博士（ 獣医学 ）久保 田浩司
学 位 論 文 題 名
胸 線 外 環 境 に お け る CD4 ― CD8‑ ロ BT 細 胞 の 分 化 発 生 と そ の 認 識 抗 原 に 関 す る 研究
学位論文内容の要旨
T細 胞 抗 原 レセ プ タ ー(TCR)の レ パ ー ト リー形 成は ，抗 原レ セプ タ一 遺伝 子群 のラ ンダムな再構成によって生じる自己反応性T細胞の除去過程としてのnegative selection
（負の選択）と、自己のMHC拘束性の獲得過程としてのpositive selection（正の選択）
を 基本 とす る。 この よう な正負 の選 択に基づいたレパートリー形成は，胸腺におけるT 細 胞分 化の いわ ばセ ント ラル・ ドグ マである。他方で，近年の研究成果から，一部のT 細 胞は 胸腺以外の組織において分化することが次第に明らかにされてきた。そのような T細 胞 上 に 発現 するTCRレ パー トリ ーは 多様 性に 乏し く、 また 自己 反応 性T細 胞も 出現 し てく るこ とか ら、 そのTCRレ パー トリ一成立機構が胸腺におけるルールと基本的に異 な って いる 可能 性が ある ことが 示唆 され てい る。 しか し生 体内 においてその限定レた TCRによ って 認識 され る抗 原の 実体 がい かな るも ので あるの か、 またそのT細胞群の生 理 的機 能は何であるのか、という緒問題についてはこれまでほとんど明らかにされてい ない。
そこ で本 論文 では 、面vitroでの 胸腺非依存性T細胞分化系を用い、そのTCRレパート リ ーと 認識 抗原 を明 らか にする こと により、胸腺外環境におけるT細胞の発生様式を明 ら か に す る こ とを試 みた 。ま ずは じめ に、 イン ター ロイ キン3（IL3)及 びイ ンタ ーロ イ キ ン2 (IL2)の連 続刺 激に より 試験 管内 で直接 幹細 胞か ら胸 腺非 依存 性に 分化 した と考えられる（ニD4―CD8―(double negative: DN)ロBT細胞株のTCRレパートリーを解析 し た 。 そ の 結 果、そ のTCRレ パー トリ ーは 、Vロ4とVロ2を 高頻 度に 用い てい るこ とが 明 か と な っ た 。また その ロ鎖 のVD結合 部に おい てN領 域の 塩基 の挿 入が ほと んど 認め ら れ な か っ た 。こう したDNロ ロT細胞 株の 現象は 長期 培養 の結 果生 じた 可能 性が 考え ら れる ので 、短 期培 養系 を用い て実 験を行った。その結果、成熟T細胞を完全に除去し た ヌー ドマ ウス 脾細 胞や 胎児脾 細胞 をIL3で一週間培養することにより、Vロ2゛DNロロ T細 胞が 選択 的に 誘導 され るこ とが 認められた。そのVロ2T．CRのVDJ結合部の塩基配列 を 用 い て 決 定 し た と こ ろ 、 結 合 部 のN領 域 塩 基 の 挿 入 は 非 常 に 少 な く 、さ らにID誘 導 性 のDNaロT細 胞 株 上 に 高 頻 度 に 発 現 し て い たVロ2TCRと 全 く 同 一 のVロ2TCRも 確 認 さ れ た 。 同 時 に こ の 均 一 なVロ2鎖 とDNaロT細 胞株 にお いて 常に へテ ロダ イマ ーを 形 成す る均 一なVa4鎖 の発 現も 同様 に確 認さ れた 。こ れらの 結果 によりIL3によって血
vitroにおいて非常に限定したTくニRレパートリーを有するDNロロT細胞が前駆細胞より直 接誘導されることが示された。
次 に こ のin v加 に お いてIDに よっ て誘 導さ れたDNT細 胞の カウ ンタ ーパ ー卜 と考 え ら れるT細胞 亜集 団が 、実 際の 生体 内に おい ては 胸腺非依存性に造血組織である骨髄に 限 局 し て 存 在 し て い る こと を明 らか にし た。 っま り、 まず 第一 に骨髄 のDNT細 胞の50
〜60％ がVロ2TCRを 発 現 し てい た。 第二に 、若 齢ヌ ード マウ スの 骨髄 にも 同様 にVロ2 を 高 頻 度 に 発 現 し たDNT細 胞が 正常 マウス と同 様に 存在 した 。第 三に その ヌー ドマ ウ ス の骨 髄T細 胞のVロ2゛TCRのv/D結 合部 の塩 基配 列に はN領 域の 塩基 の挿 入が 認められ な い 多 様 性 を 欠 くTCRで あ っ た 。 加 え て 骨 髄DNT細 胞 の 発生 には 、主 要組 織適 合複 合 体 （MHC）に 連鎖 しな い優 性の 遺伝 的支 配下 にあ るこ とが 示され たこ とよ り、 このVロ 2゛ 骨 髄DNT細 胞 の 発 生 に はMHC非 依 存 性 の 選 択 機 構 が 関 与 し て い る が 示さ れ た 。 最 後 に 、 こ のDNT細 胞 上 に高 頻度 に発現 する 均一 なTくR（Va4JaTA28ルロ2Dロ1．1J ロ2．6）の 認識 抗原 の同 定を 試みた 。そ のた めに まず 、こ のTCRを発 現す るDNT細胞株 nn15よ りT細 胞 ハイ ブ リ ド ー マ15H1．2を 作 製し た 。15H1．2はTCRか らの 刺激 によ り 増殖抑制を認めたことから、この特性を利用レて15H1．狐℃Rの認識抗原の探索を行った。
そ の結 果、 認識 抗原 はMHCハプ 口タ イプ に関 係な くMHくコ亢原の発現の弱い胸腺細胞上 に 存在 する こと が示 唆さ れた 。さら に古 典的MHCの発 現を 欠くEC細胞 株も15H1．2の増 殖 を強 く抑 制し た。 そこ でEC細胞株arF9に対 する モノ クロ ―ナ ル抗 体を 作製 し、田F9 による15H1．2の増殖抑制の解除を指標にしてスクリーニングレた結果、14．37抗体を得 た。その14．37抗体によって認識される14．37抗原の発現をマウスの個体発生を追って調 べ てみ ると 胎生 期か ら新生児期までは強く発現し、その後発現は急速に減少し成獣マウ ス での 発現 は非 常に 低かった。さらに各時期において14．37抗原の発現とMHCクラスI抗 原 の発 現は 互い に相 補的な関係が認められた。最後に14．37抗原をコードする遺伝子を クロー．ニングした結果、ヒト4F2抗原重鎖のマウスの対応分子であることが明かとなっ た 。 こ れ ら の 結 果 か らVロ4ル ロ2を 発 現 す るDNロ ロT細 胞 は 、MHC非 依 存 性に 標 的 細 胞 上 の 胎 児 性 活 性 化 抗 原 の ー つ で あ る4F2抗 原 を 認 識 す る こ と が 示 さ れ た 。 以上 の結 果はIL3に よる 新規 の造 血反 応に 伴っ て胸腺非依存性に誘導されるVロ4ルロ 2DNT細 胞 は 、 そ の 限 定 し たTCRレ パ ー ト リ 一 形 成 及 びMHC非 依存 性の 抗原 認識 の点 に お いて 明ら かに 胸腺 由来 のT細 胞と は異 なっ たル ール に従 って発 生し てく るT細胞であ る こと を強 く示 唆レ ている。そレて、実際の生体内においても造血組織である骨髄に限 局 レ て 同 様 のVロ2゛DNT細 胞 亜 群 が 存 在 す る こ と は 、 この ユニ ークなDNT細胞 亜群 の 発 生 様 式 が 造 血 環 境 に お い て は 普 遍 的 現 象 で あ る こ と を 強 く 示 唆 レ て い る 。
学 位 論 文 審 査 の要 旨 主査 教授 小沼 操 副査 教授 斉藤昌之 副査 教授 岩永敏彦
副査 教授 上出利光（免疫科学研究所）
学位論文題名
胸 線 外 環 境 に お け る CD4 − CD8‑apT 細 胞 の 、 、
分 化 発 生 と そ の 認 識 抗 原 に 関 す る 研 究
T細胞 抗原 レセプター(TCR)のレバートリー形成は、胸腺において抗原レセプター遺伝子 群のランダムな再構成によって生じる自己反応性T細胞の除去と自己の主要組織適合複合体 (MHC)拘 束 性 の 獲 得 を 基本 とし ている 。一 方、 胸腺 外で分 化す るT細胞 のTCRレ バー トリ ーの形成ならぴに認識抗原は不明である。本研究では胸腺外分化T細胞の生理機能を知るた めに、そのTCRレパートリーと認識抗原の解析を行った。
まず血vitroでインターロイキン3(IL3)存在下で胸腺非依存性に分化するCD4'CD8‑くdouble negative:DN)apT細 胞 を 用 い 、 そ のTCRレ パ ー ト リ ー を 解 析 し た 。 そ の 結 果 、TCRは Va4とvp2を 高 頻 度 に 用 い て お り 、 そ のp鎖 のVDJ結 合 部 に お い てN領 域 の 塩 基 の 挿 入 がほとんど認められなかった。この結果はIL3がin virroにおいて前駆細胞より非常に限定し た Tく Rレ バ ー ト り を 有 す る DNロ pT細 胞 を 誘 導 す る こ と を 示 し て い る 。 次に 生 体 内 で の 分 布 につい て検 討し たと ころ、 骨髄 のDNT細 胞の50〜60％がVp2TCRを 発現し てお り、 若齢 ヌード マウ スの 骨髄 にも同 様にvp2を高 頻度 に発 現したDNT細胞が正 常マウ スと 同様 に存 在した 。 さら にこ のvp2゛TCRの丶ゆ結合部の塩基配列にはN領域の 塩基の 挿入 が認 められず、MHCに連鎖しない遺伝的支配下にあることより、このvp2゛骨髄 DNT細 胞 の 発 生 に はMHC非 依 存 性 の 選 択 機 構 が 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 最 後 に こ のDNT細 胞 上 に 高 頻 度 に 発 現 す る 均 一 なTCR (Va4J￠TA28/vp2Dpl.1Jp 2．6） の認 繊抗 原の同定を試みた。その結果、認識抗原はMHCハプロタイプに関係なくMHC 抗原の発現の弱い胸腺細胞上に存在することが示唆された。本抗原はマウスの胎生期から新 生子期までは強く発現し、その後発現は急速に減少し成獣での発現は非常に低かった。本抗 原をコードする遺伝子をクローニングした結果、ヒト4F2抗原重鎖のマウスの対応分子である こ と が 明 か と な っ た 。 こ れ ら の 結 果 か らVロ4/vp2を 発 現 す るDN apT細 胞 は 、MHC 非依存性に標的細胞上の胎児性活性化抗原のーつである4F2抗原を認識することが示された。
本 研究 によ り胸 腺非依 存性 に誘 導さ れるV 4/vp2DNT細胞 は、 限ら れたTCRレバ ート リーの形成及ぴMHC非依存性の抗原認識の点において胸腺由来のT細胞とは異なっており、
造血組織では普遍的に認められることが明かとなった。
この研究は 胸腺外分化T細胞の生理的機能を解明するのに重要な知見を提供するものであ る。 よって審査員一同は久保田浩司氏が博士（獣医学）の学位を受けるのに十分な資格を有 するものと認めた。
