185. 半月板自己修復の可能性と新規治療法の確立
大槻 周平
Key words：半月板，再生，scaffold大阪医科大学 生体管理再建医学講座
整形外科学教室
緒 言
半月板損傷は日常診療でよく遭遇する疾患であり，高頻度に変形性膝関節症を引き起こすことからも治療が不可欠な 疾患である．半月板は周囲 1/3 の血行豊富領域と中 2/3 の無血行領域からなるが，無血行領域は自己修復能が低いた め，その治療は損傷半月板の部分切除術がおもに行われている．しかしながら，半月板切除は変形性膝関節症リスクを 増大することが報告されており，機能温存をはかるための修復術が推奨されている． 無血行領域の半月板損傷を修復する方法は，さまざまな研究が行われているが，なかでも間葉系幹細胞（MSC）を 用いた方法は良好な成績が報告されている1-4)．我々は，膝関節内にある膝蓋下脂肪体（IPFP）に多くの MSC が含ま れていることに着目し，その IPFP と半月板の主な成分である I 型コラーゲンを半月板欠損部に併用移植する新規治療 法について検討した．方法および結果
１．ウサギを用いた研究 日本白色ウサギ 20 羽を用いて，2 mm 大の欠損を内側半月板に作製し（図 1），その欠損部位に IPFP, ペルナック® を移植した． 図 1． 半月板損傷モデル． 日本白ウサギの右膝内側半月板前節に 2 mm の欠損を作製．グループは， I）欠損群， II）IPFP 移植群， III）ペルナック®移植群， IV）IPFP とペルナック®併用移植群の４群
とした．それぞれ８週間後に屠殺し観察した．移植後の半月板修復を検討するため，半月板のマクロフォトを用いて炎 症の有無，表面積の変化を観察した．表面積は Image J soft ware を用いてコンピュータ上で計測した（図 2a）． 上原記念生命科学財団研究報告集, 28 (2014)
図 2a． 肉眼所見と表面積． 半月板表面積を Image J を用いて測定した． また，組織評価は Ishida スコアを参考に，再生組織の結合，Safranin-O 染色，線維軟骨細胞の存在を観察した．さ らにその再生組織の変化を詳細に観察するため, I 型及び II 型コラーゲン抗体で免疫染色を追加した．統計学的解析に は Wilcoxon 検定を用い，p < 0.05 を有意差ありとした．結果，ペルナック®単独移植群では，IPFP 単独移植群に比べ 炎症所見を強く認めたが，併用群では炎症所見は減少した （図 2b）．
図 2b． 肉眼所見と表面積．
IPFP (II)，ペルナック®単独移植 (III) 群ではそれぞれ炎症所見を認めるが，併用群 (IV) では炎症所見はみられ
なかった．
欠損群では，半月板前節が前後方向に萎縮しており，半月板は正常に比べ有意に縮小していた（p < 0.05）．IPFP， ペルナック®併用移植群では, 欠損部は修復され，正常半月板と同等の大きさであった （図 2c）．
図 2c． 肉眼所見と表面積．
欠損群 (I) の表面積は，IPFP 移植 (II)，IPFP とペルナック®併用群 (IV)，正常と比べ有意に小さかった．*p <
0.05．
組織学的評価においても，IPFP とペルナック®併用移植群は欠損群と比べ有意に欠損部が修復されていた（p <
0.05）．IPFP もしくはペルナック®単独移植群で，面積は正常半月板と有意差はなかったが，併用移植群に比べ組織学
的には修復が不十分な傾向にあった （図 3a, b）．また，免疫染色でも IPFP，ペルナック®併用群が正常に近い構造と
図 3b． 代表的な組織染色像とその評価．
Ishida スコアは，併用群 (IV) が欠損群 (I) に比べ有意に高いスコアであった．*p < 0.05． ２．ヒト半月板細胞を用いた研究
ペルナック®のヒト半月板治療への可能性を検討するため，変形性膝関節症５症例から採取したヒト半月板細胞
(MC)，IPFP 細胞 (IPFPC) をペルナック®とともに３週間培養を行った．それらを，MC，MC+IPFPC, MC+ペルナッ
ク®, MC+IPFPC+ペルナック®の４グループに分けて，Real time PCR により同化異化に関連した遺伝子発現の変化を
検討した．検討項目は，細胞外基質を形成する I 型，II 型，III 型，X 型コラーゲンとアグリカンおよび軟骨分化因子 である Sox9，アグリカン分解酵素である ADAMTS-5，炎症性サイトカインである IL1-β，タンパク質分解酵素であ る MMP-13 をそれぞれ発現量の変化とした．結果，アグリカンは， MC+IPFPC と MC+IPFPC+ペルナック®共培養で
発現が有意に低下していた．また，MMP-13 は MC+IPFPC+ペルナック®共培養では発現が有意に低下していた （図
4）．その他遺伝子発現については４群間で有意差は見られなかった．これらのことから，MC+IPFPC+ペルナック®共
培養では, 細胞外基質の発現は低いものの，分解酵素である MMP-13 の発現が有意に抑えられていた事から異化作用の 抑制が期待できると考えられた．
図 4． 半月板再生に関連した遺伝子発現の変化．
アグリカンの発現は MC のみと比較し，MC+IPFPC，MC+IPFPC+ペルナック®群で有意に低下した．MMP-13
の発現は，MC+IPFPC+ペルナック®群では有意に抑制されていた．*p < 0.05, **p < 0.01．
考 察
今回の動物を用いたin vivo とヒト半月板細胞を用いた in vitro の研究から，半月板損傷に対して IPFP とペルナッ ク®を併用することで，半月板の大きさのみならず組織学的にも修復が期待され，遺伝子発現変化からもペルナック®
2） Mochizuki, T., Muneta, T., Sakaguchi, Y., Nimura, A., Yokoyama, A., Koga, H. & Sekiya, I. : Higher chondrogenic potential of fibrous synovium- and adipose synovium-derived cells compared with subcutaneous fat-derived cells: distinguishing properties of mesenchymal stem cells in humans. Arthritis Rheum., 54 : 843-853, 2006.
3） Kanda, N., Morimoto, N., Takemoto, S., Ayvazyan, A. A., Kawai, K., Sakamoto, Y., Taira, T. & Suzuki, S. : Efficacy of novel collagen/gelatin scaffold with sustained release of basic fibroblast growth factor for dermis-like tissue regeneration. Ann. Plast. Surg., 69 : 569-574, 2012.
4） Horie, M., Driscoll, M. D., Sampson, H. W., Sekiya, I., Caroom, C. T., Prockop, D. J. & Thomas, D. B. Implantation of allogenic synovial stem cells promotes meniscal regeneration in a rabbit meniscal defect model. J. Bone Joint Surg. Am., 94 : 701-712, 2012.
