Microsoft Word - タンパク質溶液内酵素消化 Thermo

タンパク質の

タンパク質の

タンパク質の

タンパク質の溶液内酵素

溶液内酵素

溶液内酵素

溶液内酵素 消化

消化

消化（質量分析用サンプル調製）

消化

（質量分析用サンプル調製）

（質量分析用サンプル調製）

（質量分析用サンプル調製）

質量分析計によるタンパク質解析においては、一般的にタンパク質を還元・アルキル化した後にトリプ シン等で酵素消化して得られた消化ペプチドサンプルが用いられます。本資料ではこのサンプル調製に ついて、専用キットを用いて行う方法、各種試薬や酵素を用いて行う方法、また関連情報として、タン パク質の定量法についてご紹介しています。 内容 内容 内容 内容 １培養細胞の酵素消化（キット使用） ２組織の酵素消化（キット使用） ３酵素消化法（各種試薬や酵素を使用） ４タンパク質定量 ５製品情報 １ １ １ １ 培養細胞培養細胞培養細胞培養細胞の酵素消化の酵素消化の酵素消化の酵素消化（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）

哺乳類培養細胞については、Pierce Mass Spec Sample Prep Kit for Cultured Cells (84840) により還 元、アルキル化、Lys-CおよびTrypsinを用いた酵素消化を行うことができます。詳細はキットのイン ストラクションをご覧ください（インストラクションはwww.piercenet.comにてご覧いただけます）。 ２ ２ ２ ２ 組織の酵素消化組織の酵素消化組織の酵素消化組織の酵素消化（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）（キットを用いる方法）

組織サンプルについては、Pierce Mass Spec Sample Prep Kit for Cultured Cells (84840) を組織サン プル用の改変プロトコルにより用いることで、還元、アルキル化、Lys-CおよびTrypsinを用いた酵素 消化を行うことができます。 組織サンプル用のプロトコル改変内容（キットのインストラクションに対応）は下記の通りです（イン ストラクションはwww.piercenet.comにてご覧いただけます）。 改変の場所： セクションB. Cell Lysisの1および2 改変後の内容： 組織10mgを5倍容量のlysis buffer中でホモジナイズ処理します。 （この後はB. 3に進みます） ３ ３ ３ ３ 酵素酵素酵素酵素消化消化消化法消化法法法（各試薬や酵素を用いる方法）（各試薬や酵素を用いる方法）（各試薬や酵素を用いる方法）（各試薬や酵素を用いる方法） キットを使わずに、各試薬や酵素を用いてタンパク質を還元、アルキル化、酵素消化（Lys-Cおよびト リプシン）を行う方法です。対象サンプルは一般的な方法で調製されたタンパク質溶液になりますが、 溶解しているバッファーの組成によっては適時バッファー交換が必要になります。

・サンプルはタンパク質が50mM ammonium bicarbonate pH 8、または変性バッファー（8M Urea または0.1% SDSを含む50mM Tris pH 8）に溶解した溶液を前提にしています。還元剤や -SH基 に反応する成分が含まれていると還元・アルキル化に影響することがありますので、沈殿・再溶解、

限外ろ過、ゲルろ過、透析などでバッファー交換してください。なお、Ureaを含むバッファーでは、 加熱するとUreaが分解しタンパク質のカルバミル化が起こりますので、温度が（37℃以上に）上が らないように注意してください。 ・トリプシンは、リジン（K）およびアルギニン（R）残基のC端側のペプチド結合を切断します。た だし、これらアミノ酸の C 端側にプロリン残基がある場合や、複数のリジンやアルギニンが隣接し ている場合、切断がおきないことがあります。Lys-C はリジン残基の C 端側のペプチド結合を切断 します。Lys-Cとトリプシンの両方を使うことで消化効率を高めます。 ・トリプシンはpH 7-9において活性を示し、pH 4以下では活性が低くなります。トリプシン消化用 の一般的なバッファーとしては、50mM ammonium bicarbonate pH 8、50mM Tris pH 8、50mM triethylammonium bicarbonate (TEAB) pH 8.5があります。

・トリプシンは、0.1% SDS、1M Urea、10% acetonitrile (ACN) に耐性があり、共存下に使用できま す。高濃度の塩（100mM以上のNaClなど）はトリプシンの活性に影響する場合があります。 ・ Lys-CはpH 8-9.5において活性を示し、消化用バッファーとして、一般的なトリプシン消化用のバ

ッファーを用いることができます。

・ Lys-Cは、0.1% SDS、8M Urea、10% acetonitrile (ACN) に耐性があり、共存下に使用できます。 ・アルキル化に用いるIAA (iodoacetamide)はシステイン (Cys) を修飾し質量が57.02Da大きくなり

ます。データベース検索の際はCysをCarbamidemethyl , Fix（Static）として考慮してください。

Ａ Ａ Ａ Ａ 使用試薬使用試薬使用試薬使用試薬 ・ DTT (20291, 20290) DTT 7.7mgを純水 100μLに溶解し、500mM DTT溶液を調製します（用事調製）。 （20291 DTT, No-Weigh FormatはDTTが7.7mgずつ小分け包装されており便利です）

・ IAA, Iodoacetamide Single-Use (90034)

IAA 9.3 mgを純水100μLに溶解し、0.5M IAA溶液を調製します（用事調製）。IAAは光に不安定の ためなるべく光にあてないようにしてください。

（90034 Iodoacetamide, Single-UseはIAAが9.3mgずつ小分け包装されており便利です）

・ Lys-C Endoproteinase, MS Grade (90051)

Lys-Cを純水に溶解し1 mg/mLストック溶液を調製します。使用分ずつ分注して－80℃で保存します。 ・ Trypsin, MS Grade (90057, 90058, 90059) トリプシンを50 mM 酢酸に溶解し1 mg/mLストック溶液を調製します。このストック溶液は－20℃ にて少なくとも１年は安定ですが、使用分ずつ分注して凍結融解の回数を抑え、また－80℃に保存する ことをおすすめします。 Ｂ Ｂ Ｂ Ｂ 還元・アルキル化還元・アルキル化還元・アルキル化還元・アルキル化

1) タンパク質を50mM ammonium bicarbonate pH 8、または変性バッファー（8M Ureaまたは0.1% SDSを含む50mM Tris pH 8）に溶解します。

Note： ・還元・アルキル化の効率を高めるために変性バッファーの使用をおすすめします。Ureaを用いる 場合は酵素消化の前に除去または1M以下の濃度に希釈する必要があります。Ureaは加熱すると 分解しタンパク質のカルバミル化が進みますので、温度が（37℃以上に）上がらないように注意 してください。 ・他のバッファーを用いる場合、バッファーに還元剤や -SH基に反応する成分が含まれていると還 元・アルキル化に影響することがあります。沈殿・再溶解、限外ろ過、ゲルろ過、透析などでバ ッファー交換してください。 ・タンパク質溶液は濃度0.2-1 mg/mLに調製します。 2) DTT 7.7mgを純水 100μLに溶解し、500mM DTT溶液を調製します（用事調製）。 3) 500mM DTT溶液をタンパク質サンプル溶液に終濃度 20mM（1:25希釈）となるように加え混合し ます。 4) 60℃にて1時間、または95℃にて10分間インキュベートし還元反応を行います。

5) IAA 9.3 mgを純水100μLに溶解し、0.5M IAA溶液を調製します（用事調製）。IAAは光に不安定 のためなるべく光にあてないようにしてください。 6) 0.5M IAA溶液を還元反応後のタンパク質サンプル溶液に終濃度40mM（1:12.5希釈）となるように 加え混合します。 7) 室温にて30分間インキュベートしアルキル化反応を行います（遮光下）。 8) 500mM DTT溶液を終濃度10mM（1:50希釈）となるように加え混合し、アルキル化反応を止めま す。 Ｃ Ｃ Ｃ Ｃ 酵素酵素酵素酵素消化消化消化消化 1) Lys-C を純 水に 溶解 したス ト ック 溶液 を、 タン パク 質 サン プル 溶液 に総 タン パ ク質 重量 に対 して 1:100（1:20から1:100）の比率（w/w）で加え混合します。 Note： ・タンパク質サンプル溶液がUreaを含む場合は1M以下の濃度に希釈して使用します。 ・タンパク質サンプル溶液がSDSを含む場合は0.1%以下の濃度に希釈して使用します。 ・希釈を行うとタンパク質濃度が低くなります。沈殿（アセトン沈殿など）・再溶解によりタンパク 質濃度を下げずにUrea、SDSを除去することができます。沈殿・再溶解はUrea、SDS以外の（酵 素消化や LC-MS 測定に影響する可能性のある）夾雑物除去にも効果がありますので、塩や界面 活性剤を含むサンプルの場合は酵素消化の前に行うことをおすすめします。沈殿させたタンパク 質サンプルは再溶解し難いことがありますが、多くの場合は酵素消化により溶解します。 ・界面活性剤の除去には Detergent Removal 製品を使用することもできます。タンパク質濃度が

100μg/mL以上のサンプルにはPierce Detergent Removal Resin（87780）またはSpin Column （87776, 87777, 87778, 87779）、 タ ン パ ク 質 濃 度 が 1-100μg/mL の サ ン プ ル に は HiPPR Detergent Removal Spin Column（88306）またはSpin Column Kit（88305）をお使いくださ い。

2) 37℃にて2-4時間インキュベートします。

に対して1:50（1:20から1:100）の比率（w/w）で加え混合します。 4) 37℃にて4-24時間インキュベートします。 Note： ・インキュベート中に溶液が蒸発して漏れる可能性がありますので、フィルム等でシールすること をおすすめします。 5) サンプル溶液は－20℃にて保管します（酵素消化反応を止めます）。 Note： ・必要に応じてMS測定の直前にC18スピンカラム（89870, 89873）、チップ（87781, 87782, 87783, 87784）によりクリーンアップを行います。 ４ ４ ４ ４ タンパク質定量タンパク質定量タンパク質定量タンパク質定量

サンプル溶液のタンパク質定量は、Pierce 660nm Protein Assay Kit (22662) を用いた660nm法、ま たはBCA Protein Assay Kit (23225, 23227) を用いたBCA法などにより行うことができます。

・ 660nm法は独自の色素・金属複合体を用いることで、還元剤、界面活性剤、8M Ureaなどの共存下 で測定が可能で、BCA 法や Bradford 法よりも幅広いバッファー成分に対応した方法です。一方、 イ オ ン 性 界 面 活 性 剤 を 含 む サ ン プ ル 溶 液 は 影 響 を 受 け る た め 測 定 が 困 難 で す が 、IDCR (Ionic Detergent Compatibility Reagent, 22663) の添加で対応できる場合があります。

・ BCA法はタンパク質存在下で生じる銅イオン・キレート錯体の発色を利用した方法で、界面活性剤 や塩の影響を受けにくく、またタンパク質の種類（構成アミノ酸）による呈色強度の差が小さいため 定量精度が高い定量法です。一方、サンプル溶液に還元剤やキレート剤が含まれている場合は影響を 受けるため測定が困難です。還元剤存在下の測定は、BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible (23250) またはMicroplate BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible (23252) の使用により対応できる場合があります。 ・ 660nm法とBCA法の比較 定量法 測定波長 共存可能物質の例 測定阻害物質の例 タンパク質間の強度差 660nm 562 nm 界面活性剤 還元剤、キレート剤 小 BCA 660 nm 還元剤、界面活性剤 イオン性界面活性剤 † 大

† IDCR (Ionic Detergent Compatibility Reagent, 22663)の添加により利用可 ・ 660nm法とBCA法の主なバッファーに対する適合性

バッファー 定量法

Cell Lysis Buffer (84840 Pierce Mass Spec Sample Prep Kit for Cultured Cells) 660nm‡ , BCA 50mM Ammonium bicarbonate pH 8 660nm, BCA 50mM Triethylammonium bicarbonate 660nm, BCA

8M Urea 660nm

0.1% SDS, 50mM Tris pH 8 660nm‡ , BCA ‡ IDCR (Ionic Detergent Compatibility Reagent, 22663)の添加により利用可

・詳細は各キットのインストラクションをご覧ください（インストラクションは www.piercenet.com にてご覧いただけます）。

・吸光度測定にNanoDropを用いたタンパク質定量法については、NanoDrop 用タンパク質定量プロ トコルをご覧ください。

５ ５ ５ ５ 製品情報製品情報製品情報製品情報 製品コード 製品コード製品コード 製品コード 説明説明説明説明 包装包装包装包装 酵素消化キット 酵素消化キット酵素消化キット 酵素消化キット

84840 Pierce Mass Spec Sample Prep Kit for Cultured Cells 20-rxn kit 還元・アルキル化

還元・アルキル化還元・アルキル化 還元・アルキル化

20291 DTT (Dithiothreitol), No-Weigh Format 48 x 7.7mg

20290 DTT (Dithiothreitol) 5g

90034 Iodoacetamide, Single-Use 24 x 9.3mg

消化酵素 消化酵素消化酵素 消化酵素

90051 Lys-C Endoproteinase, MS Grade 20µg

90057 Trypsin Protease, MS Grade 5 x 20µg

90058 Trypsin Protease, MS Grade 5 x 100µg

90059 Trypsin Protease, MS Grade 1mg

界面活性剤除去（ 界面活性剤除去（界面活性剤除去（

界面活性剤除去（Detergent RemovalDetergent RemovalDetergent RemovalDetergent Removal））））

87780 Detergent Removal Resin 10mL

87776 Detergent Removal Spin Column, 125µL 25 column 87777 Detergent Removal Spin Column, 0.5mL 25 column 87778 Detergent Removal Spin Column, 2mL 5 column 87779 Detergent Removal Spin Column, 4mL 5 column 88306 HiPPR Detergent Removal Spin Column, 0.1mL 24 column 88305 HiPPR Detergent Removal Spin Column Kit 5mL kit クリーンアップ

クリーンアップクリーンアップ クリーンアップ

89870 C18 Spin Column 25 column

89873 C18 Spin Column 50 column

87781 C18 Tip, 10µL bed 8 tip

87782 C18 Tip, 10µL bed 96 tip

87783 C18 Tip, 100µL bed 8 tip

87784 C18 Tip, 100µL bed 96 tip

タンパク質定量 タンパク質定量タンパク質定量 タンパク質定量

22662 Pierce 660nm Protein Assay Kit 450mL Kit

22663 Ionic Detergent Compatibility Reagent 5 x 1 g

23225 BCA Protein Assay Kit 1L Kit

23227 BCA Protein Assay Kit 500mL Kit

23250 BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible 250mL Kit 23252 Microplate BCA Protein Assay Kit - Reducing Agent Compatible 250mL Kit 製品情報、インストラクションは弊社web (www.piercenet.com) をご参照ください。