Dextran sulphate の抗凝固作用に関する実験的研究

米子医誌

J

Yonago Med Ass 38， 347-358， 1987

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の抗凝菌作用に関する実験的研究

鳥取大学医学部臨床検査医学教室(主任中村克己教授)

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ABSTRACT

K

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IIJIMA

Detartment 01 Cluzical Laboratory Medicine， Totfort University Schoolol Medicine， Yonago 683， ]atan

347

The anticoagulant properties of dextran sulphate (DS) which belongs to the same family of glycosaminoglycans as heparin were studiedin vitroin comparison with heparin， in regard to antithrombin activity， anti陶 Xaactivity， platelet in relation to Xa neutralizing activity， and

inhibition of fibrinogen網fibrinconversion.

The results were as follows.

1. DS could neutralize the amidolytic activity of thrombin or factor Xa in presence of anti. thrombin 班 (AT1lI)， but no effects in absence of AT 1lI.

2. The factor Xa neutralizing activity of DS.AT 1lIcomplex was enhanced by platelet， whereas the activity of heparin.AT 1lIcomplex was diminished by platelet.

3. The potentiating factor of platelet which enhanced the activity of DS.AT 1lIcomplex seemed to be a protein Iocated on the platelet membrane， 100，000-200，0000 in molecular weight， that differed from heparin neutralizing protein， platelet factor 4. This potentiating factor of platelet could not cooperate with heparin.

4. DS could inhibit the fibrin polymerization process indep巴ndentof AT 1lI.Heparin showed

the weak inhibition in the same manner.

These results demonstrated that DS prevented the blood coagulation by accelerating the inhibitory activity of AT 1証， just as heparin. It was found that DS had an inhibitory effect on fibrinogen揃fibrinconversion in absence of AT 1lIin addi tion to being a pot邑ntiatorof AT 1lI.

(Accepted on August 27， 1987) デキストラン硫酸 (dextransuJphate : DS) は にDSは線

i

容能充送作用叫日l，抗血小板凝集作用9)，~j 0-硫霊堂基を有するムコ多糖類で， 0ーおよび N 硫酸 脂血液浄作用6)")，血禁治皮低下作用16)などのあるζ 基を有し，同じくムコ多糖類であるへパザン19)と類似. とが知られており，それぞれの臼的で臨床約に広く伎 の構造を持つー惑の heparinoidであり(図1-1， fflされている.しかしながら， DSの濃度によっては 1-2)，へパリンと同様に抗凝図作用を有する1) さら 凝血促進出)，線総阻害ー叫>，血小板凝祭促進24)などの作

348

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['iI，]1-1. デキストラン硫酸の一次構造 RはSOsNaまたは廷

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['iI，]1-2. へパワンの一次総造 (a)の繰り返し総迭の ITIこ (b)が挿入される 分間j撹併し， 3000 rpm 15分法心後の 1::'711;を斤jいた. この吸器血装中には合成蕊質法 (Kabi)27)，一元免疫 拡散法(Hoechst)Z5)両法による検討でantithrombin JII (AT TII)(ま政治得されて消火しており，

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こ一元免， 疫拡散法による検討でα2macroglobulin (αめ の お よび α1antitrypsin Cα1 AT)は米欧諸残存してし、 ることを1i(ii認した. (5) トロンピン仁I]Tllíì~i)lJj定にはとトトロンピン (3.5

出at/ml，Kabi)および合成蕊質S…2238(Kabi) を， Xa rt和ilを

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定l乙lまXa(7.1 nkat/ml)お よ ぴ 合成滋賀S-2222 (Kabi)をそれぞれ用いた. (0)

(6) *I~ 製 AT]l[ (l unit/ml)はKabi社授の!て:品 告と用いた. 2. 血小板因子の潟墜 (1) EDTA-2Kでキレートしたi血液を1000rpm 10分主主心することにより多血ノj岐血援を作製し，それ ( b) をさらに3000rpm 15分遠心して血小板ペレットを 得た.このベレットを0.05MトリスーEDTA綬街液 (0.15MNaCJ，196EDTA-2Kを含む， pH 7.4) で繰り返し洗浄し，さらにO.05Mトワ 浮遊して洗浄血小板とした.この間のt'¥'!f乍はすべてフつ ラスチック製の~~兵で行い，可能な限り IÍll小板の破壊 を避けた (intact血小板).また，このintact血小板 沼もあることが報、告されており， DSの多伎にわたる について凍結融解を3度繰り返すことにより破砕血小 複雑な生体への影裂をうかがわせる.また，血管内凝 板そ得た. 固定候群に対する治療王手!としてDSの投与も提唱され (創 設厚血IJ、板液そ上記と同様の方法で洗浄後， ている32)ζとからDSの抗凝固作用機序を解明するこ 10，000 rpm 30分遠心し，その上清を血小板1111出波と とは臨床の函からも必至

E

なことである.以下， DSの した.

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[

小板抽出淡をへパリンセフアロース CL-6B 抗凝図作用についてヘパりンと対比しつつ，種々の検 (Pharmacia)を用いたアフィニティークロマト夕、、ラ 討を行った. フィーによって分間した.ヘパリンセフアロースに非 材 料 ConAアフィニティークロマトグ ラフィーおよびゲルクロマトグラフィーの試料とし 1.

V

L

トロンビン作用および抗Xa作用 た.また，へパリンセブアロース吸着蛋白はO.OlM (1) DSはMDSコーワ注300(平均分子母3500， リン

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設

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.i液(pH7.4)で誌[誤皮を段階的にあげるこ イオウ含iiJ:4.3 96; MDS-A， Lot. LA 112;興和)f';l

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とによりiJ累次iねUし， 2.0M NaCl溶出分間を0.05

2

装〉を用いた.

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1

JはMDS-A300mgを0.196炭酸 M トリス絞街波 (0.15MNaClを含む， pH 8.4)

I

こ 水系ナトリウム加生涯食塩水に溶解しであるため，一 対して活況し，血小板宮14因子11)2りとして実敬に用い

部の実験についてはDS単品(興和新薬より供与)の た.

生理食塩水溶解淡についても併せて検討した (3) ヘパリンセブアロース非政着分間は Minicon (2)ヘパリンはヘパザンナトリウムa;NIシミズ

J

B15 (Amicon)で談結後， Con Aセブアロースア (Lot. A 6055;清水製lJ，

D

を用いた. フィニティークロマトグラフィー(Pharmacia)そ行 (3)正常血支は Ci-troJ1 (D旦de)または健常者 った.~Ió奴若宮自は 0.02M トワス設街波 CO.5M

ブ。ーノレ血誌を用いた NaCl，pH 7.4)で， I没者蛋白は0.2M methyl-α“

(4) ベントナイト段者盛l廷は正常~.3ß全血翠 1mlìこ D-mannopyranoside (Sigma， Grade TII)を含む 対してベントナイト(和光総菜)300 mgを加えて 10 0.02 Mトリス設

E

苦渋(0.5M NaCl， pH 7.4)で活出

デキストラン li1~[践の抗凝国f'r'fH 349 した.Con A JI~ 吸着分 u~ì についてはさらにセファロ 10倍に希釈して，その200ld(こトロンピン100μ1を ース CL-6B (Pharmacia)を

m

いたゲルクロマト 添加して凝問時間を測定した.また，残存トロンピン グラフィーを行った.波山には0.05Mトリス絞街絞 活性は合成基質S…2238~とより測定した. (0.15M NaClを合む， pH 8.4)を用いた (2) フ ィ プ リ ン 室 会 試 験 は ト ロ ン ピ ン を 用 い た 3. フィブワノゲンーフィブザン族紛読料への影響 Soliaの方法判;こ準じて行ーった. (1) トロンピンiI部可決!定には Ci.tr叫 工 (Dade) およびウジトロンピン (100uni tjml， Dade)を使間 した. (2) ブィプリン重合試設は50mgjdlブィブリノゲ ン(ボビン，タイプ2;箔イピ子:)おぶび5unitjml ワシトロンビン (Dad日〕を日jいた. 方 法 1.

V

L

トロンビン作用および抗Xa作用について (1) 0.05Mトリス緩衝液 (0.75mMEDTA，0.15 M NaClを含む，pH 8.4)で希釈した各種波!交のひS あるいはへパリンとCi.trol1 ，ベントナイトlJ&.:i':flUl 茨または精製ATlIT を側々に~}.畳混合して試料とし た.これらの試料のトロンビン中和能は試料100μ1こ， トロンビン淡200μl添加後， 37'C 5分間仁lj霞し，そ の?足利1fえ

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1

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の残存トロンピン活性を合成基質S-2238 で測定した. (2)

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L X a {'Jo)lJは， 0.05Mトリス緩衝液 (0.15M NaClを合む， pH 8.4)で希釈した各磁波皮のDSま たはへパリン100μ1な 試 料 と し て1unitjml ATllI 50μ1を混和後， 37'C 5分間続

i

召し，さらに Xa100

μ

を添加， 37' C 2分[河野良したjs今討を<:1-1の残存Xa 活性を合成法武S-2222で測定した. 2. 抗Xa (1) DSおよびへパリン各50μlとintactJIll/H孔 るいはPF4を そ れ ぞ れ50μ11ì~j 々に混 合し， 37'C 5分間W

.

f

l塁後，その混合j伐を試料として 上述の方法に従って XaI{J'FfJ穏を浪J!定し， DSあるい はへパリンのXa 基質S-2222によって検討した. (2) 各穏クロマトグラブィーで謁裂したrfllノト絞tlJll五 分間とDS(終濃度1mgjml)を等監混合し，その混 合液を試料として上記のようにしてXa中和Tiきを測定 し， DS の Xa 中和能 lこ及ぼす血小板悶子の);~裂を合 成慈賞S-2222によって検討した. 3. フィブリノゲンーフィプリン転換過程への作用に ついて (1) 1パイアノレを0.5mlに溶解した Ci-trol1に 各種濃度のDSあるいはへパりンを等泣混合して試料 とした.この試料をベロナーjレ設街液 (pH7.35)で 成 緩 1. 抗トロンピン作用および抗Xa作用 (1) DS加血裂に添加されたトロンピンはDS淡皮 0.015 mgjmlでは対照とほとんど同じ吸光皮を示し たが， DS波茂の増加に伴い吸光皮の低下傾向を示し た.へパりン加I脳宣に添加されたトロンピンはへパリ ン濃度3unitjmlまでは対照とほとんど同じ吸光度 を示し，ヘパワン

i

渓皮の増加とともにi及光皮の低下傾 向を示した.その低下はDSの;場合に比し，ヘパリン の方がより顕著であった(図2). 1.0軍 -飽 0.9 米 0.8 v 0明 日0・幽働嶋刷。 ‘ @

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oon¥.O.OI 0.1 1.0 10 100 o S (mg/mt)，へパ1)ン(unit/mt) 関 2. デキストラン硫談添加i血液およびへパリン j奈加JÍll~立のトロンピン /:rJ_和作用 @…一言語:デキストラン硫酸 0・・一 .0:へパザン (2) DS iこトロンピンを混合した場合，吸光JJ[より 得られるトロンピ と同様の活性を示し， DS 自体によるトロンピン活性 の低下は認められなかった.ヘパザンによる影怨も DS同事長認められなかった(図3). (3)DSまたはへパリン加ベントナイト吸器血翠に 添加したトロンピンは， DS，へパりン各濃度におい ていずれの場合も対照とほぼ同じi汲光皮を示し，ベン トナイトi及活Ir'll'l立中ではDS，ヘパリンともにトロン ピンr.

J

I

和能を示さなかった(悶4). (4)DSと精製 AT]ITの混合液に添加されたトロン ピンは， DS;誌皮0.015mgjmlの場合対照とほとん ど同じ残存トロンヒ、ン活性を示したが，それ以上の浪

図 4・ デキストラン硫酸添加ベントナイト吸器血渓 いても同様の成総を得た. およびへパリン添加ベントナイト吸着血変の 2. Xa中和能ζl及ぼす血小板図子の影答 トロンビン中和作用 (1)洗浄 (intact)血小坂浮遊・波(終濃度25X羽生/ fLl)あるいはそれを凍結融解して調怒した破砕血小板

DS

を等長混合し， 5分間 37"C

K

府援した 試料について，

AT

III存在下における Xa 検討すると， intact血小板および破砕血小絞ともに 350 飯 お : 也 前 0.8 (A) 刺 市

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0.6 III 0.5.J[5----，---'←四一吋 " 30 0.5 • 0.8可 ( 日 )

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_;1 30 紛 翠 時 間 ( 介 ) 図3. デキストラン硫酸(A)またはヘパリン(B) のトロンピン活性に及ぼす影響

DS

(mg/ml) へ ノfりン(unit/ml) @一一番号

o

11一一向③ O 0一一一o 7.5 0一一一o 12.5

A一一-&， 15.0 .&.一一-&， 25.0

ム一一一ム 30.0 ムー一一ム 50.0 0.8

、

髄0 . 6 1 -3記0.41 [1!0.2-1 0 8 5 1 0 1 5 o s (mg/ml) 0.8，・ l白・0聞 曲 目 。 町 田 町- 0 鎚 0.6" 1-米 自.4-1 [1!0目2-1 04440 ゐ ぬ へパリン (unit/ml) 皮では

DS

した吸光皮の低下すなわちト ロンビン中和能の増大傾向がみられた(図5).また，

DS

単品でも会く同様の成績を得た.一方，ヘパりン と 精 製

AT

IIIの潟合液に添加されたトロンビンは， 0.02 unit/ml においですでに対尽に比して著明な残 存トロンビン活性の低下がみられ，さらにへパリン誤

0

.

7

量 当 @ 0.6 さH 日5 主主 O.4.J I r oont.0.01 0.1 1.0 10 o S (mg/叫 )

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5. デキストラン硫酸および

AT

][混和波のト ロンビンlt和作用 0.6

，

.

0 量当 日.5 ポ 0.4 E話 。.3 Q . 四 幅 四 四 時

a

四 時 唱 曲 目 . . . D . . 時 四 国 由 同.t::I_ v 0 0 0.2・・ 8 oont.1 10 100 ヘパリン(unit/ml) 図6. へパリンおよび

AT

斑混和液のトロンピン 中和作用 皮そ増しでもほぼ一定の吸光皮を示した(凶6). (5) 0.05Mトりス絞街液 (0.15MNaClを含む， pH8.4)を対照として，

DS

(0.01~50mg/ml) およ びヘパリン (0.00001~0.001unit/ml)のXa中和 能を測定すると，

DS

およびへパリンはいずれも

AT

E非存在下ではXa中和能を示さないものの，

AT

班 存在下において

DS

は0.01mg/ml以上，へパリンは 0.0001 unit/ml以上でそれぞれ淡皮依存性に Xa活 性を中和，抑制した(図7， 8).なお，

DS

単 品 に つ

DS

・

AT

III混合放の Xa る効果を示 した(凶9).一方へパザンを用いた場合， intact血 小板は0.01unit/mlまでのへパリンを完全に中和し， また破砕血小板は0.03unit/ml までのへパワンを7'G

デキストラン硫をの

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夜間f'!:Jj] 351 O. 長 当 0.6 ;g 日.4 Ei 0.2

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@ cont.0.01 0.1 1.0 5.0 D S (mg/mめ は7. デキストラン硫段およびATJlIifil利法のXa 中和作用 議 一 一 一 綴 ::fi~'j.製 ATJlI 0 - -1):トリス綬筒抜 1.0

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求 。6iD _ _ _ _ _ _ _ 下 s'i 0.4 。 町2 む -I a cont.O.

∞

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∞

1 8 1 0 0 1 0 . b l ヘパリン (unit/ml)

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宗

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へパリンおよびA TJlI混和波のXa中平日作用 ③一一~:精製 ATJII

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トりス絞街

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皮

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長 話 さ記 s'i 関 9. デキストラン硫酸およびA TJlI辺住

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1

皮のXa 11]手il作j刊に及ぼす血小紋の

2

3

れ; 重量一一一. : intact1侃小;絞 .1;.--.1;.:破砕血小板 0--0:トリス緩衝液 1.0 0.8

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0.4 0.2 0・・・I r C加t.0.001 0.003 0.01 0.03 0.1 ヘパリン(unit/ml) 凶 10. へパリンおよびATJlIi.足利]i(えのXa rl:t

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1{'ド 用lと及ぼすlUl小板の影怒 @一一@o: intactlUl小板 I:.--A:破M'lfrl小板 0--0:ト1)ス設

i

f:iI法 出淡ltの塩V2

l

皮をあげることにより笠白を浴出した. 会[こ中和することにより，試料の Xa1 わね~i Íì旨を若しく 各fractionそ0.05Mトリス絞筏波 (0.15MNaCl 減弱させた(悶10). を含む， pH 7.4)に対して送

t

f

r

後， DSと滋和して， (2) DS (1.0

.

m

g/mりあるいはへパリン(0.01unit Xa 中和作用を検討すると，へパリンセフアロースに /ml)と血小板第 4因子の等号混合液を試料として残 非吸着分間の fraction4 ~ 6 存Xa活性を測定した.1飢小紋

t

i

J

4国子の対照として た(凶12). は0.05Mトリス絞街液 (0.15MNaClを含む， pH へパリンセフアロースのfraction4 ~ 6をMini合

8.4)を 用 い た .DS は血小板負{J4由子によっては中 con B 15 (Amicon)で法論後， Con Aセプアロー 和されず，吸光度には変化はみられなかった.一方， スによるアフィニティークロマトグラブィーを施行し へパリンは血小板おJ4因子により中和されその活性を たところ， Con A セフアロースに;îl~ 奴:{J'分画の 火い，吸光皮の上昇が認められた(函11) . fraction 5 ~ 9にDSのXa中和作用に対する増強

(OD.405nm) 0.3 三塁( 0.2 • 制限 i

g

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亙 (OD.280nm) 0.3 腿 求 0.2 g 0.1 可 i ィ 山 山 ' z ' 仮 セフアロース CL…6BによるJ

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板主lJ!I¥i:夜の ゲノレクロマトグラフィー

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ヌj11. 自.2 言語 (OD.280nm) 2.

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主主{ = 目 ト ︽ + b E 2 0 + 邑 と コ 且 一 一 一 ↑ ︽ 十 時 N O E P + 入 口 て ど = 一 ト d H + 包 ﹄ ﹄ Z + λ ﹁ 乙 、 ︿ = 一 ト ︽ 十 回 N O E ﹄ 十 一 一 一 ト ︽ + ﹂ ω ﹄ 恥 コ 均 十 (/) 口 (/) Q ( @ l l @ ) m d_皇制、 m X 5 4 3 2 l D-4 0 8 0 8 0 n υ 伊 s -z 島 ・ E E h E a g_ぉ -a g ﹄ l i

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1

t小板抽出分酒 (fraction 28)の影響

I

玄j15. ヘパリンセフアロースによる血小板J11]/J'，放の アフィニティークロ?トグラフィー ほ

1

12. ConAセフアロースで活性を示したfraction5 ~ 9を再びMiniconB 15で濃縮後，セフアロース CL-6B によるゲノレ治過を行い，そのfraction26~30 IC DSとの籾桑効果を認めた(図14).これらの分間の 分子廷は約 100 ， 000~200 ， 000 と推定された. ゲ、/レir.ll:過でi誌も強い活性を示した分間 (fraction 28)とDSを混和後， A T JJIおよびXaを添加して残 存Xa活性を測定すると，トリス援街

i

夜を用いた対照 例よりも明らかにXa活性は中和され減弱した.しか しながら， fraction 28単独では AT涯を絞活しXa 中和能を促進させる効果は認められなかった.また， DSと向様l乙へパリンとの招来効果も検討したが，へ ノfりン (0.001unit/ml)とは相乗効果を示さなかっ た(図15). (OD.280nm) 2.0 (OD.405nm) !040.3

許

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0.1ω芝 〉く 8 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 fraotion number 。 百 一 の OC 国 ﹂ 同 且 OCC 出 巴 i

一

hZH025N.7 守 制 1.5 ~ 1.0 ConAセフアロースによる血小板抽出液の アブィニティークロマトグラフィー 図 13.

デキストラン硫放の抗凝凶作月] 353

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-~ I~ D S (咋/ml).へパリン ωnit/ml) 関 16. デキストラン硫殴添加血波およびへパリン添 1.0

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血設におけるトロンビンi時間と残存トロン ビン活性 重量一一星雲:デキストラン硫酸 0

…

…

0:へノfリン D S (

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時/ml) o . 6 o . 8 10 20 30 40 50 60 待 問 ( 会 ) 3. フィブリノゲンーフィプリン転換過程に及ぼす影 (1)合成主主立法で抗トロンピン活性を示さない低濃

N

のDS0.015 mgjmlを加えた血液のトロンビン時 間は，対照の11.8秒に比絞して，すでに 15.3秒と延 長しており，

DSi

出/sfの増加とともにさらに延長した. ヘパりン加血設の場合もへパリン0.2unitjmlの 低 濃度のときすでに14.6秒と延長していたが， 3 unitj ml に増加しても不変であった.さらにへパリン濃度 を士官すとトロンピン時間は延長傾向を示し，50および 100 unitjmlの波茂ではともに 18.4秒を示した(殴 16) . (2) ブィプリン逗合試験におけるブィブリノゲン溶 液はトロンどン添加によりフィプリンに転化するが， そのフィプリン豆合過程を分光光皮計380nmによる 溺皮変化として経時的に測定すると，

DS

(終主主皮 0.05~0.8 mgjml)添加により談皮依存伎に吸光皮の 上昇の抑制を示し，切らかに

DS

によるブィプリン窓 会の遅延効果が認められた(図17).またヘパリン添 加フィブワノゲン溶液(終濃度1. 0~5.0unitjml) も同様の傾向を示し，ヘパリンによるフィプリン重合 の遅延効来が認められた(図18). 考 察 1. 抗トロンビン作用および抗Xa作用 合成

2

志賀S-2238はトロンビンに対して特異性のあ るアミノペプチド3)25)で，トロンピンにより加水分ftjf されpNAを遊除する.分光光皮計で 405nmにおけ る吸光皮を測定することにより反応液中の遊お!gpNA 図 17. フィプリン窓会反応に及ぼすデキストラン硫 を知ることができる.従って合成

2

志賀S-2238でのi汲 1.0句 0.8..f 長話 5記 g 畿の影怨 光度はトロンピン活性を反決しており，吸光度の低下 ヘ パ リ ン (u

。

nit/ml) ~- 1!.0 5 3 . 0 2 . 0

d d J i : i

10 20 30 40 50 60 時 間 { 会 ) はトロンピン活性の低下を示す.逆l乙言えば，一定量 のトロンどンを加えた後検試料における吸光皮の低下 はその被検試料のトロンピン中和能の増強を意味して いる. 自験炉jにおいて

DS

加血愛でみられた吸光皮の低下 傾向はDS加血琵がトロンピン中和能を有するζとを 示している.しかしながら，この場合

DS

自体がトロ ンピン中和能を有するのか，あるいはへパリンがそれ 白体抗トロンピン作用を持たないにもかかわらず血禁 中のA T1[を賦沼化することによって強力なトロン ピン中和能を示す2)14)30)判的のと同様にDSも血禁中 のA T1[あるいはその他の物質を必要とするのか， という点が問題となる. 図 18. フィブワン霊会反応!と及lますヘパザンの影響 平丸，3)は

DS

とフィブリノゲン液の混合法にトロン

354 飯 g，j ~寺、司 ピンを加えると卜ロンビン時!日jが延反することから，

DS

はへパワンと異なり抗トロンピンとして作用する 場合に強力なplasmaticcofactorを必要としないと 報告しているが，自験

1

9

u

において

DS

とトロンピンの 混合淡についてその液中のトロンピン活性を合成基質 によって測定することにより，

DS

単独の抗トロンピ ン作用を検索すると，

DS

単独ではへパリン単独の場 合と同様トロンビンrl:q:t]能を示さなかった.従って

DS

の抗トロンビン作用の発現にはへパリン同様血張 中のcofactorを必要とするとjぷわれた. Cofactorとしては邸主主中の代表的なプロテアーゼ、 インヒピターである αl

AT

，α2

M

お よ び

AT

lliが 考えられる.そこで， αl

AT

およびα2

M

は 合 ま れ ているが ，

AT

lli{ま含まれていないベントナイト吸着

l

f

n

設と

DS

の混合淡について，そのトロンピ、ン中和

i

t

包 を泌定したところ， ζのj見合液はほとんどトロンピン 仁村和能を示さなかった.従って

DS

の抗トロンビン作 用発現に必至さな cofactorはα1

AT

あるいはα2M よりも

AT

班である可能性が大きいと357えられた. さらに，

DS

が精製

AT

lli添加により強力なトロンビ ン中和能を示す成績から，

DS

はへパリン向様

AT

lli を cofactorとして抗トロンピン作用を発現すること が切践になった. しかしながら，へパリンが一定の民反を越えるとそ のトロンビン中和能が不支となるのに対し，

DS(

立政 IJt依存伎に増強傾向を示した.この点において

DS

は へパリン同様

AT

lli を必35 とするが，その反応1~1支は 必ずしも向総ではないとjぷわれる. なお，へパリンを正常ilili廷に添加した場合へパリン 民民 0.2~3unitjmlではほとんどトロンビン中和能 を示さず， 3~50 unitjmlで浪皮に比例してトロンビ ン，

J

I

和能の増強傾向を示したのに対し，ヘパリンを精 製

AT

lli溶液ζl添加した場合は， 0.02 unitjmlの 比絞的{訟法度においても100unitjmlに お け る と 間 総のトロンピン中和能を示した.ヘパリンにおけるこ の作用態反の棺迄は正常'瓜l張中には含まれるが，精製

AT

1旺溶液lこは存在しないところの血づ、板策4因子 によるへパリン中和作用10)の彰径と考えられる.これ に対し

DS

を正常血設および精製

AT

1江溶液に添加 した場合は，いずれも 0.015~15mgjmlの範関内で

DS

の浪皮依存性にトロンピン中和能の増強傾向を示 し，

DS

はへパリンに比し血小板第4因子の影認を受 けがたいと考えられた.この血小板第4沼子の影響;こ 関しでは後述する. X 国子はプロトロンピンと河 t~L 活性中心 lとセリン を有するいわゆるセリンプロテアーゼめであり，また ともに'1-カノレボキシグルタミン殺を有しり を反応の窃とする37)点において共通点が多い.ーブ']， すでに検討してきたように

DS

はへパリン向様

AT

lli を cofactorとしてトロンビン中和能を示すことは切 らかである. ζれらの点から

DS

は

AT

lli存 在 下 で トロンビン同総

Xa

活性も rt和することは十分J41;ζで きる21)ζの点について合成蕊質をよ

8

いて検討を行っ た.

Xa

が

AT

][ゐf正t下においてへパワンにより中和さ れることは諸家の報告45)47)叫で一致しているのに対し て，

DS

には

AT

lli存在下においてもトロンピンおよ び

Xa

のアミダーゼ活性に対する主

l

J

i

t

iJ効果が認められ ないとの報告20)叫が散見される.しかし，

DS

が

AT

][の賦活化32){ζよる

Xa

中和能を有することは白波例 において明らかである.なお，

E

吉報告の不一致は

DS

の分子;泣， S合虫および検討方法!;J

s

のねi!lflこよると思 われる. AT 濫の iifi't~tl:jJ 心はア jレギニン~~$に存在し，トロ ンビンや

Xa

などのセリンプロテアーゼの活性セリン 残誌と結合して複合体を形成することにより，それら を阻害すると考えられている30)その際の結合比はセ リンプロテアーゼの程

W

i

を

n

J

J

わず常lζ1モノレ対1そ ん である口)21)31) 一方，

AT

lliとへパザンの総会部{立は

ATl

互のりジン残誌とへパリンの硫陵墓の聞で主主じ 28) その結来

AT

lli{まへパリンの総合によって分子 治主主が変化し，

AT

班のアノレギニン残誌が反応しやす くなると考えられている20人

DS

もへパリン河絞その硫波法と

AT

lli のリジン 7~

2

止との間で結合し，

ATJII.DS

の複合体を形成する と考えられるが，すでに述べたように

AT

lli存 在 下 でトロンピンに対して

DS

とへパリンではその反応態 皮にね逃が認められることもあり，

AT

lliと

DS

の 複合体形成についてはさらに検討を要する. なお，

DS

単品についても

MDS

コ…ワ注300と向 等の成絞を得たことから，

MDS

コ…ワ注300のこれ らの性状は添加物の作用ではなく，

DS

の に基づくものと考えられる. 2. 抗

Xa

，t和能ζl及ぼす血小板因子の影響 血小板立H 因子は血小板中の

α

W

I

H

l

i.1こ含まれ， J鼠 小板が刺激されると血中に放出される蛋白である5) その分子長は

SDS-PAGE

で970022 )あるいは

SDS-PAGE

で

1

1

，600土330，ゲノレ務返で40，00023) 定であるが，ヘパリン中和能を有する28)ζとはj認知の 巡りである.

デキストラン硫酸の抗凝固作よiJ 355 オ，:51，f1.!免では0.03unitjm1のへパリンに intactの 血小紋(25X104jμ1)を添加すると，へノfリンは0.01 unitjm1 のカ俗におx~1Jした.さらに凍結融解で細胞肢 を破砕した血小板を添加すると 0.1unitjm1のへパ リンが 0.007unítjm1 の力側に著明に減~1Jした.細胞 肢の破壊によりα頼校中に蓄積されていた

PF4

が溶 液中に流出したことによるものであることは精製

PF

4によってへパリンカ姉が減弱するζとからも推定さ れる. ζの

PF4

の作用は

DS

には全く影響を及ぼし ていないことから，ヘパリン{こ特異的であると考えら れる. へパリンと~なり DS は血ノト板によりその力 {I留を以 弱されることはなく，むしろ 1mgjm1の

DS

は血小 板添加により 5mgjm1相当の力似へと増強された. この増強効よ誌は intactの血小板でも破砕I位ノJ"佼でも ほとんと、間程度の効果を持っており，このことは血小 板細胞内の物質ではなく，血小板J]l;~表面の物立が関与 していることを示唆するものである. ζのlUl小板

i

忍子 についてはへパザンセブアロースアフィニティ…クロ マトグラフィー， Con A セフアロースアフィニティ ークロマトグラフィーおよびケソレクロマトグラフィ… の3段階で分磁を試み， f討冬的ICj!{iられた盛1I

J

¥

板抽出 分間{まA TIIT存在下で

DS

のXa中1泊施を士首強させ る効果のあることを認めた. ζれに対して，へパリン に関しては相乗効果は認められなかった.またこの分

i

i

l

l

H

ま単独ではAT][に対する作用効果も示さず，

1

1

.1知 のA T][賦活化物質とは性格を呉{こしている. Williamsおよび Barrov刊 1iffe46)はへノfリンの皮 下注射あるいは fattymeaI (ミルク)摂取後，血 中へIJ'I'股より遊説してくる hepatictriglyceride lipase (HTGL) IこJUl中の抗 Xa活性をi出会する作用 のあることを報告している.このHTGLはヘパリン セファロ…スに裁和院を示すのに対して，本研究で追 及した血小板間子は混和住を手

J

さず，この点において 両者は異なった笠出と考えられる.この血小板因子に ついては， lt1.i誇精製するまでには主らず部分314Jこ裂にと どまったため，その後状を明確!こすることはできなか ったが， Con A セブアロースに親和也を脊しないこ とから泌蛋白の可能性は否定的であり，ゲ、Jレおif!I!から は分子泣 10~20 万の蛋白であると足、われた.いずれ にしても，血小板IIJ米のこのような性状そ有する因子 は未報告であり，血管内政に存在する proteog1y -can 3叩9) との関連において~l怒(l'j~;誌にも民i沫がもた れる. 3. フィブリノゲンーブィプリン転換過程に及ぼす影

DS

またはヘパリンとiE'iiij(n禁 と の 混 合 液 に つ い て，合成

2

志賀による残存トロンどン活性とフィブリノ ゲンを

2

志賀としたトロンビンi時間を比絞すると，対照 とほとんど等しい吸光度(残存トロンピン活性)を示 す 0.015mgjm1 の DS 加血設および 0.2~3unítjm1 のへパリン加f包装のトロンピン時胞が対照(11.8秒〉 !と比しすでにそれぞれ15.3秒および 14.6秒と延長し ていた. ζのことは

DS

およびヘパリンはA TIITと の共同によるトロンビン中和能以外にも全く別個の抗 凝固有旨を有することを示唆する.さらにこの抗凝閤能 はI血設にへパリン12.5unitjm1を加えたち;合と

DS

0.015 mgjm1を加えた場合を比絞すると， I吸光s'[は 両者ともに0.82を示しているにもかかわらずトロン ピン時間はそれぞれ15.2秒および 19.7秒とへパリン よりも

DS

を加えた場合がより延長していることか ら，ヘパリンよりも

DS

の方がより強い抗i疑問能を有 していると考えられる.上述の王子丸の実験日)で

DS

と フィブリノゲンの混合法のトロンビンi出向が延長した のもトロンピン中和能とは5lJlの抗凝悶能によるものと 忠われる.この点lと関して， Abildgaard 1)はヘパリ ンが cofactor と は 無 関 係 に thrombin-heparin -fibrinogen複合体を形成することによりフィブリノ ゲンがフィプリンに転化することを

i

社主与する作用があ ることを報告している. ところで，フィブリノゲンからフィプリンへの転換 過程についての分子レベルの解析が進められており， それらの知見を綜合すると以下のようになる17)均.す なわちトロンビンはフィブリノゲンα鎖の Arg1 G-G1y17およびβ鋭のArg14-G1y15のペプチド結合を 限定分解し，フィブリノペプチドAおよび Bそそれぞ れ遊:殺するとともにフィブリノゲンはフィプリンモノ マーへと変化する(ステップ1).フィプリンモノマ ーは互いに河端で endto end Iこ結合延長したおJ次分 子が，さらに2本 sideto sideで会合してフィプリ ンポリマーへと進む(ステップ2).ζのフィプリンモ ノマーの主会化は分字削水~{~~~j合や疏水結合などの 3i二 Nj~宗的な会合と 23 えられている.フィプリンポリマー はさらに凝集してフィプリン縞を形成しつつゲ、ル化し ていく(ステップ 3). ヘパリンはその段位荷屯によりthrombin-heparin匂 丞brinogen複合体を形成することによってステップヱ を阻害するりとされており， 1~1~1給月;も向j誌であった. へパワノイドである

DS

においても混合体形成20)によ

356 fiiぬ 窓 司 るステップ1の阻害が推測されるが，今回の検討では その点を確認するζとは不可能であった.しかしなが ら，ステップ 1~3 における全ての反応を含むフィプ リン霊会試験において観察された吸光皮が上昇しはじ めるまでの 1agphase はフィプリン形成H色気の遅延 を表現するものであり4)，DSの 場 合0.2mg/m1以 上，ヘパワンの場合2.0unit/m1 以ーとの濃度でこの 1ag phaseが認められた.これらの1agphaseの存在 はフィブリノゲンーフィプリン転換遅延の原因がステ ップ 2以降ではなくステップ 1にあることを示唆して いる.すなわち， 0.2 mg/m1 以 上 のDSはフィブリ ノペプチドの放lijを阻害することにより， AT][(ζ~Ió 依存性の抗凝菌作用38)すなわちフィブりノゲンーフィ ブワン転換に対する抑制作用を有すると考えられた. 総 括 Dextran su1phate (DS)の抗凝固作用について， ヘパワンと対比しつつ，抗トロンピン作用，抗 Xa作 用， Xa中和能を指標とした血小板との関iiliおよびフ ィプリン形成過程への影響について検討を加えた. 1. DS はへパリン同様A T][を賦活化し， AT]I のトロンピン中和古屋を増強させる作用を有する. 2. DSで賦活化された A T

m

は， Xa 1こ対しでも 中和古屋を有する. 3. DS. A T 1証複合体の抗 Xa作用は血小板添加 により増強したが，ヘパリンの場合は逆に滅弱した. 4. DS と相乗効果を示す血小板因子は分子長 10~ 20万の血小板第 4図子とは異なる蛋白で，ヘパリンと lま柏桑効果を示さない. 5. DS はATml乙非依存性にフィブリノゲンーフ ィプリン転換を阻害した.ヘパリンも同様の限答効果 を議皮ながら示した. 以上， DSの抗凝図作用ζi関して笑

5

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5

2

1

:

訟を表します on the heparin neutralizing activity of また，本研究をすすめるにあたり御協力，御助言を outdated p1ate1et concentrates. Thromb いただいた本学ステロイド医学研究施設化学部内務

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