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〈原著〉urokinase-type plasminogen activatorおよびurokinase-type plasminogen activator receptor遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮創傷治癒過程の検討

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Academic year: 2021

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(1)近畿大医誌(MedJKi nkiUni v)第37巻1,2号. 31∼4 3 2 01 2. 3 1. u r o ki n a s e t y p epl a s mi nog e na c t i va t orおよび u r o ki na s e t y p ep l a s mi no ge na c t i va t o rr e c e p t o r 遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮 児 玉. 傷治癒過程の検討. 彩. 近畿大学医学部眼科学教室. 抄. 録. 角膜上皮欠損を生じた際,角膜上皮の速やかな修復は病原体の角膜内への侵入を防ぎ,角膜障害を予防する上で 重要である.角膜上皮. 傷治癒過程では,角膜上皮細胞間あるいは角膜上皮細胞細胞外基質間で種々の因子が,複. 雑にかつ協調的に働いている.その中で,フィブロネクチンに代表される細胞外基質の発現による細胞接着,およ び線溶系因子による細胞外基質の. 解過程は重要な役割を果たしていると. 近年,uPA の特異的なレセプターである uPARは,uPA の細胞外基質. えられる. 解作用の制御の他に細胞内シグナル. 伝達に関与し,インテグリンやビトロネクチンの発現の増強,線維化の促進等に関与していることが報告されてい る. 本研究では角膜上皮. 傷治癒過程における u-PA,u-PARの役割を検討するために,u-PA욹 ,u-PA울 ,t 웘 욹 웘 울. ,t PA욹웘 욹 PA울 웘 울,u-PAR욹 웘 욹,u-PAR울 웘 울マウスを用いた.角膜上皮欠損モデルを作成し,経時的に角膜を観察し たところ,uPA욹 웘 욹では上皮欠損の修復が,uPA울 웘 울に比べ有意に遅 有意な遅. していた.一方,t PA욹 웘 욹,uPAR욹 웘 욹では. を認めなかった.また組織学的評価でも,uPA욹 웘 욹では上皮の再被覆が遅. していた.また,上皮修復. 時の角膜実質への炎症細胞浸潤を検討するため,角膜切片に NI ,F4 / MPR1 4 8 0免疫染色を施行したところ,uPA울웘 울群では,u-PA욹웘 욹群と比較して浸潤してきた好中球を有意に多く認めた.しかし,両群ともにマクロファー ジの浸潤はほとんど認めなかった.免疫組織学的検討では,uPARは角膜上皮 囲の角膜上皮細胞に発現し,傷害が刺激となって発現すると. 傷治癒過程で,角膜上皮欠損部周. えられた.角膜上皮欠損モデルの角膜サンプルに対. する f i nz ymogr aphyでは, i br i ne nz ymogr aphyにおいて,uPA울 웘 울群では経時的に uPA の増加を認め,ge l at u-PA울웘 울,u-PAR욹웘 욹,u-PAR울웘 울群で経時的に MMP-9の増加を認めたが,u-PA욹 웘 욹群では他の群と比較して MMP9活性は有意に低かった. 本研究の結果から,uPA は角膜上皮細胞の移動,MMP9の発現,好中球の角膜実質への浸潤に関与している ことが明らかとなった.さらに,上皮の移動,MMP9の発現に対する uPA の作用は uPARを介さないことが 示唆され,u-PARは移動する角膜上皮細胞に限局して発現するが,上皮欠損修復速度には影響を与えず,MMP9の活性化に直接関与していないと Ke ywords:角膜上皮欠損修復,. えられた. ,u-PA r 傷治癒,ur nas e t ypepl as mi noge nac t i vat or( uPA) e c ept or( u oki. -PAR),mat r i xme t al l opr ot e i nas e( MMP). Ⅰ.緒. 言. 角膜は,角膜上皮層,角膜実質層,角膜内皮層の. らが特有の作用を発現することで,角膜はその恒常 性を維持している. 角膜上皮層は56層の層構造を 成しており,角膜上皮細胞は最外層から順に表層細. 3層構造から成り立っている.正常な環境下では,. 胞,翼細胞,基底細胞の3種類の細胞に. 各層にはそれぞれ高度に. 化した細胞(角膜上皮細. 基底細胞はボーマン層に隣接した基底膜に接着して. 胞,角膜実質細胞,角膜内皮細胞) が存在し웋 ,それ 웦 워. いる웋 .角膜上皮は直接外界に接しており,その重要 웦 워. 大阪府大阪狭山市大野東3 77 2 (〒5 8 98 5 11 ) 受付 平成2 3 年1 0 月3 1 日,受理 平成2 3 年1 1 月2 2日. けられ,.

(2) 3 2. 児 玉. 彩. な役割は外界からの傷害に対する防御であり,傷害. 線溶系因子が角膜上皮の. を受けた場合には,角膜上皮細胞は高い増殖能を有. を検討した.. するため,速やかに上皮修復を行うことができる웍 .. 傷治癒過程に与える影響. Ⅱ.材料と方法. 角膜上皮の正常な修復は,病原体の角膜内への侵入 を防ぎ,2次的な角膜障害を予防する上で非常に重. 1)細胞培養. 要であるが,糖尿病角膜症,栄養障害性角膜潰瘍な. ヒト角膜上皮細胞,human c or ne al e pi t he l i al ( )は,佐々木香る先生より 与を受け l s HCEC cel. どの場合,従来の眼科学的治療に抵抗し,角膜上皮 欠損がしばしば遷. 化する웎 . 웦 웏 角膜上皮が傷害を受けて角膜上皮欠損を来した場. た SV40不死化細胞株を 用した워 .Sugi 월 okaら워 웋 の報告に準じて,1 0% f ( ) , at albovi nes e r um FBS. 合,通常は受傷後,数時間以内に周辺の角膜上皮細. )を 含 む, Dul gent amyci n(0.8 g/ml beccos /F12 modi f i e d Eagl es me di um(DMEM,Gi bc o). 胞が欠損部位への伸展,移動を開始し,まず1層の 上皮細胞層が欠損部を被覆する원 .さらに再被覆し 욹 웒 た上皮は数週間で57層の完全な層構造に戻る. そ. (1:1)培養液で継代培養した.初代の培養ヒト角. の過程では,角膜上皮細胞間あるいは角膜上皮細胞 細胞外基質間で, 種々の因子が複雑にかつ協調的に. Shi r aneら워 워の報告に準じて,角膜上皮細胞と角膜 内皮細胞を除去し,1 0 % FBSを含む,DMEM 培養. 働いている.その中で,フィブロネクチンに代表さ. 液で継代培養した.培養ヒト角膜実質細胞は,本培. 膜実質細胞 humanc (HCK)は, or nealke r at oc yt e. れる細胞外基質の発現による細胞接着,あるいは線. 養条件で3 0 世代以上継代可能であることを確認し,. 溶系因子による細胞外基質の. 本実験では,実験終了まで. 果たしていると. 解は中心的な役割を. えられている웓 . 욹 웋 웍 解する生理反応웋 웎の. 線溶系には血栓を溶かして. 裂回数のほぼ同じ細胞. 集団を う目的で,培養6∼8代目の HCK を. 用. した.細胞はすべて37 ℃,CO욽5%の条件下で培養,. 他に,細胞性線溶と呼ばれる反応系がある.これは,. 維持した.. 線溶系因子が細胞表面の受容体に結合し,細胞周囲. 2)マウス. 解活性の発現や制御を行うと共に,細胞. 本研究は,近畿大学医学部動物実験委員会の承認. 内シグナル伝達物質の誘導に関与する反応系であ. を受け(No. ,動物の愛護および管 KDMS2 00 3 7) 理に関する法律,基本指針に基づいて作成された近. での蛋白. る웋 .線溶反応の中心的役割を担っているのは, 웏 웦 웋 원 pl as mi nogenpl as mi ns ys t em であり,通常 pl as mi n. 畿大学医学部動物実験規程に準じて実施した.実験. は,不活性の前駆体である pl as mi nogenとして血液. には1 2 16 週齢の u욹)マウ PA 遺伝子欠損(uPA욹웘. 中に存在している.線溶の発動には線溶活性化酵素 である pl nogenac t i vat orによる pl as mi nogen as mi. ス,およびその野生型(uPA울웘 울)マウス,t PA 遺 伝子欠損(t -PA욹웘 )マウス,およびその野生型(t 욹. の活性化が重要であり,pl as mi noge n ac t i vat orに は,t ( i s s uet ypepl as mi noge nact i vat or tPA)と. )マ PA울웘 울)マウス,u-PAR遺伝子欠損(uPAR욹 웘 욹 ウス,およびその野生型(u) マウスを 用 PAR울 웘 울. (uur oki nas e t ypepl as mi noge nac t i vat or PA)の 2種類が存在する.t -PA の作用は主に f i br i nの除. した워 .実験動物には固形飼料,水を自由に摂取さ 웍 웦 워 웎. 去であり,uPA の作用は種々の mat r i x me t al l o(MMP)や gr pr ot ei nas e owt hf ac t orを活性化させ ることによって,細胞周囲の蛋白. 解に働く웋 .u웑. as PA は,そのレセプターである ur oki nas e t ypepl (u-PAR)と高い親和 mi nogenac t i vat orr ec e pt or 性で結合する.そして uPA は,その酵素活性を維 持することにより,局所での pl as mi noge nの活性化. せ,室温(2 2 ℃,湿度55 %の明暗調節環境下)で飼 育した. 3)Fi br i nenz ymogr aphyによる HCEC,HCK の 上清および細胞溶解液の PA 活性の測定 ×1 0 5mm マイク HCECおよび HCK を 1 웏個で3 ロプレートに播種し,10 % FBSを含む DMEM 培 養 液 で24 時 間 培 養 し た.そ の 後,FBS無 添 加 の. を効率よく行う.さらに,uPARから細胞内へのシ. 8 時間後に上清と細胞溶 DMEM 培養液に 換し,4 解液を回収した.リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で. グナルを惹起することで,種々の細胞の機能に関与. 2回洗浄した後,1mlの PBSを加え,セルスクレイ. している웋 .角膜上皮の 傷治癒過程において 웏 웦 웋 웒 웦 웋 웓 も,角膜上皮細胞の細胞膜表面における局所的な線. パーで細胞を剥離し,エッペンドルフチューブに回. 溶反応にはそれぞれの線溶系因子の発現とともに,. した後,Cel ( Lyt i cMCel lLys i sRe age n tSi gma,St . 9 2 lと c s ,MO,USA)1 oc kt ai lofpr ot e as e Loui. 線溶系因子に対する受容体の発現が重要であると えられる.そこで,本研究では,線溶系因子遺伝子 欠損マウスを用いて角膜上皮欠損モデルを作成し,. 収し1 , 0 00 ×g ,5 間4℃で遠心した.上清を除去. (Roche Di i nhi bi t or agnos t i c s Cor por at i on, I n5 間静 di anapol i s ,I N, USA)8 lを加え,氷上で1.

(3) 線溶系遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮. 傷治癒過程の検討. 33. 置した.1 7 ,0 0 0×g ,1 5 ,4℃で遠心し,得られた. 微鏡下に定期的に観察し,フルオレセイン染色下に. 上清を細胞溶解液として 用した.f 5 5 i br i noge n0. 0 5 6NI 0 mg/ mlと t hr ombi n0. H U/ mlを 含 ん だ1 % pol yacr yl ami deのゲルを作成し,ゲルの各レー. 24時間後および48 時間後に写真撮影を行った.これ を画像解析ソフト ar e a meas ur e me nt s of t war e (Ar msSys t em,東京)に取り込み,上皮欠損面積を. ンにサンプルをいれ,SDS電気泳動を行った워 .泳動 웏 後,ゲルを2. 5 % Tr i t onX1 00溶液中に1時間浸漬. 計測した(各群 n=4 ).. した後,グリシン緩衝液(0 .1M. uPA욹 웘 욹マウス,u-PA울 웘 울マウスに,角膜上皮欠 損 作 成 の2 4 時 間 後 お よ び4 8 時 間 後 に,s odi um. Gl yci ne-NaOH . 4 )に3 7 ℃で36 時間浸漬した.0.5 % f e r , pH 8 buf ( )( Coomas s i eBr i l l i antBl ueR 2 50 CBB Si gma, St .Loui s , MO,USA)で1時間染色した後,脱色液. 7)組織学的検討. pe nt obar bi t al静脈注射でマウスを麻酔死させ,速や かに眼球を摘出した.その後 SuperFi (倉敷紡績, x. (3 0% met ,1 0% ac hanol et i cac i d)で脱色した.そ. 大阪)で2 4 時間固定した.パラフィン包埋した後,. の結果を LASt e m(富士フイルム,東京) 1 00 0s ys. 4 m 薄切切片を作成し,he (HE) mat oxyl i ne os i n 染色を施行した.. で取り込んだ後,各バンドの de ns i t yを計測した(各 群 n=4 ) . 4)Wes t er nbl ot法による HCEC,HCK における. 8)u-PA울웘 울マウス角膜上皮欠損モデルに対する u -PA 阻害剤の投与. uPAR発現の検討 ×1 0웏個で3 5mm マイク HCECおよび HCK を 1. 웘 울マウスに,上記の方法で角膜上皮欠損を uPA울 作成した後,選択的な u-PA 阻害剤である u-PA. ロプレートに播種し, 10 0 %コンフルエントの状態ま. (Ame s t op좲 r i can Di agnos t i ca, St amf or d, CT, . 2ml (1mg/ USA)を静脈注射で0 kg)と点眼で 2. で培養した.細胞を PBSで洗浄した後,細胞溶解液 を回収して. 用した. 412 %ポリアクリルアミドゲ. 0 0 ル(I nvi t r oge n,Car l s bad,CA,USA)を用いて2 V,50 で 電 気 泳 動 を 行 っ た 後, PVDF膜 (I nvi t r ogen,Car l s bad,CA,USA)に転写した.そ の後,0 . 1 % Twe 0mM Tr en20を含む5 i s Buf f er ed. (2 0 0 g/ )を12 時間毎に投与した.cont l ml r ol群に は生理食塩水を投与した.フルオレセイン染色を行 った後,画像解析ソフトを用いて上皮欠損面積を測 定した(各群 n=4) . 9)RT-PCR法による I CAM -1および I L-1αの. 4 (TBSSal i nepH 7. T)で洗浄し,TBS-T 溶液で 調整した5%スキムミルク(Di f c o윣 윃 Ski m Mi l k,. mRNA 発現解析 u-PA욹 웘 욹マ ウ ス,u-PA울 웘 울マ ウ ス を s odi um. 0 間浸漬した.TBS-T Wako,大阪)に,室温で6 で洗浄後,TBS00 倍希釈した抗 uT で5 PAR抗体. pe nt obar bi t alで麻酔死させて,速やかに角膜片を摘 出した.角膜片からの全 RNA の抽出に I SOGENE. (R&DSys t emsMi nne apol i s , MN,USA)に PVDF 膜を浸し,4℃で一晩浸漬した.その後,TBSTで 洗浄し,hor s er adi s h pe r oxi das e c onj ugat ed don(GE Heal key ant i mous eI gG ant i bodi e s t hcar e. (Ni ,富山)を用いた.Supe 좲Ⅲ ppon Ge ne r Sc r i pt one s t ep RTPCR Sys t e m wi t h Pl at i num좲Taq ( Hi ghFi de l i t y I nvi t r oge n,Car l s bad,CA,USA) と サ ー マ ル サ イ ク ラ ー( T3t hermocycl er,. ,東京)に1時間,室温で震盪しながら Bi oSc i e nc e s 反応させた.その後,TBS-T で洗浄し,陽性シグナ. ,および表1に示 Bi ome t r a,G썥 ot t i nge n,Ge r many) す PCRプライマーを用いて PCR反応を行い,各遺. ルを e nz yme l i nkedche mi l umi ne s c ence(ECL)ki t ,東京)によって検 (GE Heal e s t hc ar eBi oSc i e nc. 5 秒 伝子を増幅した.PCR反応(9 5℃2 間/9 4 ℃1 間,5 2 ℃3 0 秒間,6 8℃1 間を1サイクルとして3 2. 出し,その結果を LAS10 0 0s ys t e mで 5)マウス角膜上皮欠損モデルの作成. 析した.. -PA욹 uPA욹웘 욹マウス,u-PA울웘 울マウス,t 웘 욹マウ ス,t PA울 웘 울マウス,uPAR욹 웘 욹マウス,u-PAR울 웘 울 マウスを用い,5 0mg/ kgの s odi um pe nt obar bi t al を 腹 腔 内 に 注 射 し,麻 酔 し た 後,0.4 % oxybupr oc ai nehydr oc hl or i deを点眼した.マウスの角膜 中央部(直径 3mm)の上皮を実体顕微鏡(Ni kon, 東京)下に St (MANI , r ai ghtmi c r os ur ge r ybl ade 栃木)を用いて擦過し,完全に剥離した. 6)マウスの前眼部観察 角膜上皮欠損部の治癒過程を治癒するまで実体顕. サイクル/ 6 8℃5. 間)終了後,得られた PCR産物 を1%濃度アガロースゲル電気泳動法にて 離し, エチジウムブロマイドで染色し,UV イルミネータ ー(Ge lDoc2 0 0 0,Bi o Rad,東京)でバンドを検 出した.その後,画像解析ウェア(I mageJ ,NI H, ) を用いて,各遺伝子のバンド Bet he s da,MD,USA 濃度を β-act ). i nの相対値として求めた(各群 n=3 10)免疫蛍光染色 4 時間後,2 8 uPA울 웘 울マウスの角膜上皮欠損作成2 時間後および3 6 時間後に上記の方法によって作成し た切片を脱パラフィン後,Tar t r i e valSol uge tRe 0)(DAKO,Gl t i on(x1 os t r up,Denmar k)で20 間.

(4) 3 4. 児 玉. 表쏯 RT-PCR法に. 彩. 用したプライマーの塩基配列. PCR産物 I CAM1 I L-1 α β-act i n. 塩基配列 For war d:5GGAGCAAGACTGTGAACACG3 :5Re ve r s e GAGAACCACTGCTAGTCCAC3 For war d:5TGGCCAAAGTTCCTGACTTGTTTG-3 Rever s e:5-CAGGTCATTTAACCAAGTGGTGCT-3 For war d:5TTCTACAATGAGCTGCGTGTGGC3 :5Re ve r s e CTCATAGCTCTTCTCCAGGGAGGA3. 1 2 0℃で 加 温 し,抗 原 の 賦 活 化 を 行 っ た.TNT (0 . 15M NaCl ,0 . 05 % Twe . 1 buf f e r e n2 0を含む0 ,pH 7 .5 ) で洗浄後,0 . 3% H욽 / M Tr i s HCl O욽 me t hanolで内因性ペルオキシダーゼの不活化を行い,. [SDS] 5 %s . 02 f at e ,0. odi um de oxychol at e ,and0 %s 0 0 lで乳化した後,遠心 離 odi um az i de)2 (1 7 ,0 0 0 ×g ,5. 間,4℃)し,上清をサンプルと. . 1 5M NaClを含む0 . 1M Tr -HCl ,pH TNB(0 i s 7.5,0.5% Bl ocki ng Reagent[ Per ki nEl mer ,. した.0 .5 5mg/ . 05 6NI mlの f i br i noge nと0 H U/ % pol mlの t hr ombi nを含んだ10 yac r yl ami deのゲ ルを作成し,ゲルの各レーンにサンプルをのせ,. Wal t ham,MA, USA])で1時間浸漬した.その後, uPARに対する一次抗体(1:1 00 0;Sant a Cr uz. 5 % SDS電 気 泳 動 を 行 っ た.泳 動 後,ゲ ル を2. Tr i t onX1 00s ol ut i onで1時間洗浄し,グリシン緩. Bi ot e chnol ogy,Sant a Cr uz ,CA,USA)と反応さ せ,4℃で一晩浸漬した.TNT was hbuf f erで洗浄. 衝液(0 .1M Gl -NaOH buf 4)で36 yci ne f e r ,pH 8. 時間,37 ℃で反応させた.0 . 5% CBBで1時間染色. した後,ペルオキシダーゼ標識された二次抗体 I gG-. した後,脱色液(3 0% met 0% ac hanol ,1 et i cac i d). of i neSi mpl eSt ai n,Ni c hi r e iBi os ci enHRP(Hi s t ,東 京)を 添 加 し,3 0 間 浸 漬 し た.TSA c e s. で脱色した.その結果を LAS-1 t e m で取り 0 00s ys. (t yr ami des i gnalampl i f i c at i on)法(TSA PLUS; Pe r ki nEl me r ,Wal t ham,MA,USA)により可視化 し,蛍光顕微鏡(Zei Axi opht of l uor e s encemi cr os s s c ope,G썥 ot t i ngen,Ge r many)下で観察した.核染色 には 4,6 -di (DAPI;Ve ami di nophenyl i ndol e ct or. 込んだ後,各バンドの dens i t yを計測した(各群 n= 3). 12 )角膜上皮欠損モデルにおける gel at i nzymogr aphyによる MMP活性の測定 f i br i nenzymogr aphy用に作成した角膜上皮欠損 モデル作成1 2 時間後,24 時間後,および4 8時間後の. l i ngame,CA,USA)を用いた. Labor at or i es ,Bur また,uPA욹 웘 욹マウス,および u-PA울 웘 울マウスの. 角膜サンプルを Ge l at i nZymoEl e ct r ophor e s i sKi t (Li at or y Company,山形)のゲルを用い f eLabor. 角膜上皮欠損作成2 4 時間後の角膜組織切片を脱パラ. て,SDS電気泳動を行った.1時間洗浄後,酵素反 応液で3 6時間,37 ℃で反応させた.0 . 5 % CBBで1. フィン後,上記の方法でブロッキングまで行い, (1:10 NI MP-R14 0 0;abc am, St amf or d, CT, あるいは,F4 / (1:10 USA) 80 0 0;Ser ot e c ,Oxf or d, に対する一次抗体と反応させ,4℃で一晩浸漬 UK) した.その後,TNT buf f erで洗浄し,ペルオキシ. 時間染色した後,脱色液(3 0 % met 0 % ace hanol ,1 t i cac i d)で脱色した.その結果を LAS1 00 0s ys t e m で取り込んだ後,各バンドの dens (各 i t yを計測した 群 n=3) .. ダーゼ標識された二次抗体 I gG-HRP(Hi s t of i ne. 13 )統計学的処理. ,東京)を添加 Si mpl eSt ai n,Ni c hi r e iBi os c i e nc es し,3 0 間浸漬した.TSA 法により可視化し,蛍光 顕微鏡下で観察した(各群 n=4 ) .. .0 5 で有意 の判定には St e s tを用い,p <0 ude ntst -t. 結果は平. 値±標準偏差で示し,統計学的有意性. 差ありと判定した.. 1 1 )角膜上皮欠損モデルにおける f i br i n e nz ymogr aphyによる PA 活性の測定. Ⅲ.結. 角膜上皮欠損モデル作成1 2時間後,24時間後,お. 1)培養ヒト角膜細胞における PA の発現. 果. よび48 時間後に s bi t alで麻酔死さ odi um pe nt obar せて,速やかに角膜片を摘出した.取り出した角膜. HCECおよび HCK が産生している PA を f i br i n で解析した. では,培養上清お zymogr aphy HCEC. は速やかに液体窒素で凍結後,. 用するまで−8 0 ℃. よび細胞溶解液ともに u-PA の活性を認めた.しか. で保存した.角膜1片に対し,蛋白抽出液 (1 5 0mM. し,t PA の活性はほとんど認めなかった.HCK で は,培養上清では u-PA,t -PA ともに活性をほとん. 0mM s NaClを含む1 odi um phos phat ebuf f er ,pH 7 . 2,1% Tr . 1% s i t onX-1 0 0,0 odi um dode cyls ul -. ど認めず,細胞溶解液ではわずかに u-PA の活性を.

(5) 線溶系遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮. 認めた(図1). 2)培養ヒト角膜細胞における uPARの発現 HCECおよび HCK にお け る u-PARの 発 現 を. 傷治癒過程の検討. 3 5. Wes t e r nbl ot法で検討した.その結果,HCK では, 5 5∼6 0kDaの位置に抗 u-PAR抗体に反応する蛋 白が検出されたが,HCECでは,検出されなかった (図2) . 3)角膜上皮欠損の治癒過程における u-PA の影 響 uPA が角膜上皮の 傷治癒に及ぼす影響を検討 するため,uPA울 웘 울マウスおよび u-PA욹 웘 욹マウスを 用いて,治癒過程における角膜上皮欠損を経時的に 観察した (図3) .フルオレセイン染色下に角膜を観. 図쏯 HCECおよび HCK における PA 活性 A:HCECお よ び HCK の 上 清 と 細 胞 溶 解 液における PA の活性を f i br i nenz ymo-PA マーカー, gr aphyで測定した.1:t 2 :u-PA マーカー,3:HCEC上清4 8 時 間後,4:HCK 上清48時間後,5 :HCEC 細胞溶解液48 時間後,6:HCK 細胞溶解 液48時間後 B:HCECおよび HCK の上清における uPA の活性 C:HCECお よ び HCK の 細 胞 溶 解 液 に お ける u-PA の活性 データを cont r olに対する相対値の平 値± 標準偏差で示す(n=4,웬 .01). 웬p <0 HCECの培養上清および細胞溶解液では u-PA の活性は認 PA の強い活性を認めたが t めなかった(レーン3,5).HCK の培養上 清では u-PA,t PA 活性ともにほとんど認め ず,細胞溶解液でわずかに u-PA の活性を認 めた(レーン4,6).. 図쏱. 図쏰. 抗 u-PAR抗体による We s t e r nbl ot解析 レーン1:HCEC,レーン2:HCK. HCK では抗 u-PAR抗体に反応する蛋白の 検出を認めた(レーン2) .. uPA울웘 울マウス,および u-PA욹 웘 욹マウスにおける角膜上皮欠損の治癒過程 PA욹 웘 욹マウスにおいて角膜上皮欠損モデルを作成し,治癒過程におけ uPA울웘 울マウス,および uる欠損部の面積変化を観察した. A:フルオレセイン染色した前眼部写真 B:角膜上皮欠損残存率の推移 を 示 す.角 膜 上 皮 欠 損 残 存 率( %) =角 膜 上 皮 欠 損 部 の 面 積 (mm워 )×1 00/角膜上皮欠損作成時の面積(mm워 )で算出した.データを平 値±標準偏差で 示す(n=4,웬p <0. 05,웬웬 :p <0 . 0 1 ) . (A) , 傷治癒過程の早期から上 uPA울 웘 울群では u-PA욹웘 욹群と比較して早期に角膜は透明治癒し 皮欠損面積の残存率の有意な減少を認めた(B) ..

(6) 36. 児 玉. 察したところ,u4時 PA울웘 울群では上皮欠損作成後2 間で u-PA욹웘 욹群と比較して有意に上皮欠損面積の 減少を認め,48 時間後においてはフルオレセインの. 彩. は, 4 8 時間後においても上皮欠損部が残存していた. 5)u-PA 阻害剤(u)投与が角膜上皮 PA s t op좲 傷治癒に及ぼす影響. フルオレセインに染色される上皮欠損部が残存して. u-PA 阻害剤が角膜上皮 傷治癒に及ぼす影響を 検討するため,uPA울 웘 울マウスに上皮欠損作成後, 図5に示すタイムスケジュールで uPA s t op좲ある. おり,欠損部周囲の角膜には軽度の混濁を認めた(図. いは生理食塩水を投与した.上皮欠損作成後2 4時間. 3A).. において,u-PA s t op좲を投与した群の欠損面積は 6 4 .0 ±1 1 . 7mm워で あ り,c 3 .2 ±14.5 ont r ol群 の2. 染色はみられず,角膜は混濁を残すことなく治癒し ていた.一方,u時間後も PA욹 웘 욹群においては,48. u-PA울웘 울群 で の 上 皮 欠 損 面 積 の 残 存 率 は,uPA욹웘 욹群と比較して治癒過程の早期から有意に減少 しており,平. 40.8 ±6. 57時間で上皮欠損が消失し. た.これに対し,u-PA욹 웘 욹群での消失時間は,平. mm워と比較して上皮欠損の残存面積は有意に大き かった (p <0 . 0 1 ) (表2A) .また,上皮欠損の消失 に要した時間は c 0 ±6 . 0時間であっ ont r ol群が59.. 88.8±16.1時間であり,観察したいずれの時間にお いても uPA울웘 울群と比較して,上皮修復の有意な遅 が認められた(図3B). 4)角膜上皮欠損の治癒過程の組織学的検討 u-PA울웘 울マウスおよび u-PA욹웘 욹マウスの上皮欠 損作成から24 時間後および48 時間後の角膜組織切片 を作成し,HE染色を行って,光学顕微鏡下に観察し た(図4).uPA울 웘 울群では uPA욹웘 욹群と比較して上 皮の被覆が早く,48 時間後では重層化し,完全に再 被覆された角膜上皮を認めた.一方,uPA욹 웘 욹群で. )投与による角膜 図쏳 uPA s t op좲 PA 阻害剤(u上皮欠損の治癒過程の検討 uPA울 웘 울マウスに,角膜上皮欠損を作成した 後,uPA s t op좲を投与せず,生理食塩水を投 与した群(c 2 時間毎に投 ont r ol群)および,1 与(静注0 . 2ml (1mg/ +点眼 2 l (2 00 kg) ) )した群(ug/ ml PA s t op좲群)において, 角膜上皮欠損部の治癒過程を比較検討した. 薬剤投与の時間経過を示す. 表쏰 u)投与による角膜上 PA 阻害剤(uPA s t op좲 皮 傷治癒過程の検討 A 図쏲 角膜上皮欠損の治癒過程における組織学的検 討 uPA울웘 울マウス,および uPA욹웘 욹マウスにお いて角膜上皮欠損モデルを作成し,治癒過程 における欠損部の組織学的変化を観察した. 2 4 時間後,および48 時間後の HE染色の結果 を示す.C,D,G,Hは対応する上段A, B,E,Fの枠内を拡大したもので,矢印は 治癒過程における角膜上皮の l eadi ng e dge を示している(bar :1 00 m). 24 時 間 後 で 比 較 す る と u-PA울웘 울群 で は uPA욹웘 욹群よりも角膜上皮の被覆速度が早く (A,B,C,D) ,48 時間後では u-PA울 웘 울群 の角膜上皮は完全に被覆し,重層化していた が,uPA욹 웘 욹群の角膜上皮欠損部 が残存し ており,治癒の遷 を認めていた(E,F, G,H).. 群 ol c ont r uPA s t op좲. 欠損面積(mm워 ) 2 3 . 2 ±1 4 . 5 6 4 . 0 ±1 1 . 7. **. B 群 c ont r ol uPA s t op좲. 時間(h) 3 9 . 0 ±6 . 0 0 9 6 . 0 ±1 2 . 0. **. :p <0 .0 1 웬 웬 A:図5で示した角膜上皮欠損モデルを作成した後, 4 時間後の角膜上皮 c ont r ol群および,uPA s t op좲群で2 の欠損面積を比較検討した.B:同様に cont r ol群およ び,uPA s t op좲群で,角膜上皮欠損面積が0になった時 点での時間を比較検討した.データを平 値±標準偏差 で示す(n=4 ,웬 :p <0 . 0 1 ) . 웬.

(7) 線溶系遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮. たのに対し,u-PA s .0 ± t op좲を投与した群では96 12.0時間であり,uPA 阻害剤の投与により有意に. 傷治癒過程の検討. 3 7. 0. 0 0 5) . 8)角膜上皮欠損の治癒過程における t -PA および. 長を認めた(p <0.01 ) (表2B). 6)マウス角膜における I CAM-1および I L-1 αの mRNA 発現量の検討 マウス角膜の I CAM -1および I L-1 αの mRNA 発現に u-PA が与える影響を RT-PCR法により検 討した.uPA울 웘 울群,u-PA욹 웘 욹群の両群で I CAM-1 および I の の発現を認めた(図6A) . L1 α mRNA また,その発現量に両群間で有意な差は認められな かった(図6B). 7)角膜上皮欠損の治癒過程における炎症細胞の検 討 角膜上皮受傷時の角膜実質内への炎症細胞の浸潤 に u-PA が与える影響を検討するために,u-PA울 웘 울 マウスおよび u-PA욹 웘 욹マウスを用いた.u-PA울웘 울 群,u-PA욹 웘 욹群ともに,好中球のマーカーである NI MP-R14陽性の細胞を認め(図7A,C),浸潤し ている炎症細胞は主に好中球であることが確認され た.一方マクロファージのマーカーで F4/8 0陽性の 細胞はほとんど認めなかった(図7B,D).また u -PA울웘 울群では,角膜の中央部付近まで多数の好中球 が浸潤してきており(図7A),角膜中央部切断面に おいて,角膜1切片あたりの好中球の数を計測する と,u-PA울웘 울群では uPA욹웘 욹群と比較して,浸潤し ている好中球の数は有意に多かった(図7E)(p <. 図쏵. 図쏴 RT-PCR法による I CAM -1お よ び I L-1α の mRNA 発現 uPA울 웘 울マウス,および u-PA욹 웘 욹マウスの正 常角膜において I CAM -1お よ び I L-1 αの mRNA 発現を RTPCR法で解析した.A: ,I ac t i n遺伝子の発 I CAM-1 L1 α,および β現,B:各遺伝子のバンド濃度を内部標準遺 伝子(βac t i n)に対する相対値として示す. データを平 値±標準偏差で示す(n=3 ). 正常角膜では u-PA울 웘 울群,u-PA욹 웘 욹群とも に,I CAM1および I L1 αの mRNA の発現 を認め (A) ,その発現量に有意な差は認めな かった(B) .. 角膜上皮欠損の治癒過程における炎症細胞浸潤の観察 4 時間後のパラフィン切片を uPA울웘 울マウス,および u-PA욹 웘 욹マウスにおいて角膜上皮欠損作成2 作成し,治癒過程における炎症細胞浸潤の程度を観察した.A,C:NI / MPR1 4 B,D:F4 8 0 の免疫蛍光染色の結果を示す(各群 n=4 ) (NI (緑) ,F4/ (赤) ) (bar :1 0 0 m) .E: MPR1 4 8 0 マウス角膜片の中央部切断面1切片あたりの NI MP-R1 4陽性細胞数を計測した.データを平 値±標準偏差で示す(n=4,웬웬 . 0 0 5 ) . 웬 p <0 上皮欠損の治癒過程で uPA울웘 울群,uPA욹 웘 욹群ともに,NI MPR1 4陽性の細胞(好中球)を認め たが(A,C),F4/ .角膜中 8 0陽性の細胞(マクロファージ)はほとんど認めなかった(B,D) 央部切断面において,uPA울웘 울群では,角膜の中央部付近まで好中球が浸潤してきており,角膜 1切片あたりの好中球の数は有意に多く認められた(E) ..

(8) 38. 児 玉. u-PARの影響 -PA および u-PARが角膜上皮の t. 彩. 傷治癒に及. ぼす影響を検討するため,t PA욹웘 욹マウス,t PA울 웘 울 マウス,uPAR욹 웘 욹マウス,および uPAR울 웘 울マウス を用いて治癒過程における角膜上皮欠損の推移を観 察した.両群の上皮欠損作成から24時間後および4 8 時間後の前眼部写真をそれぞれ図8A,Cに,上皮 欠損の面積変化を図8B,Dに示す.t PA울 웘 울群,t -PA욹웘 群の両群間で欠損部の消失速度に有意な差 욹 は認められず,48時間後には両群ともに角膜は混濁 を残さず 治 癒 し て い た(図 8 A,B).ま た,uPAR울 웘 울群,uPAR욹 웘 욹群でも同様に48時間後には両 群ともに角膜は混濁を残さず治癒しており,経時的 に明らかな差は認められなかった(図8C,D). 9)角膜上皮欠損の治癒過程における u-PARの発 現 角膜上皮 傷治癒過程での u-PARの発現を検討 するために,u-PA울 웘 울マウスを用いて u-PARの免 疫蛍光染色を行った(図9).上皮欠損作成から2 4 時 間後,28時間後の再被覆の過程で u-PARは l e adi ng edgeの部 に限局して,角膜上皮の表層細胞から翼 細胞に発現していた(図9C,D,E,F).角膜上 皮欠損が完全に被覆された36時間後には発現を認め なかった(図9G,H). 10)角膜上皮欠損の治癒過程における PA および. 図쏶. 図쏷. 角膜上皮欠損の治癒過程における u-PARの 発現 u-PA울 웘 울マウスにおいて正常角膜(A,B) および角膜上皮欠損作成2 4時間後(C,D) , 2 8 時間後(E,F) ,3 6 時間後(G,H)の u -PAR免疫蛍光染色を行った.核染色には DAPIを用いた.同様の染色は4角膜片で施 行した.B,D,F,Hは対応するA,C, E,Gの枠内を拡大したもので,矢印は治癒 過程における角膜上皮の l e adi ng edgeを示 している(u,bar :1 0 0 m). PAR(赤) 正常角膜に u-PARの発現は認めず (A,B) , 2 4 時間後,2 8 時間後では l e adi nge dgeの部 に限局して,u(C,D, PARの発現を認めた E,F) .角膜上皮が完全に被覆された3 6 時間 後には uPARの発現を認めなかった(G, H) .. -PA욹 t PA울웘 울マウス,t 웘 욹マウス,および uPAR울 웘 울マウス,uPAR욹 웘 욹マウスにおける角膜上皮 欠損の治癒過程 -PA울웘 -PA욹 ,および ut 울マウス,t 웘 욹マウス(A,B) PAR울 웘 울マウス,uPAR욹 웘 욹マウス(C, D)を用いて角膜上皮欠損モデルを作成し,治癒過程における欠損部の面積変化を観察した. A,C:フルオレセイン染色した前眼部写真 B,D:角膜上皮欠損残存率の推移を示す.角膜 上皮欠損残存率(%)=角膜上皮欠損部の面積(mm워 ) ×1 0 0 / 角膜上皮欠損作成時の面積(mm워 ) で算出した.データを平 値±標準偏差で示す(n=4 ) . -PA울웘 -PA욹 t 울群,t 웘 욹群の両群間(A,B)および uPAR울 웘 울群,uPAR욹 웘 욹群の両群間(C,D) で角膜上皮の再被覆の速度に有意な差は認められず,いずれの群でも4 8 時間後には角膜は混濁を 残さず治癒していた..

(9) 線溶系遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮. MMP活性の経時的変化 u-PA욹 웘 욹マ ウ ス,u-PA울 웘 울マ ウ ス,お よ び uPAR욹 웘 욹マウス,uPAR울웘 울マウスに角膜上皮欠損を. 傷治癒過程の検討. 39. 作成し,角膜における PA 活性および MMP活性の 経時的な変化を比較検討した.Fi br i ne nz ymogr aphyで PA 活性を測定したところ,uPA울웘 울群,およ. 図쏙쏢 角膜上皮欠損の治癒過程における PA 活性の推移 ,および u-PAR울 u-PA울웘 울マウス,u-PA욹 웘 욹マウス(A,B) 웘 울マウス,uPAR욹 웘 욹マウス(C, D)において PA 活性の推移を比較検討した. A,C:f i br i ne nzymogr aphy. B,D:uPA 活性の経時的変化. データは0時間に対する相対値として3眼の平 値±標準偏差で示す. u-PA울웘 울群,および uPAR욹웘 욹群,uPAR울 웘 울群では uPA 活性を認め,その酵素活性は 傷作成 後から徐々に増加し,上皮欠損が治癒すると減少する傾向を認めた.t PA 活性は経過中,ほとん ど認めなかった.. 図쏙 쏙 角膜上皮欠損の治癒過程における MMP活性の推移 ,および uu-PA울웘 울マウス,uPA욹웘 욹マウス(A,B) PAR울 웘 울マウス,uPAR욹 웘 욹マウス(C, D)において MMP活性の推移を比較検討した. A,C:gel at i nz ymogr aphy. B,D:MMP9活性の経時的変化 データを0時間に対する相対値として3眼の平 値±標準偏差で示す(웬 . 0 5 ) . p <0 uPA울 웘 울群,および,u-PAR욹 웘 욹群,uPAR울 웘 울群では上皮欠損作成後から MMP-9活性の明らか な上昇を認め,4 8 時間後には減少する傾向があった.uPA욹 웘 욹群では MMP9活性は経過時間に 比例して徐々に増加する傾向が認められたが,他の群と比較して,MMP9活性の増加率は有意に 低かった..

(10) 4 0. 児 玉. び u-PAR욹 웘 욹群,u-PAR울웘 울群では u-PA 活性を認. 彩. ほとんどが u-PA であり,t -PA はわずかに発現を. 傷作成から徐々に増加し,上皮欠損が治癒す. 認めるのみであった (図1) .これらの結果はすでに. ると減少する傾向にあった.また t -PA 活性は経過. 報告されている角膜における PA の発現結果と一致. 中,いずれの群でもほとんど認めなかった(図1 0 ) .. している웋 . 워. Gel at i nzymogr aphyで MMP活性を測定したと ころ,上皮欠損 の 治 癒 過 程 で 角 膜 内 に 発 現 す る. また,HCECおよび HCK を用いた We s t er nbl ot 法で u-PARの発現を検討したところ,HCK ではそ. MMPは主に MMP9であり,MMP2はほとんど 検出されなかった.また u-PA울 웘 울群,および,u-. の発現を認めたが,HCECではバンドは検出されず 蛋白質レベルでの u-PARの発現を認めなかった. PAR욹 웘 욹群,u-PAR울 웘 울群では MMP-9活性は受傷 後1 2 時間後,24 時間後で明らかな上昇を認めたが,. (図2) .しかし RT-PCR法では,HCECからも u-. め,. 4 8 時間後には減少する傾向を認めた.一方,u-PA욹 웘 욹. (データ省略).こ PARの mRNA 発現が検出された のことは HCECにおいても u-PARは発現してい. 群では MMP-9活性は経過時間に比例して徐々に. るが,その発現量は微量であることを示している.. 増加する傾向が認められたが,いずれの時間におい. RTPCR法は We s t er nbl ot法に比べて検出感度が 高いために,HCECにおける uPARの発現が検出. ても他の群と比較して,MMP-9活性は有意に低か った(図11) (p <0 . 05 ) . Ⅳ.. されたと. えられる.. また,マウスの角膜を用いた u-PARの免疫組織. 察. 染色では,正常では角膜上皮にその発現は認めなか. 本研究では,線溶系遺伝子欠損マウスに角膜上皮 欠損モデルを作成し,線溶系因子が角膜上皮の. 傷. ったが,上皮欠損の修復過程において,uPARは角 膜上皮欠損部を伸展,移動する角膜上皮細胞に強く. 治癒過程に与える影響について検討した.角膜にお. 発現した (図9) .これらのことから角膜上皮細胞は,. ける pl as mi noge npl as mi ns ys t e m に関する主な報. 正常状態では uPARを発現していないが,傷害が. 告としては,角膜上皮が u,ま PA を放出すること웋 워 た,角膜潰瘍において c ol l age nas eが pl as mi nによ. 刺激となって uPARの発現が増加するといえる.. り活性化され,角膜実質のコラーゲンを. 解するこ. と워 ,またヒト正常涙液や角膜潰瘍の患者の涙液中 원 には u-PA が存在していること워 웑や, PA および t. さらに,上皮欠損の治癒速度を検討すると,uPA욹웘 욹群のみ有意な上皮欠損の修復遅 を認めたが (図3) ,t PA욹웘 욹群および u-PAR욹 웘 욹群では対照群 と有意な差を認めなかった(図8) .すなわち t PA. 角膜上皮,角膜内皮,虹彩,毛様体に t PA 活性があ. および uPARには角膜上皮細胞の移動に対する影. ること워 웑などが報告されている.Mor i mot oら웋 워は, 家兎の角膜上皮細胞より産生される u-PA が,角膜 上皮細胞の移動にきわめて密接に関与しており,そ. 響は認められなかった.この結果は,u-PA が上皮細. の機序として,uPA が f i br one c t i nの 解を含めた 細胞の基質からの解離に作用し,u-PA によって角. 胞の伸展,移動に重要な働きをしていることを示し ている.しかし,角膜での上皮修復過程を. 合的に. えると uPARは発現してくるが,その果たす役. 膜上皮細胞の移動が開始されることを報告してい. 割は少ないと思われ,u-PA の角膜上皮細胞の伸展, 移動に対する作用は u-PA 単独の細胞外基質 解. る.しかし,この報告は i nvi t r oあるいは家兎角膜. 作用を介するものであると. の器官培養による評価であり,i nvi voの評価ではな い.また我々が調べた限り,過去に uPA の角膜上. uPA の細胞外基質 解以外の作用については従 .u来 か ら 種々の 検 討 が な さ れ て き た웋 웏 웦 웋 웒 웦 웋 웓 웦 워 웓 욹 웍 웋. 皮細胞伸展作用への u-PARの関与について検討し. PARは u-PA と結合し u-PA の基質 解作用を促 進させる働きの他に, 細胞内シグナル伝達に関与し,. た報告はない.. えられた.. そこで本研究では線溶系因子が角膜上皮欠損の治. インテグリンやビトロネクチンの発現を増強させる. 癒過程に与える影響を明らかにするため,u-PA 遺 -PA 伝子欠損マウス,u-PAR遺伝子欠損マウス,t. ことなど,種々の働きに関与していることが報告さ. 遺伝子欠損マウスの3種類を用いて i n vi voで検討 した. まず,ヒト角膜における pl as mi noge n ac t i vat or の存在を確かめるため,培養ヒト角膜上皮細胞と角 膜実質細胞を用い,pl as mi noge n ac t i vat orの活性 について検討した.その結果,f i br i nenzymogr aphy では,角膜上皮および実質細胞が産生する PA は,. れている웍 . 傷治癒過程の皮膚の線維芽細胞に 워 웦 웍 웍 おいて,uPA,uPARは移動している細胞に強く 発現することが報告されている웍 .今回の検討で 웎 웦 웍 웏 は角膜上皮細胞の移動には u-PARの有無による有 意な差は認めなかった(図8)が,l e adi nge dgeで の限局した u-PARの発現(図9)が角膜上皮細胞間 の層構造の修復に対して u-PARが関与をしている 可能性があることを示唆している..

(11) 線溶系遺伝子欠損マウスにおける角膜上皮. これらの u-PA,および u-PAR遺伝子欠損マウ スによる検討により,u-PA の角膜上皮細胞の移動 への作用は u-PA 単独による細胞外基質 解作用. 傷治癒過程の検討. 41. た.しかし本研究では単純な角膜上皮欠損モデルを 用いており,角膜実質内に直接影響は少なく,u-. えられるが,その仮説をさらに. PA울웘 울群でも炎症細胞の浸潤は比較的軽度であった ため,uPA の炎症細胞を介した角膜 傷治癒の遷. 確かなものにするため,作成したモデルの角膜にお. 化の影響ではなく,角膜上皮細胞の伸展,移動に. が惹起するものと. ける MMPの発現を検討した (図1 1) .その結果,角 膜上皮の 傷 治 癒 過 程 に お い て,MMP-9は uPA울 웘 울群,および,uPAR욹웘 욹群,uPAR울 웘 울群では 経時的に明らかな上昇を認めたが,uPA욹 웘 욹群では. 対する作用が強く働いたと. えられる.. 今回の検討から,u-PA は角膜上皮欠損の修復過 程で,上皮細胞の伸展,移動,MMP9の発現,好中 球の角膜実質への浸潤に関与していることが明らか. 抑制されていたことから,その発現は u-PA に依存. となった.さらに,上皮細胞の移動,MMP9の発現. し て い る と 思 わ れ る(図1 1) .そ れ に 対 し て u-. に対する uPA の作用は u-PARを介さないことが. PAR욹 웘 욹群と uPAR울웘 울群では両者とも MMP-9の 発現に有意な差を認めず, 9の産生は uPAR MMP-. 初めて明らかとなった.一方で,u-PARは正常の角. 非依存的であると. 発現が増強されるが,uPARは,上皮細胞の欠損修 復速度には影響を与えず,MMP9の活性化には直. えられた(図1 1 C,D) .一方,. MMP2は,角膜上皮 傷治癒過程において u-PA および u-PARの有無による変動はなく,いずれの 群でもほとんど発現していなかった(図1 1 ).MMP. 膜上皮では発現を認めず,移動する角膜上皮細胞に. 接関与していないと 現在のところ遷. えられた.. 性角膜上皮欠損の治療には,ヒ. -9は角膜上皮の 傷治癒過程の早期において重要 な役割を果たしている웍 .一方,MMP웏 2や MMP-. アルロン酸やフィブロネクチン点眼療法,コンタク. 3は主に角膜実質細胞から産生され,角膜実質の再 構築や基底膜の合成などに関与し長期的に作用す. し,それらの治療法が奏効しない症例も存在する.. る웍 .本研究でも上皮の再被覆に対する MMP-2 원 욹웎 월 の発現は認められず,MMP2は上皮の 傷治癒に はほとんど関与していないと えられる(図1 2 ).. トレンズ装用,羊膜移植などが行われている.しか 本研究の結果から,uPA の単独,あるいはフィブロ ネクチンとの併用点眼は遷 性角膜上皮欠損に対す る有効な治療法の一つとなり得る可能性があると. 次に角膜上皮欠損時の角膜実質の病態を把握する. えられた.また,uPA には角膜上皮細胞の移動を促 すと同時に炎症細胞の角膜実質内への浸潤を促進す. ため,u-PA が角膜実質への炎症細胞の浸潤に与え. る働きもあることが明らかとなった.角膜実質内の. る影響について検討した (図7) .角膜. 炎症細胞の存在は,角膜. 傷治癒過程. において,I , 1 CAM-1 I Lαは重要な役割を担ってい ることが報告されている웎 .傷害を与えていない 웋 웦 웎 워 状態での角膜において は,u-PA울웘 울群 お よ び uPA욹 웘 욹群の間で I CAM -1および I L-1 αの mRNA の発現変化は認められなかったが (図6) ,角膜上皮. 傷治癒に悪影響を与える. 可能性がある.この問題点を克服しなければ u-PA を遷. 性角膜上皮欠損の治療に用いることは是認し. にくく,今後,角膜疾患の治療薬として展開するた めには,角膜実質内への炎症細胞の浸潤を制御する 必要があると. えられた.. 欠損の修復過程で,u-PA울 웘 울群では uPA욹 웘 욹群と比 較し,角膜輪部から浸潤してきたと思われる NI MP. Ⅴ.謝 稿を終えるにあたり,御指導,御. 辞 閲を賜りました近畿大学. ,uR14陽性細胞を有意に多く認め(図7A,C) PA は角膜実質への好中球の遊走に関与しているこ. 医学部眼科学教室下村嘉一教授に深甚なる謝意を表します.. とが明らかとなった.また,上皮欠損作成から2 4 時. の杉岡孝二医学部講師,ならびに近畿大学医学部. 間ではマクロファージの遊走はほとんど認められな. 教授,ご協力いただいた近畿大学奈良病院眼科三島弘教授,再. かった (図7B,D) .一般的に角膜に炎症が生じた. 生機能医学教室岡田清孝講師,生化学教室吉田浩二准教授,近. 際,角膜実質には多数の炎症細胞が浸潤してくるが,. 畿大学医学部ライフサイエンス研究所奥本勝美先生に心より. 最初に出現する炎症細胞は好中球であり,その発現 ピークは傷害から約1∼2日であり웎 ,次にマクロ 웍 ファージが浸潤し,その発現ピークは傷害から約7. また本研究にあたり,終始直接御指導頂きました眼科学教室 尾理名誉. 感謝申し上げます. Ⅵ.文. 献. 1.Gi 19 94)Anat ps onI K( omyoft heconj unct i va,cor nea. 日後である웎 .今回の検討はこれらの報告と矛盾し 웎 ない.Be r manら워 원は角膜潰瘍において,角膜上皮細. ):Thec andl i mbus ,I n:Smol i nG,Thof tRA (eds or nea, -2 4 t t l e,Br own&Company,pp3 Bos t on,Li. 胞や,涙液由来の多核白血球から産生された PA が. 2.Ni 09 ) Cor s hi da T,Sai ka S (20 ne a and s c l er a.I n:. pl as mi nogenを活性化し,細胞外基質を 解するこ とにより,角膜潰瘍を増悪させるとの仮説を提唱し. ):Cor Kr ac hmerJH,Manni sMJ,Hol l and EJ( eds nea, -24 by,pp3 New Yor k,Mos.

(12) 4 2. 児 玉. 3.Dani 01)Cor el sJT,Dar tJK,Tuf tSJ,Khaw PT (20 -48 4 neals t em ce l l si nr evi ew.WoundRepReg9:483 4.Schul t zRO,VanHor nDL,Pet e r sMA,Kl ewi nKM, 198 1)Di Sc hut t enWH ( abet i cker at opat hy.Tr ansAm -19 9 Opt hal molSoc79:180 5.Boni 20 03)Ne niS,RamaP,Ol z iD,Lambi as eA ( ur 89995 cker at i t i s .Eye17:9 ot r ophi 6.Kuwabar 197 6)Sl aT,Pe r ki nsDG,CoganDG( i di ngof .I nves t t heepi t hel i um i nexpe r i ment alc or nealwounds 14 Opht hal molVi sSc i15:4-. 彩 gr owt hf act orcooper at e swi t hf i br one ct i ni ne nhanc i ng at t achme ntand mi gr at i on ofc or ne alepi t hel i alce l l s . 550 TohokuJExpMe d222:4 22.Shi r ane J ,Nakayama T,Nagakubo D,I zawa D, 004 )Cor Hi es hi ma K,Shi momur a Y,Yos hi eO (2 neal e pi t he l i alc el l sands t r omalke r at oc yt esef f i ce nt l ypr o0(CCL20 )andat s duc eCCche moki nel i gand2 t r actce l l e xpr es s i ngi t sr ec ept orCCR6i nmous eher pet i cs t r omal 8:297 -3 06 ker at i t i s .Cur rEyeRes2 23.Car c kens L,Ream B, me l i e tP,Schoonj ans L,Ki e. 7.Buck RC (1 979 )Ce l lmi gr at i on i nr e pai rofmous e. 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Rol eofur oki nas et ypepl as mi nogenact i vat or(u-PA)i n 87 cor neale pi t he l i almi gr at i on.Thr ombHae mos t69:3 -3 91 1 3.Wat anabeM,YanoW,KondoS,Hat t or iY,Yamada. nhumant ear s . Exp s pe ci esofpl as mi nogenact i vat ori 31137 EyeRe s46:1 28.Tr 199 0)Local i pat hiRC,Tr i pat hiBJ,Par k JK ( i zai vat ori nhuman t i onofur oki nas et ypepl as mi noge nact. 003 ) Up-r at i on ofur oN,YanaiR,Ni s hi da T (2 e gul ki nas e-t ypepl as mi nogenact i vat ori ncor neale pi t he l i al. e yes:ani mmunocyt oc hemi c als t udy.ExpEyeRes51: 5 45 -55 2. i ce l l si nduc edbywoundi ng.I nves tOpht hal molVi sSc 44:3 33 2-3 338 1 4.Col 99 9)Thepl )s l enD (1 as mi nogen (f i br i nol yt i c ys -. 29.Al f ano D,Fr anco P,Vocc aI ,GambiN,Pi s a V, r i e r oMV,I acc ar i noI , St oppel Manci niA,Caput iM,Car 200 5)Theur l iMP ( oki nas epl as mi noge nact i vat orand. 2:259 -2 70 t e m.Thr ombHae mos t8 987 )Ur -t 1 5.Bl oki nas e ype as iF,Vas s al l iJ D,DanoK (1. os i s .Thr omb i t sr ec ept or:r ol ei nc el lgr owt handapopt 05211 Haemos t93:2. pl as mi nogen ac t i vat or:pr oenzyme,r ec ept or ,and i n4:801 -8 04 hi bi t or s .JCel lBi ol10. 30.Al 003 )Ther f anoM,Si deni usN,Bl as iF,Pol iG (2 ol e. 20 09)Theur 1 6.Bl usN ( oki nas er e cept or: as iF,Si deni. 5075 6 r e cept ori nHI V-1i nf ec t i on.JLeukocBi ol74:7 31.Br 08 ) ye rSC,Fant uzziG,VanRooi j enN,KohTJ.(20. Focus edc el ls ur f acepr ot e ol ys i s ,ce l ladhes i onands i gna3-1 930 4:192 l i ng.FEBSLet t58 1 7.Col 99 1)Bas l enD,Li j ne nHR (1 i candcl i ni calas pect s 114 -31 24 off i br i nol ys i sandt hr ombol ys i s .Bl ood78:3 201 0) Re 1 8.Smi t h HW,Mar s hal lCJ ( gul at i on ofcel l 1:2336 s i gnal l i ngbyuPAR.NatRe vMolCe l lBi ol1 200 9) 1 9.TkachukVA,Pl e khanovaOS,Par f yonovaYV ( Regul at i onofar t e r i alr emode l i ngandangi ogene s i sby ur oki nas e t ypepl as mi nogen ac t i vat or . Can JPhys i ol 8 7 2 3 1 2 5 1 macol : Phar 2 0.Ar aki Sas akiK,Ohas hiY,Sas abe T,Hayas hiK, 19 95)An SV40 -i Wat anabeH,Tano Y,Handa H ( mhel i alce l ll i ne and i t s mor t al i zed human c or nealepi t 4char act e r i z at i on. I nve s tOpht hal molVi sSc i36:61 62 1. /uPA vat or (uPA) ofur oki nas e t ype pl as mi noge n act i. Ur oki nas et ype pl as mi nogen act i vat orpl ayse s s e nt i al r ol esi n macr ophage c hemot axi sand s ke l e t almus cl e 80:11 79 -11 88 r e gener at i on.JI mmunol1 32.We iY,Lukas hevM,Si monDI ,Bodar ySC,Ros enber g 996 )Regul S,Doyl eMV,ChapmanHA (1 at i onofi nt e 73: heur oki nas er ec ept or . Sci ence2 gr i nf unc t i onbyt 1 55 1-1 555 33.Kans e SM,Kos t C,Wi l he l m OG,Andr e as en PA, ( 1 9 9 6 ) Pr e i s s nerKT Theur oki nas er e cept ori samaj or vi t r onect i nbi ndi ng pr ot e i n on endot hel i alce l l s . Exp 24:3 44353 Ce l lRe s2 34.Schaf amer erBM,Mai erK,Ei ckhof fU,ToddRF,Kr 994 ) Pl MD (1 as mi noge n ac t i vat i on i n heal i ng human 44:1 269 -12 80 wounds .Am JPat hol1. 2 1.Sugi okaK,Yos hi daK,KodamaA,Mi s hi maH,Abe. 35.We nS,Saar i al hoKe r e ckr ot hM,Vaher iA,Vi r ol ai ne. 201 0)Connec aH,Shi momur aY ( t i vet i s s ue K,Munakat. 04) Epi U,Jahkol a T,Si r en V (20 t hel i alt i s s uet ype.

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参照

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