研 究 ノ ー ト
脱 脂 米 糠 抽 出物 の ヒ ト由来 食 細 胞 に対 す る
免 疫 賦 活 性 の検 討
宮 崎 由 子 ・阿 部 千 秋*
Effects
of degreasing
rice bran
extracts
on immune
response
Yoshiko
Miyazaki,
Chiaki
Abe
The present report describes the effect of the three kinds of degreasing rice bran extracts (rice bran (Rb),
rice bran extract E (RbE), and rice bran heat water extract (RbhS) on the immune response of human cells.
Samples of Rb and RbE were processed by fermentation with Enterococcus sp. and Pichia sp. at 37°C for 3 to
5 days, subsequently, RbE samples were treated with hemicellulose enzyme. While RbhS samples were
heat-treated and used as the control.
We studied the effect of inactive Staphylococcus aureus cells coated with the three kinds of rice bran
extracts on phagocytosis and phagosome-lysosome fusion by human leukocytes in vitro. Rice bran extracts
increased phagocytic activity and phagosome-lysosome fusion in neutrophils and monocytes in a
dose-response manner. The rate of phagocytosis of RbE-coated S. aureus by neutrophils was significantly higher, by
approximately 3.6 times, than that of uncoated S. aureus. The rate of phagocytosis of RbE-coated S. aureus by
monocytes was about 1.6 times higher than that of the control. The phagosome-lysosome fusion index (FI) for
RbE-coated bacteria by neutrophils was higher, by approximately 6 times, than that of the control. The ratio of
the FI to the phagocytic index (PI) in human neutrophils showed that 83% of phagocytosed cells were digested
the fused phagolysosomes when the S. aureus coated with RbE at a concentration of 25 µg/ml.
These results show that RbE has immune-enhancing activity. Although degreasing rice bran is traditionally
discarded, if processed with Enterococcus sp., Pichia sp. and hemicellulose enzyme, it becomes consumable
and can be used as a health food material to enhance immune activity in humans.
( Received October 19, 2011)
1.緒 言 米糠 は,米 な どの穀 物 を精 白 した際 に 出 る果 皮 や 種 皮,胚 芽 な どの 部分 で あ り,米 を主 食 とす る我 が 国 で は多 量 の 米糠 が生 じるが,ほ とん どは廃 棄 され て い る。 米 糠 には油 分,タ ンパ ク質,食 物 繊 維,ビ タ ミ ン類 ミネ ラル類 な どの 栄養 素 が 豊 富 に含 まれ, 特 に,米 糠 エ キス水 解 物 に含 ま れ る水 溶性 食物 繊 維 の ア ラ ビノ キ シ ラ ンが よ く知 られ,便 通 改 善 や活 性 酸 素 除去 作 用 及 び 免疫 賦 活作 用 な どの 生 理 機 能 を示 す こ とが 既 に報 告 され て い る1-11>。ま た,米 糠 中 に 18%含 まれ る脂 質 は,米 糠 油 と して利 用 され る一 方, 多 くの脂 質低 下 成 分(オ リザ ノ ー ル ・ポ リ コサ ノー 京都 女子 大学 家政 学部食 物栄 養学科, 率立命 館大学 大学 院 スポー ツ健康科 学研 究科 ル ・イ ノ シ トー ル な ど)が 健 康 補助 食 品 と して 見直 され て い る12)。 米 糠 の 主 な 用 途 は,米 糠 油 原 料 33%, ,飼 料 原 料12%,キ ノ コ 菌 床11%,漬 物5% で あ るが,残 りの39%は 廃 棄 され て い る の が 現 状 で あ る。 米 油製 造 の 副 産物 で あ る脱 脂 米糠 に は,タ ンパ ク質 ・食物 繊 維 ・ビタ ミン類 な どの 栄養 素が 多 く残 存 して い る ので,有 効 活 用 す る こ とは グ リー ン ケ ミス トリー の観 点 か ら も重 要 で あ る。 しか し,米 糠 の 食 品へ の利 用 が 進 ん で い ない理 由 には,米 糠 特 有 の好 ま しくな い風 味 や ざ ら ざ ら と した舌触 りな ど が 挙 げ られ る。 そ のた め風 味 や 舌触 りを改 善 した米 糠 製 品 の 開発 が 多 くな され てい る が,米 糠 の 収 率が 低 く,生 理 活 性 にお い て も充 分 満足 で き る結 果 が得 られ て い な い13-16)。 そ こ で,米 糠 を3種 類 の 方 法 で処 理 し,各 々の 免疫 賦 活性 を未 利用 資源 の 有 効活 用 とい う観 点 か ら学 術 的 に検 討 した 。∬.実 験 材 料 と実 験 方 法
1)実 験 材 料 米 糠 抽 出 物 を 下 記 の 処 理 方 法 で 調 製 し た 脱 脂 米 糠 抽 出 物 の3種(ラ イ フ ペ ッ プ,ラ イ フ ペ ッ プE,米 糠 熱 水 抽 出 物)に つ い て 実 験 を行 っ た 。 実 験 材 料 は (株)フ ァ ー マ フ ー ズ よ り寄 与 さ れ た 試 料 を 用 い た 。 a)ラ イ フ ペ ッ プ(Rice bran extract:Rb)水 を加 え た 脱 脂 米 糠 に 乳 酸 菌Enterococcus sp.と 酵 母Pichia sp.を 植 菌 し,30℃,3∼5日 間 培 養 し,濾 過 後,濾 過 液 を 凍 結 乾 燥 して 調 製 し た 。 発 酵 はpH の 変 化,タ ン パ ク 質 の 分 解(SDA-PAGE)を 指 標 と し た 。 発 酵 と と も に,pHが 徐 々 に 減 少 し,タ ン パ ク 質 の 分 解 は 発 酵 後4日 目 で 顕 著 に 起 こ っ て い る こ と を 確 認 し た 。 酵 母 の 単 離 に つ い て は,新 鮮 な 脱 脂 米 糠10gに 生 理 食 塩 水10ml添 加 し て よ く撹 拝 し た 後,遠 心 し て 上 清 を 回 収 し た 。 こ の 上 清 を 生 理 食 塩 水 で 段 階 希 釈 し た 液 を ポ テ トデ キ ス トロ ー ス 寒 天 培 地 に 播 種 し, 30℃ で2∼3日 間 培 養 し た 。 出 現 し た コ ロ ニ ー を ピ ッ ク し て ポ テ トデ キ ス トロ ー ス 液 体 培 地 に 接 種 し,30℃ で1∼3日 間 培 養 し,こ の 培 養 液 を 生 理 食 塩 水 で 段 階 希 釈 して,ポ テ トデ キ ス トロ ー ス 寒 天 培 地 に 播 種 し,30℃ で2∼3日 間 培 養 し,出 現 し た コ ロ ニ ー を ピ ッ ク して 単 離 株 と した 。 乳 酸 菌 の 単 離 に は,培 地 と し て 炭 酸 カ ル シ ウ ム 含 有GYP培 地 を 用 い た 以 外 は,上 記 と 同 様 に し て 米 糠 か ら乳 酸 菌 を単 離 し た 。 上 記 の よ う に し て 米 糠 か ら 分 離 さ れ た 酵 母 及 び 乳 酸 菌 を用 い る こ と に よ り,米 糠 を 効 率 よ く発 酵 させ る こ とが で きた 。 米 糠1質 量 部 に 対 し,水 を 0.2∼50質 量 部 添 加 し,オ ー トク レ ー プ 処 理 に よ り, 殺 菌 を 行 っ た 。
b)ラ イ フ ペ ッ プE(Rice bran extract E:RbE) Rice bran extract Eは 水 を 加 え た 脱 脂 米 糠 に 乳 酸 菌 と 酵 母 を 植 菌 し30℃,3∼5日 間 培 養 し,そ の 後 酵 母 処 理 後 酵 素(ヘ ミセ ル ラ ー ゼ)処 理 し,濾 過 後, 濾 過 液 を 凍 結 乾 燥 し て 調 製 し た 。
c)米 糠 熱 水 抽 出 物(Rice bran heat water solution extract:RbhS) 水 を 加 え た 脱 脂 米 糠 を 滅 菌 し,遠 心 分 離 し た も の を 濾 過 し た 。 濾 過 後 凍 結 乾 燥 し た 。 2)実 験 方 法 A.ラ イ フ ペ ッ プ 液 の 調 製 方 法 3種 の ラ イ フ ペ ッ プ(Rb・RbE・RbhS)は 実 験 時 に1mgを 秤 り,0.1%Gelatin Hanks Buffer l mlに 混 合 し,懸 濁 原 液(lmg/ml)を 作 成 し,3種 ラ イ フペ ップ 原 液 と した 。 各 々 の ラ イ フペ ッ プ 原 液 を 10倍 希 釈 した もの を ラ イ フペ ップ希 釈液(100μg! ml)と した 。 そ の 後,マ イ ク ロ チ ュ ー ブ に 各濃 度 の ラ イ フペ ップ希 釈 液 を加 え,黄 色 ブ ドウ球 菌 死 菌 体 懸濁 液 を1.0×108個!m1に な る よ うに混 合 し,0.1% Gelatin Hanks Bufferに て調 製 し,ボ ル テ ック ス ミキ サ ー に て 混 合 し,ラ イ フ ペ ッ プ 液(Rb・RbE・ RbhS)と した。 B.貧 食 活 性 の 実験 方 法 免 疫賦 活性 の指 標 と して,ヒ ト白血 球(好 中球 ・ 単 球)に 対 す る貧 食 作 用 ・食 胞 融 合 能の 影響 を検 討 した17)。ヒ ト末梢 血 よ り分離 した 好 中球(5x106個/ ml)をcover slip上で90分 間 前 培 養 後,脱 脂 米 糠 か ら 各 々 に 調 製 し た 各 ラ イ フ ペ ッ プ 混 合 液(Rb・ RbE・RbhS)を 黄 色 ブ ドウ 球 菌 死 菌 体(1x10$/ml) に コー トして,好 中球 に加 え て イ ンキ ュベ ー トした 。 好 中球 の 場 合 は37℃ ・60分培 養 し(単 球 の場 合 は, 37℃ で180分),貧 食 作用 を調 べ た。そ の後,メ タ ノー ル で 固定 し,さ ら に メチ レ ンブ ル ー で染 色 した後 顕 微 鏡 下 で 細 胞 内 に 貧 食 され た菌 数 を カ ウ ン ト し た。 各 濃 度 につ い て無 作 為 に240個(30個 ×8ヶ 所) の好 中 球 を選 び,そ の細 胞 内 に貧 食 された 菌 数 を数 え,平 均値 と標 準偏 差 を求 め 貧食 菌 数 と した 。好 中 球 お よび 単球 に貧 食 され た 菌 数 を食 食 能 と し,試 料 の免 疫 活性 化 の 指標 と した 。 C.食 胞 融合 能 の 実験 方 法 貧 食 実 験 と 同様 の 方 法 で,ヒ ト好 中球 を分 離 し cover slipに吸 着 させ た 後,5;u g/mlア ク リジ ンオ レ ンジ 液 を加 え,37℃ で15分 間 反 応 させ,好 中球 の ラ イ ソ ゾ ー ム にプ レラ ベ ル した。 そ の後,0∼50.0 μg!mlの 各 濃 度 に調 製 した ラ イ フ ペ ッ プE混 合 液 (RbE)を 加 え,37℃,60分 イ ン キ ュベ ー ト後,蛍 光顕 微 鏡 にて,ア ク リジ ン オ レ ンジ に染色 され た菌 数 を観 察 した。 食胞 融 合 能 は100個 以上 の 好 中 球 を 観 察 し,1個 当 た りの 好 中球 内 で融 合 して い る細 菌 の 平均 数 に融合 が 観 察 され た好 中球 の割合 を乗 じて 算 出 し,fusion index(FI)と して評 価 した。 FI=(P-L fusionを示 した菌 の 総 数1好 中球 の 総 数) ×(P-Lfusionを 示 した好 中球 の 総 数1好 中 球 の総 数)×100 さ らに,メ タノー ルで 固定 し,レ フ レル メチ レ ン ブル ー で染 色 後,貧 食 活性 を観 察 した。 食胞 融 合 能 と同 様 に好 中球 数及 び菌 数 を求 め,貧 食 活性 の割 合 に対 して貧 食 能 を起 こ して い る 割 合(PI)を 求 め, 貧 食 能 に対 して 殺 菌 さ れ て い る 割 合(FUPI)を 算 出 し比 較検 討 した。
PI=(貧 食 して い る菌 の総 数/好 中球 の総 数)×(貧 食 を示 した好 中 球 の 総 数1好 中球 の 総 数)× 100
皿.結 果 お よ び考 察
脱 脂 米 糠 を 乳 酸 菌 と 酵 母 で 発 酵 し た 抽 出 物(ラ イ フ ペ ッ プ;Rb)と そ の 後 酵 素 処 理 し た 抽 出 物(ラ イ フ ペ ッ プE:RbE)お よ び 脱 脂 米 糠 の 熱 水 抽 出 物 (Rbhs)の3種 を 試 験 試 料 と し,好 中 球 お よ び 単 球 に 対 す る 貧 食 活 性 を 検 討 し た 。 各 濃 度 に つ い て 無 作 為 に240個(30×8箇 所)の 好 中 球 お よ び 単 球 を 選 び, そ の 細 胞 内 に 貧 食 さ れ た 菌 数 を カ ウ ン ト し た 。 そ の 菌 数 の 平 均 値 と標 準 偏 差 を求 め,そ の 結 果 をFig,1 に 示 した 。 ヒ ト好 中 球 に 対 す る 貧 食 活 性 は,3試 料 と も,濃 度 に 依 存 し て 貧 食 作 用 を 促 進 し た 。 ラ イ フ ペ ッ プE (RbE)で は5μg/mlで プ ラ トー に 達 し,5μg!mlの 濃 度 で コ ン トロ ー ル(0μg/ml)に 比 べ3.6倍(pく0.001) の 促 進 作 用 が 認 め ら れ た(Fig.1B)。 ラ イ フ ペ ッ プ (Rb)で は25μg/mlで プ ラ トー に 達 し,コ ン トロ ー ル の2.5倍(p<0.OOI)の 促 進 作 用 で あ っ た(Fig.1A)。 乳 酸 菌 や 酵 母 で 発 酵 し て い な い 熱 水 抽 出 物(RbhS) で は,60μg!mlの 濃 度 に お い て,コ ン ト ロ ー ル に 比 べ2.7倍(p<O.001)の 貧 食 活 性 を 示 し た 。 結 果 と してRbEの 場 合 が 最 も 貧 食 活 性 の 促 進 を 示 し た 。 ま た,単 球 に 対 す る 貧 食 活 性 に お い て も(Fig.1), 好 中 球 の 場 合 と 同 様 な 傾 向 を 示 し た 。RbEで は1,5 倍(25,u g/ml, p<0.001)の 貧 食 活 性 を 示 し, Rbは, 1,6倍(25μg/ml, p〈O.001),RbhSで は1.3倍(60 μg!ml, p<0,001)の 促 進 を 示 し た 。 RbhSに 比 べ,Fig. 1 Effect of rice bran extracts on phagocytosis by human neutrophils and monocytes. (A) Rice bran extract (Rb), (B) Rice bran extract E (RbE), (C) Rice bran heat water solution extract (RbhS). Values represent mean ± SD. Significantly different from control, ***p<0.001
Fig. 2 Relative values of rice bran extracts on phagocytosis by human
neutrophils (A) and monocytes (B).
Fig. 3 Effect of rice bran extracts on phagosome-lysosome fusion by neutrophils. Values represent mean
± SD . Significantly different from control, *p<0.05, **p<0 .01 RbEとRbに 促 進 傾 向 が 認 め ら れ た 。 次 に,Rb及 びRbE, RbhSの3種 間 を 比 較 検 討 す る た め に,コ ン トロ ー ル 値 を100と し た 相 対 値 で 示 し た(Fig.2)。 そ の 結 果, RbEで は,未 処 理 の RbhSよ り1/12量 で 活 性 を 示 し,ま た 乳 酸 菌 と 酵 母 の み で 処 理 したRbよ り,115量 で 活 性 を 示 し,ラ イ フ ペ ッ プE(RbE)の 貧 食 活 性 が 最 も 強 い こ と が 認 め ら れ た 。 さ ら に,最 も 貧 食 活 性 の 強 か っ たRbEに つ い て, 食 胞 融 合 能 を 検 討 し た(Fig.3)。 そ の 結 果, RbE濃 度 に 依 存 し て 食 胞 融 合 能 の 活 性 が 上 昇 し,RbE濃 度 5μg/mlに お い て コ ン ト ロ ー ル に 対 して6倍 の 食 胞 融 合 能 を 示 し た 。 取 り込 ま れ た 貧 食 細 胞 内 に お い て,ど の 程 度 殺 菌 し て い る か ど う か を 検 討 す る た め に,食 胞 融 合 率/ 貧 食 率(FI/PI)を 求 め,貧 食 細 胞 内 に お け る 殺 菌 能 と して,評 価 した(Table 1)。 Table 1に 示 し た よ う に, RbE濃 度5μg/mlに お い
Table 1 The ratio of fusion index against phagocytic index of rice bran extracts-coated S. au•eus in
human monocytes.
Conc. of RbE
(jg/m1)
FT PI FI/PI 0 02 1.0 5.0 25.0 107.1 115.5 300.8 622.8 414.0 295.1 384.6 489.3 8972 501.4 0.363 0.300 0.615 0.694 0.826The fusion index(FI)was defined as the percentage of positive phagosome-lysosome fusion multiplied by the mean number of fused phagosomes per phagocyte. The phagocytic index(PI)was defined as the percentage of positive phagocytosis multiplied by the mean number of phagocytosed bacteria per phagocyte.
て,貧 食細 胞 内 に お い て,69%が 殺 菌 し,25μg! mlの 濃 度 で約83%が 殺 菌 され て い る こ とが 確 認 で きた 。 この こ とは,脱 脂米 糠 を乳 酸 菌 ・酵 母 処 理 後 酵 素(ヘ ミセ ル ラ ーゼ)処 理 す る こ とに よ って,貧 食 活 性 お よび 食 胞 融 合 能 が 促 進 す る こ とが 明 確 と な った。 以 上 の こ とか ら,米 糠 を乳 酸 菌 ・酵 母 処 理 後 ヘ ミセ ル ラ ーゼ 処理 す る こ とに よ って 米糠 の 有 効 活用 が 可 能 で ある こ とが 示 唆 され た。 ].V.要 約 3種 類 の 方 法 で 調 製 した 脱 脂 米 糠 抽 出 物 に つ い て 免 疫 賦 活 性(貧 食 活 性 と 食 胞 融 合 性)の 視 点 か ら, 未 利 用 資 源 と し て の 活 用 可 能 性 を 検 討 し た 。 (1)ラ イ フ ペ ッ プ(Rb)は 乳 酸 菌 ・酵 母 処 理(37℃ ・ 3∼5日)。 (2)ラ イ フ ペ ッ プE(RbE)は 乳 酸 菌 ・酵 母 処 理 後 酵 素(ヘ ミ セ ル ラ ー ゼ)処 理 。 (3)熱 水 抽 出 物(RbhS)は オ ー トク レ ー プ 処 理 。 何 れ の 処 理 サ ン プ ル も,凍 結 乾 燥 後 試 験 に 供 し た 。 そ の 結 果,ヒ ト好 中 球 に 対 す る 貧 食 活 性 は,3試 料 と も,濃 度 に 依 存 してu食 作 用 が 上 昇 した 。RbEで は5μg/mlプ ラ トー に 達 し,コ ン トロ ー ル に 比 べ3.6 倍(p<0.001)の 活 性 を 示 し た 。 ま た,単 球 に 対 す る 貧 食 活 性 で は,RbEが1.6倍(p<0.OOI)活 性 を 示 し た 。RbEは,脱 脂 米 糠 の 熱 水 抽 出 物(RbhS)と Rbよ り高 い 活 性 を 示 し た 。 最 も 貧 食 活 性 の 強 か っ たRbEの 食 胞 融 合 能 は,コ ン ト ロ ー ル に 対 し て6倍 の 食 胞 融 合 性 を 示 し,25μ g/mlの 濃 度 で 貧 食 さ れ た 菌 の う ち 約8割 が 殺 菌 さ れ る こ と が 確 認 で き た 。 こ の 結 果,脱 脂 米 糠 を 乳 酸 菌 ・酵 母 処 理 後 酵 素(ヘ ミセ ル ラ ー ゼ)処 理 す る と, 貧 食 活 性 を 促 進 で き る こ とが わ か り,免 疫 賦 活 作 用 を 示 す 利 用 資 源 と し て 役 に 立 つ こ と が 明 確 と な っ た 。
謝辞
この研 究 は(株)フ ァー マ フ ーズ との共 同研 究 に 伴 う補 助 金 に よ り実 施 し,ご 協 力 頂 い た 渡 辺 和哉, 山 口頂様 に深 謝 い た します 。 V.引 用 文 献1) Ghoneum,M. Enhancement of Natural Killer cell activity by modified Arabinoxylan from Rice Bran
(MGN-3). Int. Innnunotherapy 14, 89-99 (1998). 2) Ghoneum,M. Anti-HIV activity in vitro of
