，糖尿病性腎症の成因に炎

(1)

はじめに

糖尿病を誘発したラットの腎臓では intercellular adhesion molecule（ICAM)‑１の発現が増加し，糸球体内へのマクロファージの浸潤が増加する

¹⁾

．逆に，

ICAM‑１を欠損した（ICAM‑１

^-/-

）マウスでは，糖尿病誘発後の腎臓へのマクロファージの浸潤や腎機能障害が抑制されることから

²⁾

，糖尿病性腎症の成因に炎

症が関与していることが示唆される．我々はまず，糖尿病性腎症の腎組織において炎症を制御し，新規治療ターゲットとなり得る分子を同定するため，DNA マイクロアレイでスクリーニングを行った

³⁾

．

DNAマイクロアレイとCCKの局在

８週齢の雄性野生型マウス（C57BL/6J；WT）と ICAM‑１

^-/-

マウスを① WT，② ICAM‑１

^-/-

，③糖尿病 WT および④糖尿病 ICAM‑１

^-/-

に分け，糖尿病（DM）

群は８および９週齢時に streptozotocin（STZ）100㎎/

㎏の腹腔内投与を行い，非糖尿病（NDM）群はクエン酸緩衝液の腹腔内投与を行った．糖尿病誘発３か月後に腎臓を採取し，腎皮質の遺伝子発現プロファイルを

糖尿病の腎臓において cholecystokinin はマクロファージに対する抗炎症作用を介した新規の保護効果を発揮する

宮本聡

^a＊

，四方賢一

^a,b

，宮坂京子

^c

，岡田震一

^a

，佐々木基史

^a

，小寺亮

^a,b

，廣田大昌

^a

，梶谷展生

^a

，高塚哲全

^a

，片岡仁美

^a,d

，西下伸吾

^a

，堀口千景

^a

，船越顕博

^e

，西森久和

^f

，内田治仁

^a

，小川大輔

^a,g

，槇野博史

^a

岡山大学大学院医歯薬学総合研究科 ^a腎・免疫・内分泌代謝内科学，^d地域医療人材育成，^f血液・腫瘍・呼吸器内科学，^g糖尿 病性腎症治療学，^b岡山大学病院新医療研究開発センター，^c東京家政大学栄養学科，^e国立病院機構九州がんセンター消 化器肝胆膵内科

キーワード：cholecystokinin，糖尿病性腎症，抗炎症作用，腎保護効果

Cholecystokinin plays a novel protective role in diabetic kidney through anti-inflammatory actions on macrophages

Satoshi Miyamotoâ＊, Kenichi Shikataâ,b, Kyoko Miyasaka^c, Shinichi Okadaâ, Motofumi Sasakiâ, Ryo Koderaâ,b, Daisho Hirotaâ, Nobuo Kajitaniâ, Tetsuharu Takatsukaâ, Hitomi Usui Kataokaâ,d, Shingo Nishishitaâ,

Chikage Sato Horiguchiâ, Akihiro Funakoshiê, Hisakazu Nishimori^f, Haruhito Adam Uchidaâ, Daisuke Ogawaâ,g, Hirofumi Makinoâ

Departments of ^aMedicine and Clinical Science, ^dPrimary Care and Medical Education, ^fHematology and Oncology, ^gDiabetic Nephropathy, Okayama University Graduate School of Medicine, Dentistry and Pharmaceutical Sciences, ^bCenter for Innovative Clinical Medicine, Okayama University Hospital, ^cDepartment of Nutrition and Physiology, Tokyo Kasei University, ^eDepartment of Gastroenterology, National Kyushu Cancer Center

岡山医学会雑誌第126巻 April 2014, pp. 1ﾝ6

平成2４年度岡山医学会賞　　　　

総合研究奨励賞（結城賞）

平成26年１月受理

＊Center for Renal Translational Medicine, University of California, San Diego

9500 Gilman Drive, MC 0711, La Jolla, CA 92093-0711 E‑mail：[email protected]

プロフィール

宮本聡

平成13年３月高知医科大学医学部医学科卒業

平成13年６月岡山大学医学部附属病院第三内科医員（研修医）

平成13年10月高知県立中央病院内科平成15年６月倉敷中央病院糖尿病内科

平成18年４月岡山大学大学院医歯薬学総合研究科博士課程入学平成24年６月岡山大学大学院医歯薬学総合研究科博士課程修了平成24年７月カリフォルニア大学サンディエゴ校留学現在に至る

(2)

性腎症における炎症の進展において重要な役割を果たすことから，我々は糖尿病 WT マウスと糖尿病 ICAM

^-/-

マウスとの遺伝子発現の相違に注目して解析を行った．

糖尿病 WT マウスの腎皮質で糖尿病 ICAM

^-/-

マウスに比し発現が２倍以上増加し，かつ非糖尿病 WT マウスと ICAM

^-/-

マウスでは発現増加を認めなかった遺伝子は33遺伝子あり，この中に cholecystokinin （CCK）

が含まれていた（図１Ａ）．腎皮質の real-time PCR でも糖尿病 WT では非糖尿病群に比し cholecystokinin

（CCK）の発現が３倍以上増加しており，糖尿病 ICAM‑１

^-/-

ではその増加が抑制されていた（図１Ｂ）．

（CCK‑2R）には発現変化は認められなかった（図１Ｃ，Ｄ）．

CCK は消化管運動への関与や神経伝達物質としての作用が広く知られており

^4,5)

，抗炎症作用を示唆する報告もなされている

^6,7)

．さらに CCK‑1R， CCK‑2R 両者とも腎組織とマクロファージの両者に発現してお

り

^8ﾝ10)

，腎組織における炎症との関連が示唆される．し

かし，腎臓における CCK の分布や役割についてはほとんど報告がない．酵素抗体法による染色で検討したところ CCK は WT マウスの腎組織に広く分布していたが（図１Ｅ‑Ｇ），糖尿病を誘発すると遠位尿細管と糸球体内により強い染色を認めた（図１Ｈ‑Ｊ）．次に，

DM NDM

1.0 2.0

NS

0

CCK-2R/ｹ-actin

D

₍_ratio₎

CCK-1R/ｹ-actin

0 1.0 2.0

DM NDM

NS

C

₍_ratio₎

CCK/ｹ-actin

DM

B

_WT

ICAM-1^-/-

NDM 0

3.0 6.0 (ratio)

＊＊＊

＊＊＊ ＊

DMNDM

glomerulus renal medulla

renal cortex

CCK

E

H

F G

I J

A

図１ DNA マイクロアレイと腎における CCK の発現・分布

Ａ：腎皮質を用いた DNA マイクロアレイの結果を cluster 分析により図示した．糖尿病 WT マウスの腎皮質で糖尿病 ICAM^-/-マウスに比し発現が２倍以上増加し，かつ非糖尿病 WT マウスと ICAM^-/-マウスでは発現増加を認めなかった遺伝子は cluster４に分類され，

この cluster に CCK が含まれている．Ｂ‑Ｄ：腎皮質における CCK，CCK‑1R，CCK‑2R の mRNA 発現．糖尿病を誘発した WT マウスの腎では CCK の mRNA 発現が増加した（Ｂ）が，糖尿病を誘発しても CCK のレセプターmRNA の発現には変化は認められない

（Ｃ，Ｄ）^＊＊＊＜0.001；^＊＜0.05．Values：the means ± SEM．Ｅ‑Ｊ：非糖尿病マウス（Ｅ‑Ｇ）と糖尿病マウス（Ｈ‑Ｊ）の腎組織における CCK の分布．Scale bars：50 m．（転載許諾を得て文献３より一部改変して引用）

(3)

糖尿病性腎症の発症・進展における CCK の役割を CCK‑1R， CCK‑2R のダブルノックアウト（1R

^-/-

，‑2R

^-/-

）マウスを用いて検討した．

WTマウスと1R^-/-，‑2R^-/-マウスにおける糖尿病誘発後のアルブミン尿の推移と腎の炎症

８週齢の雄性 WT マウスと1R

^-/-

，‑2R

^-/-

マウスを

① WT，② 1R

^-/-

，‑2R

^-/-

，③糖尿病 WT，④糖尿病 1R

^-/-

，

‑2R

^-/-

に分け，糖尿病群には上記と同様 STZ で糖尿病を誘発し，３か月後に腎臓を採取した．また， CCK‑1R ノックアウト（1R

^-/-

）マウスと CCK‑2R ノックアウト

（2R

^-/-

）マウスの糖尿病群も作成し，アルブミン尿を比較した．

糖尿病誘発３か月後の尿中アルブミンは糖尿病 1R

^-/-

，‑2R

^-/-

群では他の糖尿病３群に比し糖尿病誘発後から著明な増加を認めた（図２Ａ）．糖尿病 1R

^-/-

マウスまたは糖尿病 2R

^-/-

マウスにおいても，糖尿病発症早期から著明なアルブミン尿増加を認めたが，その増加は糖尿病 1R

^-/-

，‑2R

^-/-

群で最も顕著であった（図２Ａ）．

糸球体面積，メサンギウム基質面積はいずれも糖尿病 1R

^-/-

，‑2R

^-/-

群では有意に増加した（図２Ｂ‑Ｄ）．腎皮質における CCK の発現は糖尿病 WT 群と糖尿病 1R

^-/-

，

‑2R

^-/-

群で同程度であった（図２Ｅ）．しかし，糖尿病 1R

^-/-

，‑2R

^-/-

群では腎皮質における炎症関連分子の発現と，尿細管障害のマーカーである KIM‑１の発現が糖尿病 WT 群に比し有意に増加していた（図２Ｆ‑Ｉ）．

以上より，２つの CCK receptor をダブルノックアウトすると，糖尿病誘発後の腎組織障害が顕著に悪化し，

腎における炎症も増悪することが明らかになった．

キメラマウスにおける糖尿病誘発後のアルブミン尿の変化

７〜９週齢の雄性 WT マウスと1R

^-/-

マウスに前処置として計 9Gy のＸ線全身照射を行った．照射後の 1R

^-/-

マウスには非照射 WT マウスから採取した骨髄を移植し，照射後の WT マウスには非照射 WT マウスまたは非照射 1R

^-/-

マウスから採取した骨髄を移植した．骨髄移植４週後に STZ で糖尿病を誘発し，以降４週間アルブミン尿の変化を観察した．

1R

^-/-

マウスの骨髄を WT マウスに移植したモデルでは，その逆に移植したモデルに比し，糖尿病誘発後のアルブミン尿が有意に増加した（図２Ｊ）．以上より，早期の糖尿病性腎症モデルにおいては，マクロフ

ァージ上の CCK‑1R が重要な役割を果たしていることが明らかになった．

次に CCK の腎保護効果を検証するため，sulfated CCK octapeptide（CCK‑8S）の投与実験を行った．

糖尿病ラットにおけるCCK‑8Sの腎保護効果

４週齢の雄性 SD ラットを①非糖尿病群，②糖尿病群，③糖尿病 CCK‑8S 投与群（各群７匹）に分け，糖尿病は５週齢の時点で STZ 65㎎/㎏の静脈投与により誘発した．６週齢の時点で CCK‑8S 投与群では浸透圧ポンプを皮下に埋め込み５ug CCK‑8S/㎏・ﾁで持続投与を行い，他群には0.9%生理食塩水の持続投与を行った．糖尿病誘発８週後に腎臓を採取した．

糖尿病誘発８週後の血圧，体重， HbA1c および腎重量は糖尿病群間には有意差は認めなかったが

³⁾

，尿中アルブミンの増加は糖尿病 CCK‑8S 投与群で有意に抑制された（図３Ａ）．さらに，糖尿病誘発後のメサンギウム基質面積の増加は糖尿病 CCK‑8S 投与群で有意に抑制された（図３Ｂ‑Ｄ）．ラット腎皮質において，

糖尿病誘発後の ICAM‑１， CD68， TGF‑β などの炎症関連分子の発現は，糖尿病生食投与群に比し糖尿病 CCK‑8S 投与群で有意に抑制された（図３Ｅ‑Ｈ）．さらに糖尿病誘発後の腎皮質における NF‑ κB の活性化は CCK‑8S 投与群で有意に抑制された（図３Ｉ）．

THP‑１細胞（ヒト単球系細胞）におけるCCK‑8Sの抗炎症・抗遊走効果

THP‑１細胞を5.5ﾋの D-glucose と10%の FCS を含んだ培地で72時間培養後，無血清培地で12時間培養した．上記の前処置後の細胞を，正常血糖（NG；5.5 ﾋ），マンニトール（Mn；15ﾋ）および高血糖群（HG；

15ﾋ）に分け，さらに高血糖群に scramble ペプチド

（10

^-6

M）， CCK‑8S （10

^-8

〜10

^-6

M）または CCK‑8S （10

^-6

M）

と proglumide（10

^-5

M）の両者を加えた各群を作成した．Proglumide は CCK‑1R と CCK‑2R の両者の阻害薬として用いた．72時間培養後に RNA を抽出し， real- time PCR で TNF‑α の発現について検討を行った．

THP‑１細胞の遊走は24‑well transwell を用いて評価した．THP‑１細胞は0.1% BSA を含む培地で24時間前処置後，上部容器に THP‑１細胞とコントロールペプチド（10

^-6

M）， CCK‑8S （10

^-8

〜10

^-6

M）または CCK‑8S

（10

^-6

M）と proglumide（10

^-5

M）の両者を加えた各群を作成し，下部容器には100ﾍ/ の CCL2を加えて２

CCK の腎保護効果：宮本聡，他16名

(4)

時間培養し，遊走細胞を定量した．

CCK‑8S は高血糖刺激による TNF‑αの発現増加

（図３Ｊ）と CCL2 刺激による遊走（図３Ｋ）を濃度依存性に抑制し，これらの効果は proglumide の添加より消失した．

おわりに

今回の報告で， CCK は糖尿病の腎臓で増加し， CCK レセプターを介してマクロファージに関連した炎症を制御していることが明らかになった．これまでにマクロファージ上の CCK‑1R は CCK‑2R に比し，抗炎症

WT 1R^-/-,-2R^-/- WT 1R^-/-,-2R^-/-

(ratio)

CCK/β-actin

DM NDM

E

3.0 5.0

2.0 1.0 0 4.0

WT1R^-/-,-2R^-/-

* ** *

0 4.0 8.0

CCL2/β-actin

(ratio)

F

DM NDM

* *******

ICAM-1/β-actin

(ratio)

G

0 1.0 2.0 3.0

DM NDM

*********

CD68/β-actin

(ratio)

H

0 4.0

2.0

DM NDM

* * *

0 20

10

KIM-1/β-actin

5 15

DM NDM

**** *

I

_(ratio)

C

3.0 6.0

Glomerular size (x103μm2)

0 NDM DM

WT 1R^-/-,-2R^-/-

*****

months

urinary albumin/creatinin ratio

*

†

***

*

WT 1R^-/-,-2R^-/-

WT

DM

NDM 1R^-/-,-2R^-/- 2R^-/- 1R^-/-

0 100 200 300 400 500

0 1 2 3

(μg/gCr)

D

0 200 300

NDM DM

* *

100

*********

Mesangial matrix index

(%control)

weeks

urinary albumin/creatinin ratio

*

WT→WT 1R^-/-→WT

WT→1R^-/- DM

0 100 200 300 400 500

2 4

0 (μg/gCr)

J

図２ 1R^-/-，‑2R^-/-マウスと野生型マウスにおける糖尿病誘発後の変化

Ａ：尿中アルブミン・クレアチニン比（UACR）の推移．1R^-/-，‑2R^-/-マウスでは WT マウスに比し糖尿病誘発後早期から UACR の増加を認めた．^＊＊＊＜0.001，^＊＜0.05vs.糖尿病 WT および非糖尿病群．^† ＜0.05vs.非糖尿病群．Ｂ‑Ｄ：腎組織の PAM 染色

（Ｂ），糸球体面積（Ｃ）およびメサンギウム基質面積率（Ｄ）．Scale bar：50 m. ^＊＊＊＜0.001；^＊＜0.05．Ｅ‑Ｈ：腎皮質における CCK（Ｅ），CCL2（Ｆ），ICAM‑1（Ｇ），CD68（Ｈ）および KIM‑1（Ｉ）の mRNA 発現．^＊＊＊＜0.001；^＊＜0.05．Ｊ：骨髄移植マウスの糖尿病誘発後の UACR の変化．1R^-/-マウスの骨髄を WT マウスに移植したモデル（1R^-/-→WT）では，その逆に移植したモデル（WT→1R^-/-）に比し，糖尿病誘発後のアルブミン尿が有意（＜0.05）に増加した．Values：the means ± SEM. （転載許諾を得て文献３より一部改変して引用）

(5)

CCK の腎保護効果：宮本聡，他16名

A

urinary albumin excretion (μg/day)

0 500 1,000 1,500

0 2 4 8 (week)

DM

DM-CCK NDM

*

**

* ††

TGF-β/β-actin

(ratio)

NDM DM DM-CCK 0

1.0 2.0 3.0

**

* ***

G

CD68/β-actin

(ratio)

E

0 1.0 2.0 3.0

* *

NDM DM DM-CCK

KIM-1/β-actin

NDM DM DM-CCK 0

2.0 6.0 8.0 (ratio)

4.0

* * ***

H

ICAM-1/β-actin

(ratio)

*

0 1.0 2.0 3.0

F

** *

*

NDM DM DM-CCK NF-κBactivity (ng/mg protein) 0 400

800 * *

I

NDM DM DM-CCK Mesangial matrix index (% control)

D

300 200

100

0

***

NDM DM DM-CCK

C

******

NDM DM DM-CCK 15.0

10.0

5.0

32Glomerular size (x10μm) 0

Mn (15mM) CCK-8S (-log M) scramble (-log M)HG (15mM) Proglumide (10μM)

0 0.5 1.0 1.5 (ratio)

TNF-α/β-actin

†

****** ***

- + - - - -

7 - 8 -

- -

- 6 - -

- - + + + +

-

6 - +

-

6 - +

- - - - - - - +

J

0 2.0 4.0

CCL2 (100ng/ml) CCK-8 (-log M) scramble (-log M)

upper chamber lower chamber

- + + + + + +

6 6 - 7

- -

- 6

8

- - -

- - - - - +

- - Proglumide (10μM) -

* *

†

1.0 3.0 (ratio)

K

B

NDM DM DM-CCK

図３ CCK‑8S の腎保護効果と THP‑１細胞における抗炎症効果

Ａ：非糖尿病ラット（NDM），糖尿病ラット（DM）および CCK 持続投与糖尿病ラット（DM-CCK）における尿中アルブミン排泄量の推移．CCK‑8S 投与により尿中アルブミン排泄量が有意に抑制された．^＊＊＊＜0.001，^＊＜0.05vs. NDM．^†† ＜0.01vs. DM-CCK．

Ｂ‑Ｄ：腎組織の PAM 染色（Ｂ），糸球体面積（Ｃ）およびメサンギウム基質面積率（Ｄ）．Scale bar：50 m. CCK‑8S 投与によりメサンギウム基質の増加が抑制された．^＊＊＊＜0.001．Ｅ‑Ｈ：腎皮質における CD68（Ｅ），ICAM‑１（Ｆ），TGF‑β（Ｇ）および KIM‑

１（Ｈ）の mRNA 発現は CCK‑8S 投与により有意に抑制された．^＊＊＊＜0.001；^＊＜0.05．Ｉ：NF‑κB（p65）の DNA 結合活性は CCK 投与により有意に抑制された．^＊＜0.05．Ｊ：CCK‑8S は高血糖刺激による TNF‑αの mRNA 発現を有意に抑制し（CCK‑8S 10^-6M で投与時），その効果は proglumide 投与により消失した．^＊＊＊＜0.001vs. NG および Mn．^† ＜0.05vs. HG, HG＋scramble および HG＋CCK‑8S＋proglumide．Ｋ：CCK‑8S は CCL2刺激による遊走を濃度依存性に抑制し，この抗遊走効果は proglumide の添加より消失した．^＊＜0.05vs. CCL2，CCL2＋scramble，CCL2＋CCK‑8S＋proglumide．^† ＜0.05vs. CCL2．Values：the means

± SEM. （転載許諾を得て文献３より一部改変して引用）

(6)

る．我々は 1R マウスを用いた骨髄移植実験を行い，

腎組織における CCK‑1R よりもマクロファージ上の CCK‑1R が糖尿病誘発後の腎症の発症・進展に重要な役割を果たしていることを明らかにした．糖尿病性腎症の腎組織では NF‑ κB が活性化され，ICAM‑１の発現調整に関与していることが報告されている

¹¹⁾

．我々は糖尿病ラットの腎皮質において CCK‑8S 投与により ICAM‑１の発現と NF‑ κB の活性が有意に抑制されることを示した．CCK‑8S は糖尿病の腎において NF‑ κB の活性を抑制することで，ICAM‑１の発現を抑制し，結果としてマクロファージの腎への浸潤を抑制していることが示唆される．さらに，我々の検討により高血糖下での TNF‑αの発現抑制効果と CCL2 刺激による遊走抑制効果が THP‑１細胞における CCK‑8S の抗炎症作用の機序であることも明らかとなった．糸球体上皮細胞のマーカーである nephrin の発現は TNF‑αにより抑制されることが報告されており

¹²⁾

，CCK‑8S 投与により糸球体内の TNF‑αの発現が抑制されたことで，糸球体上皮細胞の減少が抑制され，アルブミン尿の抑制に寄与した可能性も示唆される．CCK‑8S の血中半減期は短く，臨床応用上の問題であるが，近年，血中半減期の長い PEGylated-CCK-10 などが精製されており

¹³⁾

，今後の臨床応用が期待される．

CCK は糖尿病の腎臓において，マクロファージに対する抗炎症効果を介して腎保護的に作用しており，糖尿病性腎症や他の炎症性疾患の治療においても新規の治療標的となりうることが示唆された．

文献

１) Sugimoto H, Shikata K, Hirata K, Akiyama K, Matsuda M, Kushiro M, Shikata Y, Miyatake N, Miyasaka M, Makino H：Increased expression of intercellular adhesion molecule-1 (ICAM‑1) in diabetic rat glomeruli：

glomerular hyperfiltration is a potential mechanism of ICAM‑1 upregulation. Diabetes (1997) 46，2075‑2081．

２) Okada S, Shikata K, Matsuda M, Ogawa D, Usui H, Kido Y, Nagase R, Wada J, Shikata Y, Makino H：

Intercellular adhesion molecule-1-deficient mice are resistant against renal injury after induction of diabetes.

Diabetes (2003) 52，2586‑2593．

Kodera R, Hirota D, Kajitani N, Takatsuka T, Kataoka HU, Nishishita S, Sato C, et al.：Cholecystokinin plays a novel protective role in diabetic kidney through anti- inflammatory actions on macrophage：anti-inflammatory effect of cholecystokinin. Diabetes (2012) 61，897‑907．

４) Rehfeld JF：Clinical endocrinology and metabolism.

Cholecystokinin. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab (2004) 18，569‑586．

５) Crawley JN, Corwin RL：Biological actions of cholecystokinin. Peptides (1994) 15，731‑755．

６) Meng AH, Ling YL, Zhang XP, Zhang JL：Anti- inflammatory effect of cholecystokinin and its signal transduction mechanism in endotoxic shock rat. World J Gastroenterol (2002) 8，712‑717．

７) Li S, Ni Z, Cong B, Gao W, Xu S, Wang C, Yao Y, Ma C, Ling Y：CCK‑8 inhibits LPS-induced IL-1beta production in pulmonary interstitial macrophages by modulating PKA, p38, and NF-kappaB pathway. Shock (2007) 27，678‑686．

８) Lacourse KA, Lay JM, Swanberg LJ, Jenkins C, Samuelson LC：Molecular structure of the mouse CCK-A receptor gene. Biochem Biophys Res Commun (1997) 236，630‑635．

９) de Weerth A, Jonas L, Schade R, Schoneberg T, Wolf G, Pace A, Kirchhoff F, Schulz M, Heinig T, Greten H, von Schrenck T：Gastrin/cholecystokinin type B receptors in the kidney：molecular, pharmacological, functional characterization, and localization. Eur J Clin Invest (1998) 28，592‑601．

10) Xu SJ, Gao WJ, Cong B, Yao YX, Gu ZY：Effect of lipopolysaccharide on expression and characterization of cholecystokinin receptors in rat pulmonary interstitial macrophages. Acta Pharmacol Sin (2004) 25，1347‑1353．

11) Sanchez AP, Sharma K：Transcription factors in the pathogenesis of diabetic nephropathy. Expert Rev Mol Med (2009) 11，e13．

12) Takano Y, Yamauchi K, Hayakawa K, Hiramatsu N, Kasai A, Okamura M, Yokouchi M, Shitamura A, Yao J, Kitamura M：Transcriptional suppression of nephrin in podocytes by macrophages：roles of inflammatory cytokines and involvement of the PI3K/Akt pathway.

FEBS Lett (2007) 581，421‑426．

13) Leon-Tamariz F, Verbaeys I, Van Boven M, De Cuyper M, Buyse J, de Witte P, Verbruggen A, Cokelaere M：

Biodistribution and pharmacokinetics of PEG-10kDa- cholecystokinin-10 in rats after different routes of administration. Curr Drug Deliv (2010) 7，137‑143．

，糖尿病性腎症の成因に炎

糖尿病を誘発したラットの腎臓では intercellular adhesion molecule（ICAM)‑１の発現が増加し，糸球 体内へのマクロファージの浸潤が増加する

．逆に，

ICAM‑１を欠損した（ICAM‑１

）マウスでは，糖尿 病誘発後の腎臓へのマクロファージの浸潤や腎機能障 害が抑制されることから

，糖尿病性腎症の成因に炎

症が関与していることが示唆される．我々はまず，糖 尿病性腎症の腎組織において炎症を制御し，新規治療 ターゲットとなり得る分子を同定するため，DNA マ イクロアレイでスクリーニングを行った

．

８週齢の雄性野生型マウス（C57BL/6J；WT）と ICAM‑１

マウスを① WT，② ICAM‑１

，③糖尿病 WT および④糖尿病 ICAM‑１

に分け， 糖尿病 （DM）

群は８および９週齢時に streptozotocin（STZ）100㎎/

㎏の腹腔内投与を行い， 非糖尿病 （NDM） 群はクエン 酸緩衝液の腹腔内投与を行った．糖尿病誘発３か月後 に腎臓を採取し，腎皮質の遺伝子発現プロファイルを

糖尿病の腎臓において cholecystokinin はマクロファージ に対する抗炎症作用を介した新規の保護効果を発揮する

宮 本 聡

，四 方 賢 一

，宮 坂 京 子

，岡 田 震 一

，佐々木基史

，小 寺 亮

， 廣 田 大 昌

，梶 谷 展 生

，高 塚 哲 全

，片 岡 仁 美

，西 下 伸 吾

，堀 口 千 景

， 船 越 顕 博

，西 森 久 和

，内 田 治 仁

，小 川 大 輔

，槇 野 博 史

Cholecystokinin plays a novel protective role in diabetic kidney through anti-inflammatory actions on macrophages

平成2４年度岡山医学会賞

総合研究奨励賞（結城賞）

性腎症における炎症の進展において重要な役割を果た す こ と か ら，我 々 は 糖 尿 病 WT マ ウ ス と 糖 尿 病 ICAM

マウスとの遺伝子発現の相違に注目して解析 を行った．

糖尿病 WT マウスの腎皮質で糖尿病 ICAM

マウ スに比し発現が２倍以上増加し， かつ非糖尿病 WT マ ウスと ICAM

マウスでは発現増加を認めなかった遺 伝子は33遺伝子あり， この中に cholecystokinin （CCK）

が含まれていた （図１Ａ）． 腎皮質の real-time PCR で も糖尿病 WT では非糖尿病群に比し cholecystokinin

（CCK）の発現が ３ 倍以上増加しており，糖尿病 ICAM‑１

ではその増加が抑制されていた（図１Ｂ）．

（CCK‑2R）には発現変化は認められなかった（図１ Ｃ，Ｄ）．

CCK は消化管運動への関与や神経伝達物質として の作用が広く知られており

， 抗炎症作用を示唆する 報告もなされている

． さらに CCK‑1R， CCK‑2R 両 者とも腎組織とマクロファージの両者に発現してお

り

， 腎組織における炎症との関連が示唆される． し

D

C

B

E

H

F G

I J

A

糖尿病性腎症の発症・進展における CCK の役割を CCK‑1R， CCK‑2R のダブルノックアウト （1R

，‑2R

） マウスを用いて検討した．

８ 週齢の雄性 WT マウスと1R

，‑2R

マウスを

① WT，② 1R

，‑2R

，③糖尿病 WT，④糖尿病 1R

，

‑2R

に分け，糖尿病群には上記と同様 STZ で糖尿病 を誘発し，３か月後に腎臓を採取した． また， CCK‑1R ノックアウト（1R

）マウスと CCK‑2R ノックアウト

（2R

）マウスの糖尿病群も作成し，アルブミン尿を 比較した．

糖尿病誘発 ３か月後の尿中アルブミンは糖尿病 1R

，‑2R

群では他の糖尿病３群に比し糖尿病誘発後 から著明な増加を認めた（図２Ａ）．糖尿病 1R

マウ スまたは糖尿病 2R

マウスにおいても， 糖尿病発症早 期から著明なアルブミン尿増加を認めたが，その増加 は糖尿病 1R

，‑2R

群で最も顕著であった （図２Ａ）．

糸球体面積，メサンギウム基質面積はいずれも糖尿病 1R

糖尿病を誘発したラットの腎臓では intercellular adhesion molecule（ICAM)‑１の発現が増加し，糸球体内へのマクロファージの浸潤が増加する

）マウスでは，糖尿病誘発後の腎臓へのマクロファージの浸潤や腎機能障害が抑制されることから

症が関与していることが示唆される．我々はまず，糖尿病性腎症の腎組織において炎症を制御し，新規治療ターゲットとなり得る分子を同定するため，DNA マイクロアレイでスクリーニングを行った

に分け，糖尿病（DM）

㎏の腹腔内投与を行い，非糖尿病（NDM）群はクエン酸緩衝液の腹腔内投与を行った．糖尿病誘発３か月後に腎臓を採取し，腎皮質の遺伝子発現プロファイルを

糖尿病の腎臓において cholecystokinin はマクロファージに対する抗炎症作用を介した新規の保護効果を発揮する

宮本聡

，四方賢一

，宮坂京子

，岡田震一

，小寺亮

，廣田大昌

，梶谷展生

，高塚哲全

，片岡仁美

，西下伸吾

，堀口千景

，船越顕博

，西森久和

，内田治仁

，小川大輔

，槇野博史

平成2４年度岡山医学会賞　　　　

性腎症における炎症の進展において重要な役割を果たすことから，我々は糖尿病 WT マウスと糖尿病 ICAM

マウスとの遺伝子発現の相違に注目して解析を行った．

マウスに比し発現が２倍以上増加し，かつ非糖尿病 WT マウスと ICAM

マウスでは発現増加を認めなかった遺伝子は33遺伝子あり，この中に cholecystokinin （CCK）

が含まれていた（図１Ａ）．腎皮質の real-time PCR でも糖尿病 WT では非糖尿病群に比し cholecystokinin

（CCK）の発現が３倍以上増加しており，糖尿病 ICAM‑１

（CCK‑2R）には発現変化は認められなかった（図１Ｃ，Ｄ）．

CCK は消化管運動への関与や神経伝達物質としての作用が広く知られており

，抗炎症作用を示唆する報告もなされている

．さらに CCK‑1R， CCK‑2R 両者とも腎組織とマクロファージの両者に発現してお

，腎組織における炎症との関連が示唆される．し

糖尿病性腎症の発症・進展における CCK の役割を CCK‑1R， CCK‑2R のダブルノックアウト（1R

）マウスを用いて検討した．

８週齢の雄性 WT マウスと1R

に分け，糖尿病群には上記と同様 STZ で糖尿病を誘発し，３か月後に腎臓を採取した．また， CCK‑1R ノックアウト（1R

）マウスの糖尿病群も作成し，アルブミン尿を比較した．

糖尿病誘発３か月後の尿中アルブミンは糖尿病 1R

群では他の糖尿病３群に比し糖尿病誘発後から著明な増加を認めた（図２Ａ）．糖尿病 1R

マウスまたは糖尿病 2R

マウスにおいても，糖尿病発症早期から著明なアルブミン尿増加を認めたが，その増加は糖尿病 1R

群で最も顕著であった（図２Ａ）．

群では有意に増加した（図２Ｂ‑Ｄ）．腎皮質における CCK の発現は糖尿病 WT 群と糖尿病 1R

群では腎皮質における炎症関連分子の発現と，尿細管障害のマーカーである KIM‑１の発現が糖尿病 WT 群に比し有意に増加していた（図２Ｆ‑Ｉ）．

以上より，２つの CCK receptor をダブルノックアウトすると，糖尿病誘発後の腎組織障害が顕著に悪化し，

マウスに前処置として計 9Gy のＸ線全身照射を行った．照射後の 1R

マウスには非照射 WT マウスから採取した骨髄を移植し，照射後の WT マウスには非照射 WT マウスまたは非照射 1R

マウスから採取した骨髄を移植した．骨髄移植４週後に STZ で糖尿病を誘発し，以降４週間アルブミン尿の変化を観察した．

マウスの骨髄を WT マウスに移植したモデルでは，その逆に移植したモデルに比し，糖尿病誘発後のアルブミン尿が有意に増加した（図２Ｊ）．以上より，早期の糖尿病性腎症モデルにおいては，マクロフ

ァージ上の CCK‑1R が重要な役割を果たしていることが明らかになった．

糖尿病誘発８週後の血圧，体重， HbA1c および腎重量は糖尿病群間には有意差は認めなかったが

THP‑１細胞を5.5ﾋの D-glucose と10%の FCS を含んだ培地で72時間培養後，無血清培地で12時間培養した．上記の前処置後の細胞を，正常血糖（NG；5.5 ﾋ），マンニトール（Mn；15ﾋ）および高血糖群（HG；

M）または CCK‑8S （10

M）の両者を加えた各群を作成した．Proglumide は CCK‑1R と CCK‑2R の両者の阻害薬として用いた．72時間培養後に RNA を抽出し， real- time PCR で TNF‑α の発現について検討を行った．

THP‑１細胞の遊走は24‑well transwell を用いて評価した．THP‑１細胞は0.1% BSA を含む培地で24時間前処置後，上部容器に THP‑１細胞とコントロールペプチド（10

M）または CCK‑8S

M）の両者を加えた各群を作成し，下部容器には100ﾍ/ の CCL2を加えて２

（図３Ｊ）と CCL2 刺激による遊走（図３Ｋ）を濃度依存性に抑制し，これらの効果は proglumide の添加より消失した．

今回の報告で， CCK は糖尿病の腎臓で増加し， CCK レセプターを介してマクロファージに関連した炎症を制御していることが明らかになった．これまでにマクロファージ上の CCK‑1R は CCK‑2R に比し，抗炎症

る．我々は 1R マウスを用いた骨髄移植実験を行い，

，今後の臨床応用が期待される．

CCK は糖尿病の腎臓において，マクロファージに対する抗炎症効果を介して腎保護的に作用しており，糖尿病性腎症や他の炎症性疾患の治療においても新規の治療標的となりうることが示唆された．