昭 和52年11月(1977年) 一29
平 衡 透 析 法 に お け る 誤 差 の 原 因
中 森 裕 子*
Sources
of Error
in Analytical
Equilibrium
Dialysis
Hiroko Nakamori
1緒
言
多 くの 生 理 活 性 物 質 は 生 体 高 分 子 と の相 互 反 応 を通 じて そ の 生 理 的 機 能 を発 現 す る。 従 って,高 分 子(A)と 低 分 子 リガ ン ド(B)の相 互 反 応 の解 析 は 生 化 学 の 分 野 に お い て は 最 も基 本 的 な作 業 の 一 つ で あ る。 平 衡 透 析 法 に よ って A十B≠AB十AB2十 … …ABn (1) (1)式の 反 応 の結 合 パ ラ メ0タ ー を測 定 す る場 合,原 理 的 に は 図1に 示 す よ うに ア ク セ プ ターAと リガ ン ドB の溶 液 を半 透 膜 で仕 切 り,Bの β相 に お け る平 衡 濃 度 を測 定 す る こ とに よ って 結 合 型Bの 濃 度 を知 る こ とに な る 。しか し,実 際 に はBの β相 にお け る平 衡 濃 度 はA と の結 合 に一 義 的 に依 存 す る の で は な く,Bの 半 透 膜 面 へ の吸 着 や浸 透 圧 に よ る容 積 変化 の 影 響 を受 け る。 従 来,操 作 と装 置 の簡 便 さ の た め,図2aに 示 す よ う な 方 法Dを 取 る こ とが 多 く,事 実,学 生 実 験 にお い て も同 方 法 を採 用 して来 た 。 しか し,特 に学 生 実 験 の よ 去 され る が,従 来 の 方 法 で は こ の条 件 は 満 た され な い 。 ② の 影 響 は,結 合 型 のBの 濃 度 ま た は α相 の容 積 変 化 の 度 合 を 直 接 測 定 出 来 る 場 合 は 問 題 に な ら ない が,一 般 に多 成 分 系 に お け る こ の よ うな測 定 は容 易 で は な い 。 浸 透 圧 効 果 は α 相 と β相 の 液 面 の高 さ を ほぼ 等 し くす る こ とに よ っ て測 定 誤 差 範 囲 内 に お さ え る こ とが 出 来 るが,従 来 の 方 法 で は透 析 膜 の両 端 を結 ぶ 時 に 内部 の 圧 力 が ば らつ き,誤 差 の原 因 に な る。 これ ら の誤 差 を 除 去 す る の に い くつ か の 手 段 が 考 え られ る が}特 に 学 生 実 験 で要 求 され る簡 便 さ を考 慮 してfこ こ で は 図2bに 示 す よ うな方 法 を考 案 し,従 来 の方 法 と比 較 検 討 して み た。 ま た,こ こ で使 用 したBSA一 メ チ ル オ レ ンジ の 反 応 系 は 古 く か ら 研 究 され て い る が,結 合 様 式 に つ い て は 明 ら か に され て い な い の で, 合 わ せ て こ こ で検 討 した い と 思 う。 図1 平 衡 透 析 法 うに操 作 や条 件 を一 定 にす る こ とが 困 難 な場 合,こ の 方 法 に よ る測 定 値 は 大 き くば らつ く。 測 定値 の誤 差 の 主 要 な原 因 は,① 低 分 子 リガ ン ドBの 膜 面 へ の 吸着 と ② 浸 透 圧 に よ る α相 の 容 積 変 化 で あ ろ う。 ① の影 響 は 半 透 膜 と溶 液 との接 触 面 を一 定 に保 つ こ と に よ って 除 図2 平 衡 透 析 法(a:従 来 の 方 法(方 法1), b:改 良 法(方 法H))皿 実 験 方 法
*生 物化 学研究室 1 試 薬 お よび 反 応 溶 液 の 調 整 使 用 したBSA(2 x Cryst.)はSigmaの 製 品 で,メ- 30-チルオレンジその他の試薬はすべて特級のものを使用 した。 BSA (14μM)およびメチルオレンジ(20---200μM) は0.02%窒化ナトリウムを含むシェーレンセンのリ ン酸緩衝液 (M/15，pH 5. 6)で調整した。 Visking tube (20/32)は蒸留水で4"'5時間煮沸した後，アル コーlレで、充分洗い使用した。 2 操 作 ①従来の方法(以後，方法Iと命名) ; BSA溶液(A) 5m1をViskingtubeに取り，予め10m1のメチルオ レンジ溶液(B)を入れた試験管 (A-21)に入れ，バラフ ィルム数枚で覆う(図 2a)。対照として BSAの代わ りに 5m1の緩衝液を用いて同じ操作を行なう。 20， 25， 50， 100， 200μMの各濃度のメチルオレンジ溶液 について， BSAと対照の組を用意する。 ②改良法(以後，方法
E
と命名) ;予め 14cmに切 り揃えた ViskingtubeにBSA溶液(A)5 m1を入れ， シリコン栓にはめて吊し，予め上記の各濃度のメチル オレンジ溶液(B)10m!を取った試験管 (A-24)に入れ る。膜の内外の液面の高さがほぼ同じになるようにゴ ム栓とガラス棒で調節する(図 2b)。反応液を時々振 還しながら5.C (低温恒温水槽) または35.C (僻卵 器)で1
週間放置し，平衡に達せしめる。膜の内部の メチルオレンジは遊離型またはAと結合した形で、存在 するが，平衡時における遊離型メチルオレンジの自由 エネルギーは膜の内外で、等しくなる。従って，外液の リガンド濃度を460nmでの吸光度から測定することに よって，B
の遊離型および結合型の濃度を知ることが 出来る。 3 結合パラメーターの測定(
1
)
式によって示されるAのn ケの結合サイトへのB の結合が独立かっ同等であれば，結合等温線は， nkCB _.. 1 1 . 1。
=
1
"
王
KCB又は
0-=五玄否瓦十五
(2) によって与えられる。ここで0はA1モノレ当りに結合 しているBのモル数で(3)式によって示される量であり，K
は結合定数，Cx
および(
C
x
(X=A
またはB
)
はそれハ ハ
(j= L-Bデ 旦 (3) しA ぞれ成分Xの全濃度 (M) および遊離型濃度を示す。 実験的に0を求めるには(4)式を適応すればよいが， リ ー CBVBー (VA+VB)C。 一 一
CA VA~
(4) ガンドの膜面への吸着に対する補正項を加えると (5)式 が得られる。 食物学会誌・第32号 (VA十VB) (j= ー (CB'-CB) (5) CA VA ここで， VAおよびVBはそれぞれ膜の内部と外部の搭 液の容積であり， CBは外液中のBの濃度， CB'は対照 実験における外液のBの濃度を示す。 Kとnは0とCB1
1
を(2)式に従って逆数プロット(
o
vs・eB)して得ちれ る直線の切点と勾配から計算される。しかし， もしA のnケの結合サイトに対する Bの結合が非協調的また は協調的な場合には結合等温線は双曲線からずれ，従 って逆数プロットも直線にならない2_5)。ここで使っ ている BSAーメチルオレンジの反応系は双曲線形の 結合を示すので， nと K は逆数プロットから計算し た。 BSAとメチノレオレンジの結合の性質を調べるため に，反応の標準自由エネルギ一変化〈ムF
O ) を(6)式か ら求めた。エンタルピ一変化(ムHO ) が強い温度依ム
FO=
-RTlnK (6) 存性を示す場合には， (7)式を適応しなければならない δ(1nK)ム
HO =RT2C
一
万
<
:
r
-
/
J
p (7) が，測定温度が5'Cと350 Cの二点しかないため， '-' -では(8)式によって示される条件を仮定して(9)式から概 算した。(~等工)
p=ム
C円 (8)ー 一 九
1
一h
d
一
R
L
E
n 皿 実 験 結 果 表 1にはメチノレオレンジの遊離型平衡濃度 (CBうの 測定値と (j-lの計算値の一例を示しである。 表1 50 Cにおける結合データー CA(仙
の
CB(ρM)CB(μM) CB'-CB (j-lCB-1(M-l) 14 200 105. 80 18. 30 O. 255 O. 95 x 104 方 11 100 49.30 10.95 0.426 2.02 法 11 50 24.00 5.80 0.805 4.17 11 25 11.30 3.56 1.311 8.85 11 20 9.35 2.66 1.754 10.70 14 200 97. 00 25. 00 O. 1871
.
03 x 104 方 11 100 45.75 14.30 0.326 2.19 法 11 50 22.56 7.04 0.663 4.43E
H 25 10.88 4. 00 1. 167 9. 19 11 20 8.81 3.19 1.463 11.35昭和52年11月(1977年〉 従来の方法(方法1)と改良法(方法ll)による測定 値のばらつきを比較するために逆数フ。ロットを行なう と図
