7 3 ) が 得 ら れ た . ま た , ca ffei n e (16 ) に つ い て は , n e g at i v e ES I モ ー ド に お い て 充 分 な イ オ ン 強 度 が 得 ら れ な か っ た が , UV (268 nm) に お け る ピ ー ク 面 積 と 濃 度 に 良 好 な 直 線 性 が 得 ら れ た . 加 え て , 各 化 合 物 の 検 出 限 界 (S/ N = 3) お よ び 定 量 限 界 (S / N = 1 0), 後 述 す る 抽 出 条 件 で 最 適 化 し た 5 0 % M eOH 加 熱 還 流 の 条 件 に て C S S -F1 を 抽 出 し た エ キ ス を 用 い た 日 間 お よ び 日 内 変 動 は そ れ ぞ れ RSD 値 で (0.73—12.5%) お よ び (2.67—13.2%) で あ っ た (Table 5). ま た , 添 加 回 収 試 験 に つ い て 検 討 し た と こ ろ , 82.4—113.8% の 範 囲 で あ っ た . (–)-epigallocatechin (3) (+)-catechin (1) caffeine (16) (–)-epigallocatechin 3-O-gallate (5) (–)-epicatechin (2) (–)-epicatechin 3-O-gallate (4) quercetin 3-O-Gal (14) quercetin 3-O-Glc (13) rutin (15) kaempferol 3-O-Glc-(1→3)-Rha-(1→6)-Gal (11) kaempferol 3-O-Glc-(1→3)-Rha-(1→6)-Glc (10) kaempferol 3-O-Gal (8) kaempferol 3-O-Glc (7) kaempferol 3-O-Rut (9) quercetin (12) kaempferol (6) 10 20 30 40 (min) (mV) 0 15 0 10 20 30 40 (min) (X 100,000) 0 1.5 0 m/z 305 for 3 m/z 289 for 1 and 2 m/z 457 for 5 m/z 441 for 4 m/z 463 for 14 and 13 m/z 609 for 15 m/z 755 for 11 and 10 m/z 447 for 8 and 7 m/z 593 for 9 m/z 301 for 12 m/z 285 for 6 3 7.5 a) HPLC クロマトグラム (UV: 268 nm)

18

Table 4. Linearities for catechins (1—5), flavonols (6—15) and caffeine (16).

Analyte Regression equationa Coefficient of determination (R2) (+)-Catechin (1) y = 42353x + 6693 0.9987 (–)-Epicatechin (2) y = 52356x + 9767 0.9979 (–)-Epigallocatechin (3) y = 26442x + 1773 0.9996 (–)-Epicatechin 3-O-gallate (4) y = 48062x – 2741 0.9999 (–)-Epigallocatechin 3-O-gallate (5) y = 27934x – 9074 0.9988 Kaempferol (6) y = 197930x + 38231 0.9987 Kaempferol 3-O-Glc (7) y = 98853x – 11811 0.9999 Kaempferol 3-O-Gal (8) y = 123645x – 11113 0.9998 Kaempferol 3-O-Rut (9) y = 113728x – 12120 1.000 Kaempferol 3-O-Glc-(1→ 3)-Rha-(1→ 6)-Glc (10) y = 70733x + 296 0.9998 Kaempferol 3-O-Glc-(1→ 3)-Rha-(1→ 6)-Gal (11) y = 55781x – 17 0.9998 Quercetin (12) y = 109473x + 7103 0.9973 Quercetin 3-O-Glc (13) y = 86923x – 866 0.9998 Quercetin 3-O-Gal (14) y = 106670x – 3648 0.9996 Rutin (15) y = 85140x + 1968 0.9998 Caffeine (16) y = 6983x – 149 1.000 a

In the regression equation, x is the concentration of the analyte solution (µg/mL), and y is the peak area of the analyte.

Table 5. Detection and quantitation limits, and precisions for catechins (1—5), flavonols (6—15) and

caffeine (16).

Analyte Detection limit (ng) Quantitation limit (ng) Precision a (RSD, %) Intra-day Inter-day 1 0.03 0.10 —b —b 2 0.02 0.07 3.62 9.69 3 0.04 0.13 2.87 8.23 4 0.04 0.13 1.40 8.81 5 0.13 0.42 0.91 7.52 6 0.02 0.05 2.96 6.26 7 0.03 0.10 3.81 9.66 8 0.03 0.10 7.46 7.22 9 0.02 0.08 3.21 8.92 10 0.05 0.16 3.11 5.25 11 0.06 0.21 3.00 7.15 12 0.03 0.10 —b —b 13 0.03 0.10 12.5 11.9 14 0.03 0.10 3.97 13.2 15 0.03 0.10 9.10 11.9 16 0.04 0.13 0.73 2.64 a

Precision of the analytical method were tested using the 50% methanolic extract of CSS-F1 (N = 5). b_{The content of the five replicate assays is less than quantitation limit.}

19 ま た , 抽 出 条 件 の 最 適 化 に つ い て は , 検 体 CSS-F1 を 用 い て MeOH, 50% M eOH な ら び に 水 に よ る 抽 出 溶 液 で , 2 時 間 加 還 流 熱 あ る い は 室 温 に よ る 超 音 波 抽 出 で 検 討 し た (Table 6). そ の 結 果 , 最 も 効 率 よ く カ テ キ ン や フ ラ ボ ノ イ ド 類 を 抽 出 で き た 50% MeOH 加 熱 抽 出 に よ り 試 料 溶 液 を 調 製 す る こ と と し た .

Table 6. Extraction efficiency of catechins (1—5), flavonols (6—15) and caffeine (16) from flower buds of C.

sinensis.

Extraction methoda Extraction yield (%)

Catechin contents (mg/g in the dry material)b

Caffeine content (mg/g in the dry material)b 1 2 3 4 5 Total 16 Methanol, reflux 24.0 < 0.05c 0.23 0.25 1.64 2.76 4.88 (89) 9.56 (91) 50% Methanol, reflux 37.7 < 0.05c 0.39 0.29 2.09 2.73 5.50 (100) 10.54 (100) H2O, reflux 36.2 0.05 0.14 < 0.07c 0.19 < 0.23c 0.38 (7) 8.98 (85) Methanol, sonication 21.2 < 0.05c 0.22 0.26 1.93 3.69 6.10 (111) 7.42 (70) 50% Methanol, sonication 22.9 < 0.05c 0.19 0.29 1.45 2.76 4.69 (85) 6.85 (65) H2O, sonication 16.9 < 0.05c 0.31 0.47 < 0.07c < 0.23c 0.78 (14) 3.61 (34)

Flavonol contents (mg/g in the dry material)b

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Total 0.25 0.93 0.27 1.12 4.80 0.82 < 0.05c 0.13 0.13 0.24 8.69 (82) 0.23 1.07 0.31 1.32 6.01 1.02 < 0.05c 0.17 0.14 0.29 10.56 (100) 0.02 0.60 0.19 0.97 4.80 0.81 < 0.05c 0.09 0.11 0.20 7.79 (74) 0.18 0.97 0.23 1.16 4.84 0.68 < 0.05c 0.12 0.12 0.22 8.52 (81) 0.09 0.75 0.22 0.95 4.28 0.67 < 0.05c 0.11 0.11 0.20 7.38 (70) 0.29 0.10 0.07 0.08 0.78 0.35 < 0.05c < 0.05c < 0.05c < 0.05c 1.67 (16) a

Extraction efficiency was tested using CSS-F1 (loss on drying: 9.76%).

b_{Relative value (%) against the content obtained by 50% methanol under reflux is given in parentheses.} c

20 第 三 項 第 三 項 第 三 項 第 三 項 カ テ キ ン お よ び フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 のカ テ キ ン お よ び フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 のカ テ キ ン お よ び フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 の 産 地 に よ るカ テ キ ン お よ び フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 の産 地 に よ る産 地 に よ る産 地 に よ る 変 動変 動変 動変 動 上 述 し た 条 件 に て 計 24 種 の 茶 花 (Figure 5) に つ い て 定 量 分 析 を 実 施 し た . そ の 結 果 , Table 7 お よ び 8 に 示 す よ う に , い ず れ の 産 地 の 茶 花 に お い て も カ テ キ ン 成 分 と し て は (–)-epigallocatechin 3-O-gallate (5) が 最 も 多 く 含 有 し て い た . ま た , フ ラ ボ ノ イ ド 成 分 と し て は , kaempferol 3 -O-

β

-D-gl u co p yr an o s yl - (1→3) -

α

-L- rh a m nop yr ano s yl -(1→6 )-

β

-D-gl uco p yr a n o s i d e (10 ) お よ び k aem p ferol 3 -O -

β

-D-gl uc o p yr anos yl -(1→3) -

α

-L-rh am n op yr ano s yl - (1→6 )-

β

-D-g al a ct o p yr a n o s i d e ( 11) を 最 も 多 く 含 有 し て い る こ と が 判 明 し た .

Table 7. Contents of catechins (1—5) and caffeine (16) in extracts from flower buds of C. sinensis from

different regions. Sample No. Loss of drying (%) Extracti on yield (%)

Catechin contents (mg/g in the dry material)

Caffeine content (mg/g in the dry material) 1 2 3 4 5 Total 16 Camellia sinensis CSS-F1 9.76 37.7 < 0.05 0.39 0.29 2.09 2.73 5.50 10.54 CSS-F2 9.90 50.4 0.25 1.15 1.39 5.07 10.18 18.04 9.00 CSS-F3 11.35 53.7 0.33 1.66 2.16 6.27 12.73 23.15 9.70 CSS-F4 10.80 50.2 0.06 1.37 1.80 5.63 12.12 20.98 8.30 CSS-F5 10.37 48.6 0.12 1.34 1.85 5.59 11.54 20.44 8.20 CSS-F6 9.87 48.8 0.19 1.33 1.88 5.52 10.99 19.91 7.50 CSS-S1 11.02 35.2 0.14 0.48 0.56 2.16 4.25 7.59 9.90 CSS-A1 12.43 47.8 0.31 1.17 0.83 7.90 9.80 20.01 8.40 CSS-J1 15.75 58.8 0.09 1.07 1.08 4.37 7.39 14.00 7.90 CSS-T1 11.54 55.7 0.76 3.45 7.40 7.80 19.71 39.12 8.40 CSS-T2 6.83 32.2 0.34 0.80 0.59 2.44 3.86 8.03 11.28 CSS-T3 6.23 34.2 0.36 0.97 1.17 3.51 6.96 12.97 10.50 CSS-T4 6.60 30.3 0.31 0.65 0.49 1.98 2.95 6.38 11.06 CSS-T5 6.42 33.2 0.31 0.56 0.49 2.38 3.32 7.06 9.11 CSS-T6 6.51 37.1 0.37 0.69 0.47 2.12 4.59 8.24 9.40 CSS-T7 6.81 35.5 0.41 1.23 1.32 2.55 3.34 8.85 9.15 CSS-T8 6.20 37.1 0.43 1.33 1.41 2.47 3.06 8.70 9.34 CSS-T9 6.57 33.4 0.36 1.12 0.80 2.46 2.33 7.07 10.04 CSS-T10 8.55 42.8 0.29 1.64 1.44 2.38 6.85 12.60 8.83 CSS-T11 8.94 43.4 0.34 1.59 1.51 2.64 6.42 12.50 8.28 CSS-T12 9.29 51.8 0.64 3.98 7.09 12.88 20.77 45.36 8.87 CSS-I1 11.12 45.7 0.31 0.90 1.50 5.30 10.62 18.63 10.50 CSS-I2 8.98 42.9 0.52 1.27 1.90 8.50 17.34 29.53 10.70

Camellia sinensis L. var. assamica

21

Table 8. Contents of flavonoids (6—15) in extracts from flower buds of C. sinensis fro m different regions.

こ の う ち , 福 建 省 産 [CSS-F1—F6 (10: 6.01—7.41 > 11: 1.02—2.08 mg/g)], 四 川 省 産 [CSS-S1 (10: 4.89 > 11: 0.95)] お よ び イ ン ド 産 [CSS-I1 (10: 1.18 > 11: 0 . 2 8 ), I2 (1 0: 3 . 3 7 > 11 : 1 . 7 9 )] 茶 花 は , 10 の 方 が 11 よ り も 3 — 5 倍 程 度 多 く 含 ま れ て い た . 一 方 , 安 徽 省 産 [CSS-A1 (10: 4.68, 11: 3.71)] お よ び 日 本 産 [CSS-J1 (10: 2.76, 11: 2.99)] は , ほ ぼ 同 程 度 含 有 し て お り , 産 地 に よ る 主 要 フ ラ ボ ノ イ ド 含 量 に 特 徴 が 認 め ら れ た (Figure 7). 台 湾 産 の 茶 花 に お い て は , 中 部 の 南 投 県 で 採 取 し た 四 季 春 茶 (CSS-T7 ― T9 ) に お い て は 化 合 物 10 と 11 は ほ ぼ 同 程 度 の 含 量 で あ り , 中 国 東 部 や 日 本 と 同 様 の パ タ ー ン を 示 し た . そ の ほ か の 検 体 (CSS-T1 ― 6, T10 ― 12) に お い て は 化 合 物 10 の 方 が 多 く 含 ま れ て お り , 中 国 西 部 や タ イ な ど と 同 様 の パ

Sample No. Flavonol contents (mg/g in the dry material)

6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 Total Camellia sinensis CSS-F1 0.23 1.07 0.31 1.32 6.01 1.02 < 0.05 0.17 0.14 0.29 10.56 CSS-F2 0.17 0.75 0.38 0.49 6.65 1.97 0.15 0.23 0.23 0.26 11.28 CSS-F3 0.15 0.96 0.41 0.48 6.12 2.08 0.15 0.29 0.25 0.29 11.18 CSS-F4 0.08 0.61 0.27 0.33 7.26 1.69 < 0.05 0.06 0.10 0.21 10.61 CSS-F5 0.10 0.68 0.29 0.43 7.41 1.63 < 0.05 0.08 0.13 0.19 10.94 CSS-F6 0.08 0.79 0.43 0.46 7.25 1.64 0.05 0.16 0.16 0.18 11.20 CSS-S1 0.29 0.90 0.34 1.10 4.89 0.95 0.13 0.21 0.21 0.37 9.39 CSS-A1 0.04 0.62 0.88 0.53 4.68 3.71 0.08 0.19 0.48 0.42 11.63 CSS-J1 0.12 0.21 0.87 0.15 2.76 2.99 < 0.05 < 0.05 0.43 0.18 7.71 CSS-T1 0.14 0.54 0.79 0.27 3.82 1.05 0.13 0.24 0.46 0.53 7.97 CSS-T2 0.13 1.30 0.46 2.61 5.83 0.79 0.23 0.52 0.53 1.27 13.67 CSS-T3 0.16 1.39 0.52 2.60 5.60 0.75 0.22 0.54 0.51 1.35 13.64 CSS-T4 0.16 0.97 0.39 1.81 4.43 0.74 0.23 0.40 0.40 0.97 10.50 CSS-T5 0.27 3.02 1.28 0.76 8.33 1.38 0.20 0.55 0.75 0.82 17.36 CSS-T6 0.20 2.46 1.01 0.59 5.95 1.01 0.24 0.46 0.55 0.64 13.11 CSS-T7 0.14 0.28 0.68 0.36 2.10 2.41 0.22 0.25 0.63 0.71 7.78 CSS-T8 0.12 0.29 0.70 0.38 2.09 2.34 0.21 0.26 0.69 0.79 7.71 CSS-T9 0.15 0.29 0.62 0.34 2.12 2.37 0.23 0.21 0.64 0.77 7.74 CSS-T10 0.25 2.55 1.53 0.36 3.37 0.61 0.20 0.55 0.90 0.40 10.72 CSS-T11 0.30 3.46 2.03 0.43 4.33 0.78 0.23 0.63 1.06 0.42 13.67 CSS-T12 0.14 0.46 0.86 0.32 4.66 1.73 0.14 0.25 0.51 0.52 9.59 CSS-I1 0.12 0.98 0.54 0.55 1.18 0.28 < 0.05 0.40 0.27 0.32 4.64 CSS-I2 0.06 1.03 0.95 0.70 3.37 1.79 < 0.05 0.27 0.32 0.32 8.81

Camellia sinensis L. var. assamica

22 タ ー ン を 示 し た (Figure 8).

Figure 7. Contents of principal flavonoid constituents (10 and 11) in tea flowers from different regions.

Figure 8. Contents of principal flavonoid constituents (10 and 11) in tea flowers from different regions in

23 第 三 節 第 三 節 第 三 節 第 三 節 HPLC を 用 い た サ ポ ニ ン 成 分 の 定 量 分 析を 用 い た サ ポ ニ ン 成 分 の 定 量 分 析を 用 い た サ ポ ニ ン 成 分 の 定 量 分 析を 用 い た サ ポ ニ ン 成 分 の 定 量 分 析 茶 花 に 含 有 さ れ る 特 徴 的 な 成 分 で , か つ , 茶 花 の 種 々 の 生 体 機 能 の 活 性 寄 与 成 分 で あ る サ ポ ニ ン は , 高 度 に 酸 化 さ れ た 五 環 性 ト リ テ ル ペ ン で あ る t heas ap o gen o l B あ る い は R1-b a rri ge n ol を ア グ リ コ ン と し , そ の 3 位 に オ

リ ゴ 糖 鎖 を 有 す る と と も に , ア シ ル 基 と し て

α

,

β

- 不 飽 和 エ ス テ ル カ ル ボ ニ ル 構 造 を 有 す る チ グ ロ イ ル (Tig) 基 お よ び ア ン ゲ ロ イ ル (Ang) 基 を 有 し て い る . ま た , 茶 花 含 有 サ ポ ニ ン 類 の 生 体 機 能 に つ い て の 構 造 活 性 相 関 研 究 に お い て , Tig 基 や Ang 基 な ど の ア シ ル 基 の 存 在 が 活 性 の 発 現 に 必 須 で あ る こ と を 見 い だ し て い る . そ の 構 造 上 の 特 徴 か ら , ア グ リ コ ン の 21 位 水 酸 基 部 分 に Tig 基 を 有 す る chakasaponin 類 [chakasaponin I— III (17—19)] と Ang 基 を 有 す る fl orat h eas ap o n i n 類 [ fl o rat h e as apon i n A—F (2 0 —2 5 )] の 2 系 統 に 大 別 さ れ る . こ れ ま で の 産 地 別 茶 花 を 用 い た 成 分 研 究 に お い て , 中 国 福 建 省 産 で は fl orat h eas ap o n i n 類 が 殆 ど 含 ま れ ず , c hakas apon i n I— III ( 17 — 1 9) が 主 要 サ ポ ニ ン と し て , 一 方 , 徽 省 産 や 四 川 省 産 で は chakasaponin 類 と fl orat h eas ap o n i n 類 が と も に 得 ら れ て い る な ど , 産 地 に よ っ て 含 有 サ ポ ニ ン の 分 布 と 含 量 に 差 異 が 認 め ら れ る . そ の た め , 含 有 サ ポ ニ ン に 関 す る 品 質 評 価 に お い て , chakasaponin 類 と floratheasaponin 類 を あ わ せ た 一 斉 分 析 が 望 ま し い こ と が う か が え る 結 果 を 得 て い る .1 6 ) そ こ で , 今 回 , こ れ ら の サ ポ ニ ン (17—25) の HPLC を 用 い た 一 斉 定 量 分 析 法 を 検 討 し た .

24 第 一 項 第 一 項 第 一 項 第 一 項 被 験被 験被 験 サ ン プ ル被 験サ ン プ ルサ ン プ ルサ ン プ ル 第 一 章 , 第 二 節 , 第 一 項 の 項 と 同 様 の サ ン プ ル を 用 い た . 第 二 項 第 二 項 第 二 項 第 二 項 試 料 調 製試 料 調 製試 料 調 製 お よ び 分 析 条 件 の 検 討試 料 調 製お よ び 分 析 条 件 の 検 討お よ び 分 析 条 件 の 検 討お よ び 分 析 条 件 の 検 討 乾 燥 減 量 に つ い て は , 第 一 章 , 第 二 節 , 第 二 項 と 同 様 に 実 施 し た . 分 析 に 用 い た 標 準 品 の う ち , Chakasaponin I—III (17—19) に つ い て は , 中 国 福 建 省 産 茶 花 か ら 単 離・同 定 し た も の を 用 い た . ま た , floratheasaponin A, D (20, 23), B, E (21 , 2 4) お よ び C , F (2 2, 2 5) は , そ れ ぞ れ お よ そ 1 : 1 の 割 合 の 標 準 品 が 得 ら れ る 安 徽 省 産 茶 花 か ら 単 離 ・ 同 定 し た も の を 用 い た (第 一 章 , 第 一 節 参 照 ).1 5 , 1 6 ) 各 標 準 溶 液 に つ い て は 精 密 に 秤 量 し , 50 % M eOH に て 5.0 , 1 0 , 2 0 , 5 0

µ

g/ m L の 濃 度 に 希 釈 し た も の を 用 い , Tabl e 9 に 示 す 条 件 で 分 析 し た .

Table 9. Analytical condition of saponins (17—25).

Instrument Shimadzu Prominence

Column Inertsil ODS-3 (2.1 mm i.d. × 100 mm, 3 µm)

Detection UV (230 nm)

Mobile phase MeOH/5 mM trifluoroacetic acid (65/35, v/v)

Flow rate 0.2 mL/min

Column temp. 40°C Injection vol. 10 µL Figure 9 に 標 準 溶 液 の HPLC ク ロ マ ト グ ラ ム (UV, 230 nm) を 示 す . そ の 結 果 , 本 条 件 で は floratheasaponin A (20) と D (23), B (21) と E (24) お よ び C (2 2 ) と F (2 5 ) は 分 離 さ れ な か っ た . こ れ ら は い ず れ も , 配 糖 体 構 造 の 2 ' ' ' 位 に 結 合 し た 構 成 糖 が

β

-D-x yl op yr an os e か , あ る い は

α

-L-rh am n op yr an o s e か の 違 い の み で あ り , 分 子 量 が 異 な る こ と か ら MS で の 検 出 を 試 み た が 十 分 な イ オ ン 化 強 度 が 得 ら れ ず 定 量 分 析 は 困 難 で あ っ た . そ こ で , 230 nm で 検 出 し , あ わ せ て 定 量 分 析 す る こ と と し た .

25

Figure 9. A typical HPLC chromatogram (UV: 230 nm) of a standard solution mixture (each 500 ng) of

saponins (17—25). バ リ デ ー シ ョ ン 試 験 と し て , 検 量 線 作 成 , 繰 り 返 し 精 度 試 験 お よ び 添 加 回 収 試 験 を 実 施 し た . 各 濃 度 に 希 釈 し た 標 準 溶 液 (50—500 ng) を 用 い 作 成 し た 検 量 線 は , Table 10 に 示 す よ う に 良 好 な 直 線 性 (R2 > 0.9 9 9) が 得 ら れ た . ま た , 各 化 合 物 の 検 出 限 界 は 1.1—3.8 ng で , 定 量 限 界 は 3.5—12.5 ng で あ っ た . 日 間 お よ び 日 内 変 動 に つ い て は , そ れ ぞ れ RSD 値 と し て 0.44—2.35% お よ び 0.61—6.12% で , ま た , 添 加 回 収 試 験 (91.0—110.6%) に つ い て も 検 討 し た と こ ろ , い ず れ も 良 好 な 回 収 率 を 示 し た (Table 11).

Table 10. Linearities of saponin constituents (17—25).

Analyte Regression Equationb Coefficient of determination (R2) Chakasaponin I (17) y = 16923.7x – 2786.5 0.9999 Chakasaponin II (18) y = 13832x + 4002.8 0.9998 Chakasaponin III (19) y = 12609x – 295.09 0.9999 Floratheasaponins A (20), D (23)a y = 8885.8x – 1234.9 1.0000 Floratheasaponins B (21), E (24)a y = 20990x + 2267.3 1.0000 Floratheasaponins C (22), F (25)a y = 9961.0x – 1533.1 0.9999 a

Floratheasaponins A (20) and D (23), B (21) and E (24), and C (22) and F (25) were hardly separable with each other under the conditions on chromatography.

b

In the regression equation, x is the concentration of the analyte solution (µg/mL), and y is the peak area of the analyte

chakasaponin III (19) chakasaponin I (17)

floratheasaponin A, D (20, 23) chakasaponin II (18) floratheasaponin B, E (21, 24) floratheasaponin C, F (22, 25) 10 20 30 40 (min) (mV) 0 5 10 0

26

Table 11. Detection and quantitation limits, and precisions of saponin constituents (17—25). Analyte Detection Limit

(ng) Quantitation Limit (ng) Precisionb (RSD, %) Intra-day Inter-day 17 1.1 3.6 0.44 0.88 18 1.6 5.3 1.83 2.34 19 1.1 3.5 0.69 0.61 20, 23a 2.1 6.8 1.45 2.72 21, 24a 1.9 6.5 1.71 1.67 22, 25a 3.8 12.5 2.35 6.12 a

Floratheasaponins A (20) and D (23), B (21) and E (24), and C (22) and F (25) were hardly separable with each other under the conditions on chromatography.

b

Precision of the analytical method were tested using the 50% methanolic extract of CSS-F1 (N = 5).

ま た , 第 一 章 , 第 二 節 , 第 二 項 の 項 と 同 様 に , CSS-F1 を 用 い て 抽 出 条 件 の 最 適 化 を お こ な っ た (Table 12). そ の 結 果 , 最 も 効 率 よ く サ ポ ニ ン 類 を 抽 出 で き た 50% MeOH 加 熱 抽 出 に よ り 試 料 溶 液 を 調 製 す る こ と と し た .

Table 12. Extraction efficiency of saponin constituents (17—25) from flower buds of C. sinensis.

Extraction method Extraction yield (%)

Saponin contents (mg/g from dry material)b

17 18 19 20, 23 21, 24 22, 25 Total saponins (17—25) Methanol, reflux 24.0 11.09 (89) 13.70 (81) 4.13 (89) 4.97 (82) 3.37 (80) 1.38 (86) 38.64 (84) 50% Methanol, reflux 37.7 12.47 (100) 16.85 (100) 4.65 (100) 6.09 (100) 4.24 (100) 1.59 (100) 45.89 (100) H2O, reflux 36.2 5.15 (41) 11.28 (67) 2.45 (53) 4.34 (71) 2.52 (59) 0.90 (57) 26.64 (58) Methanol, sonication 21.2 11.91 (95) 15.54 (92) 4.51 (97) 3.65 (60) 2.68 (63) 1.10 (69) 39.38 (86) 50% Methanol, sonication 22.9 10.45 (84) 13.46 (80) 4.16 (90) 3.53 (58) 2.41 (57) 0.94 (59) 34.96 (76) H2O, sonication 16.9 2.87 (23) 5.71 (34) 1.48 (32) 1.44 (24) 1.10 (26) 0.39 (25) 13.00 (28) a

Extraction efficiency was tested using CSS-F1 (loss on drying: 9.76%). b

27 第 二 項 第 二 項 第 二 項 第 二 項 サ ポ ニ ン 成 分 のサ ポ ニ ン 成 分 のサ ポ ニ ン 成 分 の 産 地 に よ るサ ポ ニ ン 成 分 の産 地 に よ る産 地 に よ る産 地 に よ る 変 動変 動変 動変 動 Table 13 に 示 す よ う に , 福 建 省 産 (CSS-F1—F6) お よ び 四 川 省 産 (C S S -S 1 ) 茶 花 は c h ak as ap o ni n 類 [ chak as a po n i n I— III (17 —1 9 )] が fl orat h eas ap o n i n 類 [ fl o rat h eas ap o ni n A— F (2 0— 25 )] よ り も 多 く 含 有 し て お り , と り わ け , chakasaponin II (18) が 最 も 多 く 含 有 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た . 一 方 , 安 徽 省 産 (CSS-A1) お よ び 日 本 産 (CSS-J1) 茶 花 は , fl orat h eas ap o n i n 類 の 方 が ch a kas a pon i n 類 と 比 べ て 多 く 含 有 さ れ て い る こ と が 判 明 し た (Figure 12). 台 湾 に お い て は , 北 部 の 台 北 県 坪 林 郷 で 採 取 さ れ た 検 体 (CSS-T12) と , 中 部 阿 里 山 か ら 採 取 し た 検 体 (CSS-T1) に お い て , chakasaponin 類 の 含 有 量 の 方 が floratheasaponin 類 よ り も 多 く , 中 国 西 部 お よ び , イ ン ド な ど と 同 様 の パ タ ー ン で あ る こ と が 明 ら か に な っ た . そ の ほ か の 検 体 (CSS-T2 ― T11) に お い て は floratheasaponin 類 の 方 が 多 く 含 ま れ て お り , 中 国 東 部 や 日 本 と 同 様 の パ タ ー ン を 示 し た (Figure 11). 台 湾 に は チ ャ は 自 生 し て お ら ず , 対 岸 に 位 置 す る 中 国 最 大 の チ ャ の 産 地 で あ る 福 建 省 か ら 伝 播 し た と 考 え ら れ て い る . 一 方 , 明 治 期 に 日 本 産 の チ ャ の 栽 培 法 や 加 工 法 が 導 入 さ れ て 台 湾 の 茶 産 業 が 飛 躍 的 に 発 展 し た と 伝 え ら れ る . 今 回 の 分 析 結 果 は , こ れ ら の 台 湾 の チ ャ 伝 来 の 歴 史 を 支 持 す る も の と 考 え ら れ る .