都 市 環 境 に お け る
Bacillus thuringiensis 検 索 の 実 践 と 効 率 性 の 検 証
日 本 大 学 大 学 院 生 物 資 源 科 学 研 究 科 生 物 資 源 生 産 科 学 専 攻 博 士 後 期 課 程
山 本 裕 一
2015
目 次
第 1 章 緒 言 ... 1
第 2 章 都 市 環 境 に お け る Bacillus thuringiensis の 分 離 実 験 ... 7
1 序 論 ... 7
2 材 料 お よ び 方 法 ... 9
2-1 Bacillus 属 菌 の 分 離 ... 9
2-2 分 離 し た Bacillus 属 コ ロ ニ ー の 単 離 ... 9
2-3 B. thuringiensis の 判 定 ... 10
3 結 果 ... 15
4 考 察 ... 23
第 3 章 SSU rRNA 遺 伝 子 配 列 解 析 に よ る 分 離 株 間 差 異 の 検 出 ... 26
1 序 論 ... 26
2 材 料 お よ び 方 法 ... 28
3 結 果 ... 32
4 考 察 ... 41
第 4 章 ゲ ノ ム プ ロ フ ァ イ リ ン グ(GP)法 に よ る 分 離 株 間 差 異 の 検 出 ... 43
1 序 論 ... 43
2 材 料 お よ び 方 法 ... 45
2-1 ラ ン ダ ム PCR ... 45
2-2 温 度 勾 配 ゲ ル 電 気 泳 動(TGGE) ... 45
2-3 プ ロ フ ァ イ ル 比 較 ... 46
3 結 果 ... 48
4 考 察 ... 119
第 5 章 総 合 討 論 ... 123
1 新 規 B. thuringiensis の 有 用 性 ... 123
2 B. thuringiensis は 見 つ け に く い 細 菌 な の か ... 123
3 都 市 環 境 に お け る 分 離 手 法 の 評 価 ... 124
4 都 市 環 境 に お け る 分 離 手 法 の 将 来 性 ... 125
5 分 離 株 の 解 析 方 法 の 選 定 ... 126
6 こ れ か ら の B. thuringiensis 分 離 研 究 ... 128
第 6 章 摘 要 ... 130
第 7 章 謝 辞 ... 131
第 8 章 文 献 ... 132
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第 1 章 緒言
人 類 の 誕 生 以 来 、 人 々 は 安 定 し た 食 糧 を 得 る た め に 、 自 ら が 食 用 と す る 植 物 を 管 理 し 始 め た 。 多 く の 食 糧 を 得 る た め 、 食 用 の 植 物 を 栽 培 し 、 栽 培 時 期 の 選 考 や 害 虫 ・ 害 獣 の 防 除 な ど 、 よ り 多 く の 食 糧 を 収 穫 で き る よ う な 工 夫 が さ れ て き た 。 日 本 は 古 く か ら 農 耕 を 行 っ て お り 、 農 業 に お い て 様 々 な 努 力 が 行 わ れ て き た 。 そ の 中 で も 、 人 糞 を 肥 料 と し て 施 肥 す る と い う 農 法 は 日 本 や ア ジ ア 諸 国 独 自 の 特 徴 と さ れ て い る(久 馬, 2013)。ま た 、害 虫 対 策 も 日 本 独 自 の 方 法 で 行 わ れ て い た 。 日 本 が 水 田 で の 稲 作 栽 培 を 行 っ た 当 初 は 、 害 虫 よ り も ネ ズ ミ な ど の 害 獣 が 問 題 視 さ れ て お り 、高 床 式 倉 庫 な ど が 考 案 さ れ た と 言 わ れ て い る(岩 田, 1966)。そ の 後 、 数 々 の 農 業 従 事 者 が 害 虫 に よ る 被 害 を 認 識 し は じ め る と 、 平 安 時 代 で は ウ ン カ や ヨ ト ウ ム シ を 捕 食 す る ト ン ボ や ハ チ な ど を 益 虫 と し て 認 識 す る よ う に な っ た 。 さ ら に 、1600 年 頃 に は 家 伝 殺 虫 散 と い う 日 本 最 古 の 農 薬 が 現 れ た と さ れ て い る(岡 本, 1993)。家 伝 殺 虫 散 は 、一 定 の 効 果 を 示 し た と 記 載 が あ る も の の 、現 在 の 研 究 で は そ こ ま で 高 い 効 力 は な か っ た と 判 明 し て い る 。 そ の 後 、 江 戸 時 代 の 1732 年 に は ウ ン カ や イ ナ ゴ の 大 量 発 生 に よ る 凶 作 、 い わ ゆ る 享 保 の 大 飢 饉 が 起 こ り 、 大 量 の 餓 死 者 を 出 し た 。 そ れ 以 前 に は 、 鯨 油 を 水 田 に 流 す な ど の 措 置 が ウ ン カ の 防 除 と し て 実 施 さ れ て い た 。 こ れ は 、 水 田 の 水 面 に 鯨 油 に よ る 油 膜 を 張 る こ と で 、 水 面 に 落 ち た ウ ン カ を 油 で 窒 息 死 さ せ る も の で あ る 。 こ の 鯨 油 に よ る ウ ン カ の 防 除 は 有 効 な 手 段 で あ っ た が 、 局 所 的 に し か 伝 わ っ て い な か っ た た め 、 多 く の 藩 で は こ の 後 も 飢 饉 が 続 く こ と に な る 。 近 代 に な り 、 明 治 時 代 に は 苗 木 の 燻 蒸 や ボ ル ド ー 液 の 使 用 が 実 施 さ れ は じ め 、 大 正 時 代 に 正 式 な 実 用 段 階 に 至 っ た と さ れ て い る(農 林 省 振 興 局 植 物 防 疫 課, 1960)。こ の よ う に 、我 が 国 の 農 業 は 常 に 害 虫 の 脅 威 に さ ら さ れ て き て お り 、 害 虫 対 策 は 非 常 に 重 要 な も の で あ る こ と が わ か る 。
一 方 、 外 国 に お い て は 化 学 合 成 殺 虫 剤 が 多 く 作 ら れ 、 流 通 し て い た 。 そ の 中 で
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も 、 ア メ リ カ の モ ン サ ン ト 社 が 開 発 し た dichloro-diphenyl-trichloroethane (DDT)は 衛 生 害 虫 だ け で な く 、 農 業 害 虫 に 対 し て も 非 常 に 強 力 な 殺 虫 効 果 を 示 す こ と が わ か っ た こ と か ら 、 多 く の 諸 外 国 で 利 用 さ れ る よ う に な っ た 経 緯 が あ る 。 し か し 、 レ イ チ ェ ル ・ カ ー ソ ン 女 史 が 1962 年 に 公 表 し た 「Silent spring」 は 、 DDTが 対 象 と な る 害 虫 以 外 の 昆 虫 に も 強 い 殺 虫 性 を 発 揮 し て し ま い 、自 然 環 境 へ 大 き な 負 荷 を 与 え て し ま う こ と に 警 鐘 を 鳴 ら し た(Carson, 1962)。 ま た 、 化 学 農 薬 の 使 用 過 多 に よ っ て 、 害 虫 と と も に 天 敵 昆 虫 が 減 少 し て し ま う と 、 次 の 発 生 時 期 以 降 に 害 虫 の 数 が 増 加 す る リ サ ー ジ ェ ン ス が 頻 発 す る こ と も 知 ら れ て い る 。 そ の ほ か 、 化 学 農 薬 に 対 す る 耐 性 害 虫 を 出 現 さ せ て し ま う 場 合 が あ り 、 結 果 的 に 被 害 を 拡 大 さ せ て し ま う こ と が あ る 。 加 え て 、 昨 今 世 界 で は 地 球 環 境 の 保 全 や 保 護 へ の 意 識 が 高 ま っ て い る こ と も あ り 、 こ れ か ら の 農 業 に お い て も 、 自 然 環 境 へ 負 荷 の 小 さ い 殺 虫 剤 を 使 用 す る こ と が 望 ま れ て い る 。 現 在 で は 、 無 農 薬 農 法 や 減 農 薬 農 法 な ど が 普 及 し て お り 、 こ の よ う な 農 法 で 生 産 し た 作 物 に は 付 加 価 値 が 付 与 さ れ る こ と が 多 い 。 し か し 、 減 農 薬 や 無 農 薬 の 農 法 は 非 常 に 難 し く 、 農 業 従 事 者 が 持 つ 正 し い 知 識 や 経 験 な ど に よ っ て 成 功 率 が 依 存 す る 。 そ こ で 、 現 在 で は 様 々 な 農 薬 メ ー カ ー か ら 、 化 学 農 薬 と は 異 な る 農 薬 や 防 除 資 材 が 開 発 さ れ て い る 。 こ の よ う な 防 除 資 材 の ひ と つ に 生 物 的 防 除 資 材 が あ る (仲 井 ら, 2009 )。
生 物 的 防 除 資 材 は 、 従 来 の よ う な 化 学 合 成 物 質 を 使 っ た 資 材 で は な く 、 自 然 環 境 に 存 在 す る 天 敵 昆 虫 や 天 敵 微 生 物 を 利 用 し た 資 材 で あ り 、 生 物 農 薬 と も 呼 ば れ る 。 材 料 と な る 生 物 は 、 も と も と 環 境 中 に 存 在 す る た め 自 然 環 境 へ の 負 荷 は 少 な く 、 農 地 の 周 辺 環 境 に も 影 響 が 非 常 に 少 な い 。 近 年 、 害 虫 管 理 へ の 対 策 は 、 予 防 と い う 行 為 と 共 に 防 除 と い う 二 つ の 管 理 シ ス テ ム が 重 要 で あ る と さ れ 、 こ の 考 え 方 は Integrated Pest Management(IPM:総 合 的 害 虫 管 理)と い う 概 念 と し て 現 在 ま で に 知 ら れ て い る 。IPM は 、 こ れ か ら の 農 業 に お い て 基 準 と な る 概 念 で あ り 、
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地 球 環 境 保 全 の た め に も 重 要 な 考 え 方 で あ る 。IPMで は 、害 虫 の 発 生 予 察 や 経 済 的 に 許 容 さ れ る 被 害 の 程 度 、 さ ら に 防 除 の 是 非 の 検 討 や 害 虫 の 発 生 予 防 を 考 慮 す る こ と が 前 提 と な っ て お り 、 や み く も に 薬 剤 を 散 布 す る こ と を 推 奨 し て い な い 。 IPM に お け る 害 虫 の 発 生 予 防 と 防 除 と い う 概 念 に 基 づ い て 作 成 さ れ た 生 物 農 薬 に は 、 天 敵 昆 虫 を 用 い た も の や 天 敵 微 生 物 を 用 い た も の が あ る 。 前 者 は 、 ア ブ ラ ム シ を 捕 食 す る テ ン ト ウ ム シ や オ ン シ ツ コ ナ ジ ラ ミ に 寄 生 す る オ ン シ ツ ツ ヤ コ バ チ な ど の 捕 食 性 昆 虫 や 捕 食 寄 生 性 昆 虫 が 主 流 で あ る(世 古 ・ 三 浦, 2013； 矢 野, 1988)。一 方 、後 者 は 昆 虫 に 感 染 し 、流 行 病 を 引 き 起 こ す 昆 虫 病 原 微 生 物 で あ る 。 昆 虫 病 原 微 生 物 に は 、 糸 状 菌 、 細 菌 、 原 虫 、 ウ イ ル ス な ど が 存 在 し 、 特 定 の 昆 虫 に 対 し て 様 々 な 病 気 を 引 き 起 こ す 。 捕 食 性 昆 虫 や 捕 食 寄 生 性 昆 虫 お よ び 昆 虫 病 原 微 生 物 は ど れ も 作 用 す る 昆 虫 の 範 囲 が 狭 く 、 農 業 に お け る 害 虫 に 対 し て 選 択 的 に 使 用 す る こ と が 可 能 で あ る 。ま た 、IPMで は こ れ ら の 製 剤 を 既 存 の 選 択 性 の 高 い 化 学 農 薬 と と も に 複 合 的 に 用 い る こ と を 推 奨 し て い る 。 天 敵 微 生 物 を 用 い た 製 剤 の 中 で も 、Bacillus thuringiensis を 用 い た 細 菌 製 剤 は 、現 在 の 生 物 的 防 除 資 材 全 体 の 出 荷 量 に お い て ト ッ プ の シ ェ ア を 持 っ て い る(日 本 植 物 防 疫 協 会, 2012)。
B. thuringiensis は グ ラ ム 陽 性 の 芽 胞 形 成 細 菌 で あ る 。 本 菌 は べ ん 毛 抗 原 に お け る H 血 清 型 分 類 に よ っ て 、 現 在 ま で に 70種 類 を 超 え る 分 離 株 が 報 告 さ れ て お り(Roh et al., 2009)、 さ ら に そ れ ぞ れ の 血 清 型 か ら 細 分 化 さ れ た 亜 血 清 型 に 分 類 さ れ て い る 。B. thuringiensis は 、 芽 胞 形 成 時 に 殺 虫 性 結 晶 タ ン パ ク 質 で あ る 副 芽 胞 封 入 体(Insecticidal Crystal Protein: ICP)ま た は ク リ ス タ ル(以 下 crystal)と 呼 ば れ る タ ン パ ク 質 様 物 質 を 産 生 す る と い う 特 徴 を 持 つ 。 こ の crystal は 、 昆 虫 の 幼 虫 体 内 な ど の ア ル カ リ 消 化 液 に よ っ て 前 駆 体 と な り 、プ ロ テ ナ ー ゼ K等 で 部 分 分 解 さ れ る こ と で 活 性 型 の Cryタ ン パ ク 質 と な る 。こ の Cry タ ン パ ク 質 は 、幼 虫 の 中 腸 細 胞 に 存 在 す る 受 容 体 と 結 合 す る こ と で 、 細 胞 を 破 壊 す る 。 さ ら に 、B.
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thuringiensis は 破 壊 さ れ た 中 腸 細 胞 を 通 っ て 中 腸 内 に 取 り 込 ま れ た 雑 菌 と と も に 幼 虫 の 体 腔 側 に 侵 入 し 、 敗 血 症 を 引 き 起 こ す 。 こ の 2つ の 症 状 に よ り 、罹 病 昆 虫 は 致 死 す る(姫 野, 1999；Schnepf et al., 1998)。Cry タ ン パ ク 質 の 産 生 能 は 、B.
thuringiensisの 持 つ 環 状 DNA 上 に 存 在 す る Cry遺 伝 子 に コ ー ド さ れ て お り 、こ の 遺 伝 子 を 導 入 し た 遺 伝 子 組 み 換 え 作 物 も 存 在 す る(Kumar et al., 2008)。さ ら に B. thuringiensisと 同 属 の 細 菌 で あ る Bacillus cereusは crystalを 産 生 し な い た め 、 こ の crystal の 有 無 に よ っ て B. thuringiensis と B. cereus を 判 別 す る こ と が 可 能 で あ る 。 現 在 ま で に B. thuringiensis が 何 の た め に こ の crystal を 産 生 し て い る の か は 解 明 さ れ て い な い た め 、よ り 詳 細 な 特 性 解 析 が 望 ま れ る 。crystal は 、 B. thuringiensis の 株 ご と に 異 な る 特 性 を 持 ち 、 同 一 の 血 清 型 株 で あ っ て も 特 性 が 大 き く 異 な る 分 離 株 が 存 在 す る な ど 、 菌 株 ご と の 性 質 は 非 常 に 多 様 で あ る 。 例 と し て 、subsp. morrisoniと subsp. tenebrionis と い う 株 が あ る が 、 こ の 2株 は 同 じ 血 清 型 に 分 類 さ れ て い る に も 関 わ ら ず 、 毒 性 の 対 象 昆 虫 が 全 く 異 な る た め 、 株 名 が 異 な っ て い る(Ibarra and Federici, 1986)。 野 外 環 境 に 存 在 す る B.
thuringiensis は 、 ほ と ん ど の 株 が 非 殺 虫 性 あ る い は 弱 い 殺 虫 性 し か 持 た な い が 、 一 部 の 株 に お い て は 強 力 な 殺 虫 活 性 を 保 有 し て い る こ と が 判 明 し て い る 。 代 表 的 な 株 が B. thuringiensis serovar kurstaki と serovar aizawaiで あ る が 、 こ の 2 種 類 は 生 物 農 薬 の 一 つ で あ る BT 剤 と し て 利 用 さ れ る ほ ど 強 い 殺 虫 活 性 を 示 し て い る 。 さ ら に 、B. thuringiensis の 殺 虫 活 性 は 微 胞 子 虫 や 菌 類 な ど の 他 の 昆 虫 病 原 微 生 物 の 殺 虫 活 性 よ り も 強 力 で あ る た め 、比 較 的 短 時 間 で 効 果 を 発 揮 す る な ど 、 有 用 性 は 高 い(鮎 沢, 1978)。こ の た め 、近 年 で は B. thuringiensisを 用 い た 生 物 的 防 除 資 材(BT 剤)が 多 く 流 通 し て お り 、出 荷 量 の シ ェ ア は ト ッ プ を 占 め て い る 。ま た 、Cry タ ン パ ク 質 は 殺 虫 活 性 の 他 に 細 胞 破 壊 活 性 を 有 し て お り 、 株 に よ っ て ヒ ト の ガ ン 罹 病 細 胞 に 対 す る 破 壊 活 性(Mizuki et al., 2000)や ト リ コ モ ナ ス 症 原 因
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微 生 物 で あ る Trichomonas vaginalis に 対 す る 攻 撃 性 も 確 認 さ れ て い る(Kondo et al., 2002；水 城 ら, 2004)。中 で も 、ガ ン 細 胞 に 破 壊 活 性 を 示 す Cryタ ン パ ク 質 は パ ラ ス ポ リ ン(parasporin)と 呼 ば れ て お り 、現 在 ま で に 6グ ル ー プ 19種 類 に 分 類 さ れ て い る(Nagamatsu et al., 2010)。こ の パ ラ ス ポ リ ン は 、ヒ ト の ガ ン 細 胞 を 選 択 的 に 破 壊 す る こ と が 可 能 で あ り 、 健 全 細 胞 に は 全 く の 無 害 で あ る(Mizuki et al., 2000)。
こ の よ う に 、B. thuringiensis は 様 々 な 活 性 が 明 ら か に な っ て い る た め 、 現 在 は よ り 詳 し い 機 能 解 明 や 新 規 BT 剤 の た め の 殺 虫 性 検 証 な ど の 性 状 解 析 が 行 わ れ て い る 。こ れ ら 有 用 な 特 性 を 持 つ 株 は ほ と ん ど が 野 外 環 境 か ら の 分 離 株 で あ る が 、 野 外 か ら の B. thuringiensis の 分 離 率 は 非 常 に 低 い 。BT 剤 は 生 物 的 防 除 資 材 の 中 で も 非 常 に 大 き な シ ェ ア を 持 つ 資 材 で あ り 、 こ れ か ら の 新 規 農 薬 開 発 に は 新 た な 有 用 特 性 を 持 っ た 株 の 獲 得 が 必 要 不 可 欠 で あ る 。
過 去 の 報 告 で は 、 土 壌 か ら の 分 離 や 植 物 体 の 表 面 、 河 川 の 水 か ら の 分 離 の 試 み が 行 わ れ て い る が 、 分 離 率 は 低 い 傾 向 に あ る(Ohba et al., 2000)。 こ れ ま で 確 認 さ れ て い る 有 用 株 は 野 外 か ら 発 見 さ れ た 分 離 株 か ら 見 つ か っ て い る た め 、B.
thuringiensis の 研 究 に お い て 有 用 株 の 分 離 率 の 向 上 は 非 常 に 重 要 な 要 素 で あ る 。 ま た 、 現 在 で も 新 た な 血 清 型 の B. thuringiensis が 発 見 さ れ て い る こ と か ら 、 自 然 環 境 下 に お い て は 未 知 の B. thuringiensis株 が ま だ 多 く 存 在 し て い る と 考 え ら れ る 。 さ ら に 、 現 在 の BT 剤 の 出 荷 率 は 生 産 コ ス ト や 殺 虫 性 、 殺 虫 範 囲 な ど の 問 題 で 停 滞 し て い る 傾 向 が あ る た め 、 適 応 範 囲 の 広 い 株 や 増 殖 能 の 高 い 株 、 耐 酸 性 や 耐 ア ル カ リ 性 な ど の 新 規 特 性 保 有 株 な ど も 求 め ら れ て い る 。 特 に 、 我 が 国 は 降 水 量 が 多 い た め 、 国 土 は 主 に 酸 性 土 壌 で あ り 、 耐 酸 性 株 の 発 見 は 非 常 に 重 要 で あ る 。
そ こ で 、 本 研 究 で は B. thuringiensisの 新 規 検 索 方 法 の 確 立 を 目 的 と し た 分 離
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実 験 を 実 施 し た 。 ま ず 、 従 来 法 よ り も 高 頻 度 な 分 離 を 目 指 す た め 、 こ れ ま で と は 異 な る 視 点 で 実 験 を 行 う こ と と し た 。 こ の た め 、 こ れ ま で に あ ま り 報 告 さ れ て い な い 場 所 と し て 、人 間 生 活 と 密 接 な 関 わ り が 深 い 都 市 環 境 を 対 象 に 実 験 を 行 っ た 。 本 研 究 で は 2010年 か ら 2015年 ま で の 6年 間 に わ た る 分 離 実 験 を 試 み た 。 ま た 、 得 ら れ た 分 離 株 の 中 の 種 多 様 性 を 確 認 す る た め 、 分 子 生 物 学 的 手 法 に よ る 検 証 実 験 を 行 っ た 。検 証 実 験 に は 、SSU rRNA 遺 伝 子 配 列 解 析 お よ び ゲ ノ ム プ ロ フ ァ イ リ ン グ(GP)法 の 2つ の 手 法 を 用 い た 。
本 論 文 は 、2 章 に 都 市 環 境 に お け る 分 離 検 索 実 験 を 、3 章 と 4 章 に 2 種 類 の 分 子 生 物 学 的 手 法 に よ る 分 離 株 間 の 差 異 の 検 証 結 果 を 記 載 し た 。 さ ら に 、 得 ら れ た 結 果 か ら 、5章 で は B. thuringiensis の 有 用 性 や こ れ か ら の 研 究 課 題 に つ い て も 考 察 し た 。
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第 2 章 都市環境における
Bacillus thuringiensis
の 分離実験1 序 論
B. thuringiensis は グ ラ ム 陽 性 の 桿 状 の 昆 虫 病 原 細 菌 で あ る 。 本 菌 は 芽 胞 形 成 細 菌 で あ り 、 至 適 環 境 外 で も 生 存 で き る 。 ま た 、 芽 胞 形 成 時 に crystal と い う タ ン パ ク 質 様 物 質 を 産 生 す る 。 こ の crystal は 昆 虫 体 内 の 消 化 管 の よ う な ア ル カ リ 環 境 下 で 融 解 し 、 プ ロ テ ア ー ゼ K 等 で 部 分 分 解 さ れ る こ と で 活 性 型 の Cry タ ン パ ク 質 と な る 。こ の Cryタ ン パ ク 質 が 、昆 虫 中 腸 内 の 円 筒 細 胞 に 存 在 す る 受 容 体 と 結 合 し 、 ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 や 孔 形 成 を 引 き 起 こ す こ と で 中 腸 円 筒 細 胞 が 破 壊 さ れ 、 昆 虫 の 摂 食 を 阻 害 す る 。 さ ら に 、 破 壊 さ れ た 部 位 を 通 じ て 菌 体 や 雑 菌 が 昆 虫 の 体 腔 側 に 侵 入 し 、 中 腸 内 の 雑 菌 と と も に 増 殖 し て 敗 血 症 を 引 き 起 こ す 。B.
thuringiensisに 感 染 し た 昆 虫 は 、こ の 2つ の 症 状 に よ っ て 致 死 す る(姫 野,1999；
Schnepf et al., 1998)。こ の 殺 虫 機 構 に は 、受 容 体 の 存 在 が 重 要 で あ り 、受 容 体 を 持 た な い 昆 虫 に は 作 用 し な い 。 ま た 、 人 獣 は こ の 受 容 体 を 持 た な い た め 、 こ の 殺 虫 タ ン パ ク 質 を 利 用 し た BT 剤 と し て 、 農 作 物 害 虫 の 微 生 物 的 防 除 資 材 に 活 用 さ れ て い る 。 微 生 物 的 防 除 資 材 の 中 で も 、B. thuringiensis を 用 い た 製 剤 は 出 荷 量 に お い て 高 い シ ェ ア を 保 持 し て お り(有 江・国 見, 2010)、有 用 性 が 確 認 さ れ て い る 。 ま た 、 現 在 確 認 さ れ て い る B. thuringiensisは 、 野 外 よ り 検 出 さ れ た 分 離 株 で あ る た め 、 今 後 の 製 品 開 発 の た め に も 新 規 B. thuringiensis株 の 効 率 的 な 分 離 手 法 が 求 め ら れ て い る(Yamamoto, 1993；Iizuka et al., 1994)。 し か し な が ら 、B.
thuringiensis は Bacillus 属 細 菌 の 中 で も 検 索 率 が 低 い と さ れ て い る(菊 田 ら, 1999)た め 、 有 用 形 質 を 持 つ 株 の 検 索 が や や 困 難 で あ る(Ohba et al., 2000)。
ま た 、分 離 し た 後 の 確 認 作 業 も 非 常 に 重 要 で あ る 。本 菌 と 近 縁 な 細 菌 と し て B.
cereus が 存 在 す る が 、 本 菌 と の 差 異 は crystal 産 生 能 の 有 無 の み と い っ て も よ い
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ほ ど 微 細 で あ る 。 過 去 の 研 究 報 告 に お い て も 、B. cereus の 株 群 の 中 か ら B.
thuringiensisの 血 清 に 反 応 凝 集 し た 株 が 見 つ か る な ど 、非 常 に 近 縁 で あ る こ と が 知 ら れ て い る(Ohba and Aizawa, 1986)。 こ の よ う に 、 両 細 菌 は 非 常 に 近 縁 で あ る た め 、同 じ 細 菌 で は な い か と す る 研 究 者 も 存 在 す る 。し か し 、B. thuringiensis の crystal は 昆 虫 に 病 原 性 を 示 し 、 そ の 毒 素 タ ン パ ク 質 は 昆 虫 に 対 し て の み 特 異 的 で あ る 。反 対 に 、B. cereus は セ レ ウ リ ド と い う 、ヒ ト に 対 す る 毒 素 タ ン パ ク 質 の 産 生 能 を 持 つ 。 こ の crystal 産 生 能 や セ レ ウ リ ド 産 生 能 を 分 子 生 物 学 的 に 検 査 す る こ と で 、B. thuringiensis と B. cereus を 判 別 す る こ と は 可 能 と さ れ て い る (Agata et al., 2002)。 ま た 、crystal は 位 相 差 顕 微 鏡 等 を 用 い る こ と で B.
thuringiensisか ら の み 確 認 可 能 な た め 、顕 微 鏡 観 察 に お い て 判 別 す る こ と も 可 能 で あ る 。こ れ ら の こ と か ら 、B. thuringiensisと B. cereus の 判 別 は crystal の 有 無 の 調 査 が 簡 便 か つ 確 実 な 手 法 で あ る と い え る 。
こ れ ら の 既 知 報 告 を 受 け 、 今 後 の B. thuringiensis 研 究 な ら び に BT 剤 の 研 究 開 発 の た め に は 、 ま ず 新 規 B. thuringiensis株 の 検 索 が 必 須 で あ り 、 そ の た め の 礎 と な る 新 規 検 索 手 法 の 開 発 が 必 要 で あ る と 考 え た 。 従 っ て 、 本 研 究 で は 、 今 ま で に 報 告 例 の 乏 し い 人 間 生 活 に 密 接 な 関 わ り の あ る 都 市 環 境 を 新 た な 分 離 場 所 と し て 設 定 し 、 都 市 環 境 に お け る B. thuringiensis の 検 索 を 試 み る こ と と し た 。 同 時 に 、 得 ら れ た 菌 体 は 顕 微 鏡 観 察 し 、 芽 胞 と crystal の 2 つ の 内 容 物 の 有 無 に よ る 判 定 で 、B. thuringiensis を 判 断 す る こ と と し た 。
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2 材 料 お よ び 方 法
2-1 Bacillus属 菌 の 分 離
分 離 実 験 に は 、 DD チ ェ ッ カ ー ： MYP 寒 天 培 地 (KYOKUTOU PHARMACEUTICAL INDUSTRIAL CO., LTD)を 用 い た 。DD チ ェ ッ カ ー は 、 食 品 工 場 な ど で 食 中 毒 菌 と し て 知 ら れ る B. cereus を 単 離 す る た め に 作 ら れ た 検 査 キ ッ ト で あ る 。B. thuringiensis と B. cereus は お 互 い に 非 常 に 近 縁 な 細 菌 で あ る が 、 両 細 菌 は crystal の 有 無 が 最 大 の 相 違 点 で あ る た め 、 顕 微 鏡 観 察 に よ っ て 両 者 を 分 類 す る こ と が 可 能 で あ る 。2010 年 か ら 2015 年 ま で の 6年 間 、都 市 環 境 と し て 設 定 し た 日 本 大 学 生 物 資 源 科 学 部 構 内 の 中 か ら 毎 年 5 月 に ラ ン ダ ム に 20 ヶ 所 を 選 択 し て 分 離 実 験 を 行 っ た(表 1, 図 1)。 サ ン プ リ ン グ は 、DD チ ェ ッ カ ー の ふ た を 開 け 、 対 象 と な る 場 所 に DD チ ェ ッ カ ー を 押 し 当 て る こ と で 対 象 の 表 面 に 存 在 す る 微 生 物 を 培 地 部 分 に 付 着 さ せ た 。ま た 、水 辺 で は 滅 菌 さ れ た 綿 棒(株 式 会 社 CS)を 用 い て 対 象 地 の 水 分 を 含 ま せ 、 培 地 部 分 に 塗 り 拡 げ た 。 サ ン プ リ ン グ 後 は 素 早 く ふ た を 閉 じ る こ と で 、 他 の 細 菌 侵 入 の 可 能 性 を 極 力 低 く し た 。 サ ン プ リ ン グ 後 の DDチ ェ ッ カ ー は 、イ ン キ ュ ベ ー タ ー(FUKUSHIMA INDUSTORIES CORP.)を 用 い て 30-37℃ で 3-4日 間 培 養 し た 。培 養 後 、DDチ ェ ッ カ ー を 確 認 し 、 Bacillus属 コ ロ ニ ー の 形 成 の 有 無 を 確 認 し た 。Bacillus属 コ ロ ニ ー は 、培 地 上 の コ ロ ニ ー 周 辺 に ハ ロ ー が 形 成 さ れ た も の を 数 え た(図 1)。 培 養 後 の DD チ ェ ッ カ ー は 4℃ の 暗 所 で 保 存 し た 。
2-2 分 離 し た Bacillus属 コ ロ ニ ー の 単 離
確 認 し た Bacillus 属 コ ロ ニ ー は 、 乾 熱 滅 菌 し た 爪 楊 枝 で Polymyxin Pyruvate Egg Yolk Mannitol Bromothymol Blue Agar (PEMBA)培 地 に 植 菌 し た 。PEMBA 培 地 は 、バ チ ル ス セ レ ウ ス 選 択 寒 天 基 礎 培 地(Oxoid Ltd)8.2gに D.W. 110mlを 加 え 、オ ー ト ク レ ー ブ で 121℃40分 間 処 理 し た 後 、無 菌 条 件 下 で polymixin B(Oxoid
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Ltd)を 800μl、 卵 黄 乳 液(Oxoid Ltd)を 10.0ml 入 れ 、 ス タ ー ラ ー(Yamato Scientific co., Ltd.)を 用 い て 混 和 し 、 作 成 し た 。 混 和 し た 培 地 を 、9cm 径 の プ ラ ス チ ッ ク シ ャ ー レ(AS ONE CO.)10 枚 に 分 注 し た 。 充 分 固 ま っ た 培 地 は 、 使 用 す る ま で 4℃ で 保 存 し た 。 植 菌 は 無 菌 条 件 で 行 い 、 ピ ン セ ッ ト で 滅 菌 爪 楊 枝 を 火 で 数 回 あ ぶ り 、対 象 と す る コ ロ ニ ー に 先 端 を 付 着 さ せ 、未 植 菌 の PEMBA培 地 に 擦 り 付 け る こ と で 行 っ た 。植 菌 後 の PEMBA培 地 は 30-37℃ で 16時 間 以 上 培 養 し 、 コ ロ ニ ー の 形 成 を 確 認 し た 。 コ ロ ニ ー が 形 成 さ れ た 株 は 、 ス テ ン レ ス エ ー ゼ(AS ONE Co.)を 用 い て 新 し い PEMBA 培 地 上 に 画 線 植 菌 し 、 こ れ を 2~3 回 繰 り 返 す こ と で 単 離 し た 。
2-3 B. thuringiensis の 判 定
単 離 し た 株 は 芽 胞 染 色 を 行 い 、B. thuringiensis の 判 別 を 行 っ た 。 芽 胞 染 色 に は 、5%(w/v)マ ラ カ イ ト グ リ ー ン(KANTO CHEMICAL CO., INC.)、0.3%(w/v)ズ ダ ン ブ ラ ッ ク(SIGMA ALDRICH CO.)、0.5%(w/v)サ フ ラ ニ ン レ ッ ド(KANTO CHEMICAL CO., INC.)を 用 い た 。 ま ず 、 単 離 し た 菌 体 に 、 滅 菌 し た 爪 楊 枝 を 無 菌 条 件 下 で 付 着 さ せ て と り 、 ス ラ イ ド ガ ラ ス に 塗 抹 し 、 乾 燥 さ せ た 。 そ の 後 、 弱 い 火 に ス ラ イ ド ガ ラ ス 下 部 が 当 た る よ う に 1～2 回 あ ぶ り 、 火 炎 固 定 を 行 っ た 。 ス ラ イ ド ガ ラ ス の 菌 体 塗 抹 部 分 が 浸 る よ う に マ ラ カ イ ト グ リ ー ン の 適 量 を 滴 下 し 、 湯 気 が 出 る ま で 弱 い 火 で あ ぶ っ た 。 湯 気 を 確 認 し た 後 2分 間 静 置 し 、流 水 を か け て 緩 や か に マ ラ カ イ ト グ リ ー ン を 流 し 落 と し 、送 風 機(Japan troika corp.)を 用 い て 乾 燥 さ せ た 。 乾 燥 し た ス ラ イ ド ガ ラ ス に ズ ダ ン ブ ラ ッ ク を 滴 下 し 、 過 剰 染 色 を 防 ぐ た め に 上 か ら ろ 紙 を 置 い て 15分 静 置 し て 染 色 し た 。染 色 後 、ろ 紙 を と り 、キ シ レ ン で 5秒 間 ズ ダ ン ブ ラ ッ ク を 洗 っ た 。 乾 燥 さ せ た 後 、 サ フ ラ ニ ン レ ッ ド を 菌 体 上 に 滴 下 し 、20秒 対 比 染 色 し 、流 水 で 流 し 落 と し た 。充 分 に 乾 燥 さ せ た 後 、位 相 差 顕 微 鏡(Nikon Corporation)を 用 い て 菌 体 を 観 察 し た 。B. thuringiensis は 同
11
じ 芽 胞 形 成 細 菌 で あ る B. cereus と 近 縁 な 細 菌 で あ る が 、crystalを 産 生 す る と い う 決 定 的 な 差 異 が 存 在 す る 。 菌 体 内 に 芽 胞 と crystal と 思 わ れ る 2 つ の 内 容 物 が 確 認 さ れ た 場 合 に 、B. thuringiensis と 同 定 し た 。 こ の 操 作 を 単 離 し た す べ て の コ ロ ニ ー で 行 い 、B. thuringiensis と 断 定 し た 数 を 集 計 し た 。 分 離 率 の 計 算 は 、 単 離 し た Bacillus属 コ ロ ニ ー 数 を 分 母 と し 、断 定 さ れ た B. thuringiensis 数 を 分 子 と し た 時 の 割 合 の 数 値 と し た 。B. thuringiensis と 判 明 し た 菌 体 は 、 斜 傾 培 地 に 植 菌 し 、16 時 間 30℃ で 培 養 後 、 室 温 の 暗 所 で 保 存 し た 。 斜 傾 培 地 は 、 普 通 寒 天 培 地「 ニ ッ ス イ 」(日 水 製 薬 株 式 会 社)を 用 い て 作 成 し た 。三 角 フ ラ ス コ に D.W.
200ml と 7.0g の 培 地 を 入 れ 、 オ ー ト ク レ ー ブ で 121℃ 40 分 処 理 し た 。 そ の 後 、 5ml容 量 の プ ラ ス チ ッ ク 培 養 チ ュ ー ブ(Evergreen Scientific Co.)に 2mlず つ 分 注 し 、 傾 き を 与 え て 固 化 さ せ 、 斜 傾 培 地 と し た 。
図 1. ス ク リ ー ニ ン グ の 状 況 と 培 養 後 の DD チ ェ ッ カ ー お よ び 染 色 し た 分 離 株 の 顕 微 鏡 写 真
顕 微 鏡 写 真 は 1,000 倍 の 倍 率 で 撮 影 し た も の を 拡 大 し て 表 し た 。
2つ の 内 容 物 卵 黄 反 応 に よ る ハ ロ ー
12 表 1a. 2010年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
1. 本 館 エ レ ベ ー タ の ボ タ ン 11. 男 子 ト イ レ の 床 2. 給 水 機 の ボ タ ン 12. サ ク ラ の 葉 表 3. ト ラ ッ ク の ド ア ノ ブ 13. 圃 場 の 土 4. 自 動 販 売 機 の ボ タ ン 14. 噴 水 の 水
5. ビ オ ト ー プ の 水 1 15. ATM 画 面 横
6. バ ラ 園 の バ ラ 葉 裏 16. 生 体 (手 の 甲)
7. パ ソ コ ン の キ ー 17. 12号 館 エ レ ベ ー タ の ボ タ ン
8. 手 す り 18. 圃 場 の 蛇 口
9. ビ オ ト ー プ の 水 2 19. 携 帯 電 話
10. ベ ン チ 20. バ ラ 花 弁
表 1b. 2011 年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
21. 2号 館 水 飲 み 場 31. 本 館 横 の 池
22. 実 験 室 黒 板 32. 2号 館 前 ビ オ ト ー プ
23. カ ー ド 読 み 取 り 部 33. 3号 館 自 販 機 ボ タ ン
24. バ ラ 園 噴 水 34. ス ダ ジ イ 木 の 幹
25. エ ス カ レ ー タ ー 手 す り 35. モ ミ ジ の 葉
26. 体 育 館 の 柱 36. 券 売 機 の ボ タ ン
27. 図 書 館 の マ ウ ス 37. バ ラ 園 の 噴 水
28. 本 館 の オ ブ ジ ェ 38. フ ェ ロ モ ン ト ラ ッ プ 内 の 虫
29. ビ オ ト ー プ の 水 39. つ り 革
30. ベ ン チ 40. 眼 鏡
13 表 1c. 2012 年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
41. 研 究 室 下 駄 箱 51. 12号 館 の PCマ ウ ス
42. ほ う き の 穂 52. 貯 水 池
43. エ タ ノ ー ル 容 器 53. 10号 館 の 貯 水 池
44. ゴ ミ 箱 の 側 面 54. 正 門 の 石 碑
45. キ ー ボ ー ド 55. 短 大 棟 の 時 計
46. コ ン ビ ニ 前 の ベ ン チ 56. バ ッ ク の 底
47. サ ク ラ の 葉 の 表 面 57. 学 生 ホ ー ル の 椅 子 の 金 属 部 分 48. サ ク ラ の 葉 の 裏 面 58. 短 大 棟 の ビ オ ト ー プ 水
49. 公 衆 電 話 タ ウ ン ペ ー ジ 59. 農 場 ま で の 道 路
50. ジ ャ グ リ ン グ 道 具 の ス テ ィ ッ ク 60. ス マ ー ト フ ォ ン の 画 面
表 1d. 2013 年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
61. 本 館 1 階 傘 の 柄 71. 本 館 5階 ベ ン チ
62. 本 館 1 階 エ レ ベ ー タ の ボ タ ン 72. 本 館 4階 男 子 ト イ レ 床
63. 守 衛 さ ん の 指 73. ガ レ リ ア 灰 皿 の 上
64. 12号 館 自 販 機 の 釣 銭 受 け 口 74. ガ レ リ ア ゴ ミ 箱 65. デ ジ タ ル メ モ の エ ン タ ー キ ー 75. 靴 の 裏
66. 12号 館 椅 子 76. 体 育 館 内 冷 水 器
67. 体 育 館 前 の 机 77. 41講 義 室 ド ア ノ ブ
68. 本 館 横 ガ レ リ ア 階 の 池 78. 本 館 入 口 観 葉 植 物 の 葉 69. 2号 館 1 階 手 す り 79. 雨 水
70. 図 書 館 1階 PCキ ー ボ ー ド 80. 1万 円 札
14 表 1e. 2014年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
81. 体 育 館 の ア リ ー ナ 床 91. 写 真 現 像 用 PC マ ウ ス 82. 12号 館 2階 エ レ ベ ー タ 前 の ベ ン チ 92. 体 育 館 入 口 壁
83. 5号 館 分 子 遺 伝 学 研 究 室 の 机 上 93. 本 館 横 外 階 段 84. ATMタ ッ チ パ ネ ル 94. サ ー ク ル 棟 掲 示 板
85. ATM手 す り 95. 短 大 研 究 室 培 養 棚
86. 湘 南 キ ャ ン パ ス の 記 念 碑 96. 図 書 館 の 本
87. 12号 館 前 机 97. ガ レ リ ア 階 池
88. フ ェ ロ モ ン ト ラ ッ プ の 縁 98. 農 場 自 販 機 ボ タ ン 89. 動 物 病 院 診 察 室 前 の 廊 下 99. 12号 館 1階 キ ー ボ ー ド 90. 図 書 館 PCマ ウ ス 100. 本 館 エ レ ベ ー タ 床
表 1f. 2015年 の 分 離 場 所(20ヶ 所)
101. フ ェ ロ モ ン ト ラ ッ プ の 屋 根 111. 応 昆 温 室 の 黄 色 い 柵 102. 図 書 館 横 の 石 碑 112. 12号 館 PC の マ ウ ス 103. 応 昆 冷 蔵 庫 下 の 水 113. ゴ ミ 収 集 所 の 門
104. 図 書 館 の 12 番 机 の 左 ヘ ッ ド ホ ン 114. 新 1号 館 の ス テ ー ジ 床 a 105. 実 行 委 員 会 室 の 天 井 115. 図 書 館 3階 の 机
106. 応 昆 温 室 の 屋 根 116. バ イ ク の シ ー ト 107. サ ー ク ル 棟 部 室 床 117. 農 場 棟 の 玄 関 マ ッ ト 108. 農 場 棟 男 子 更 衣 室 前 の 階 段 118. CNESの 門
109. 農 場 棟 流 し 場 の 壁 119. 12号 館 2階 実 験 室 前 の 天 井 110. 生 命 農 学 科 圃 場 の 水 溜 120. 新 1号 館 の ス テ ー ジ 床 b
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3 結 果
6 年 間 で 120 ヶ 所 か ら 分 離 実 験 を 行 っ た と こ ろ(図 2)、 す べ て の 年 で B.
thuringiensisを 確 認 し た 。B. thuringiensisを 分 離 し た 場 所 は 、最 終 的 に 120 ヶ 所 中 51ヶ 所 で あ っ た(表 2)。6年 間 の 実 験 で 、単 離 し た Bacillus属 の コ ロ ニ ー 数 は 合 計 250 コ ロ ニ ー で あ り 、 そ の う ち 170 株 を B. thuringiensisと 判 定 し た 。6 年 間 合 計 で 得 ら れ た Bacillus 属 の コ ロ ニ ー 数 と B. thuringiensis の 分 離 株 数 か ら 得 ら れ た 分 離 率 は 、68.0%で あ っ た(表 2)。ま た 、各 年 の B. thuringiensis分 離 数 や 分 離 率 の 詳 細 を 表 3 に 表 し た 。6 年 間 で 、B. thuringiensis が 最 も 多 く 分 離 さ れ た 年 は 2014年 で あ り 、54株 で あ っ た(表 3e)。反 対 に 、分 離 数 が 最 も 少 な か っ た の は 2012年 で 、12株 で あ っ た(表 3c)。20 ヶ 所 中 、B. thuringiensis を 分 離 し た 場 所 が 最 も 多 か っ た 年 は 2010 年 で 、12ヶ 所 か ら B. thuringiensis を 分 離 し た(表 3a)。2011 年 と 2013 年 は B. thuringiensis 数 が 同 じ で あ っ た も の の 、 Bacillus属 コ ロ ニ ー 数 が 異 な る た め 、分 離 率 は 大 き く 異 な っ た(表3bお よ び 3d)。
ま た 、各 年 の 最 多 分 離 場 所 は 、2010 年 が 学 生 ホ ー ル 横 の ベ ン チ と 12号 館 1 階 の 男 子 ト イ レ の 床 、2011 年 で は 学 生 ホ ー ル 横 の ベ ン チ 、2012 年 で は 応 用 昆 虫 科 学 研 究 室 の 下 駄 箱 、2013 年 で は 研 究 室 員 の 靴 の 裏 、2014 年 で は 本 館 の 横 に 位 置 す る 外 階 段 の 壁 、2015 年 で は 農 場 棟 の 玄 関 マ ッ ト で あ っ た 。 中 で も 、2014 年 の 分 離 場 所 は 6 年 間 で 実 施 さ れ た 分 離 場 所 の 中 で 、1 ヶ 所 に お け る 最 多 分 離 数(13 株)を 記 録 し た 場 所(本 館 横 外 階 段)を 含 ん で い た 。
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図 2. 6年 間 に お け る Bacillus thuringiensis の サ ン プ リ ン グ 場 所
各 年 の 分 離 場 所(20 ヶ 所)を 表 し た 。ま た 、地 図 上 で 表 す こ と が で き な か っ た 場 所 は 未 記 載 と し た 。未 記 載：2010年 は 2地 点 。2011 年 は 4地 点 。2012 年 は 4 地 点 。2013年 は 4地 点 。2015年 は 6地 点 。
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表 2. 6年 間 で 得 ら れ た Bacillus thuringiensis の 分 離 株 数 と 分 離 率
分 離 年 分 離 場 所 数
Bacillus属 B. thuringiensis の 分 離 株
分 離 率(%) コ ロ ニ ー 数
2010 12 53 30 56.6
2011 10 35 21 60.0
2012 8 20 12 60.0 2013 5 29 21 72.4 2014 6 66 54 81.8
2015 10 47 32 68.1
計 51 250 170 68.0
分 離 率 は 分 母 を Bacillus属 コ ロ ニ ー 数 、分 子 を B. thuringiensis数 と し た 時 の 割 合 と し て 算 出 し た 。
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表 3a. 2010年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensisの 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
給 水 機 の ボ タ ン 3 0
自 動 販 売 機 の ボ タ ン 3 1
ビ オ ト ー プ の 水 ・1 1 1
ビ オ ト ー プ の 水 ・2 4 4
バ ラ 園 ・ バ ラ 葉 裏 2 1
ベ ン チ 11 6
男 子 ト イ レ の 床 12 6
サ ク ラ の 葉 表 6 5
噴 水 の 水 4 3
生 体 （ 手 の 甲 ） 1 1
圃 場 ・ 蛇 口 3 0
携 帯 電 話 3 2
計 53 30
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表 3b. 2011 年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus 属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensisの 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
実 験 室 黒 板 1 0
カ ー ド 読 み 取 り 部 4 0
本 館 の オ ブ ジ ェ 1 0
ビ オ ト ー プ の 水 1 0
ベ ン チ 13 6
2号 館 前 ビ オ ト ー プ 3 3
ス ダ ジ イ 木 の 幹 1 1
モ ミ ジ の 葉 5 5
つ り 革 4 4
眼 鏡 2 2
計 35 21
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表 3c. 2012 年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus 属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensisの 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
研 究 室 下 駄 箱 6 5
ほ う き の 穂 1 0
葉 の 表 面 1 0
貯 水 池 3 2
10号 館 の 貯 水 池 4 2
正 門 の 石 碑 1 0
短 大 棟 ビ オ ト ー プ 水 3 3
農 場 ま で の 道 路 1 0
計 20 12
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表 3d. 2013 年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus 属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensisの 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
体 育 館 前 の 机 1 1
本 館 4階 男 子 ト イ レ 床 5 1
ガ レ リ ア 灰 皿 の 上 3 1
ガ レ リ ア ゴ ミ 箱 6 6
靴 の 裏 14 12
計 29 21
表 3e. 2014年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus 属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensisの 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
体 育 館 の ア リ ー ナ 床 a 13 9
湘 南 キ ャ ン パ ス の 記 念 碑 12 10
12号 館 前 机 12 11
フ ェ ロ モ ン ト ラ ッ プ の 淵 11 9
本 館 横 外 階 段 16 13
農 場 自 販 機 ボ タ ン 2 2
計 66 54
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表3f. 2015 年 の 分 離 場 所 お よ び 得 ら れ た Bacillus属 コ ロ ニ ー と B. thuringiensis の 分 離 株 数
分 離 場 所
Bacillus属
B. thuringiensis コ ロ ニ ー 数
フ ェ ロ モ ン ト ラ ッ プ 屋 根 5 5
図 書 館 横 の 石 碑 1 1
図 書 館 の ヘ ッ ド ホ ン 1 1
応 昆 温 室 の 屋 根 6 6
サ ー ク ル 棟 部 室 床 10 5
農 場 棟 流 し 場 の 壁 2 1
生 命 農 学 科 圃 場 の 水 溜 9 5
新 1号 館 の ス テ ー ジ 床 2 0
バ イ ク の シ ー ト 2 1
農 場 棟 の 玄 関 マ ッ ト 9 7
計 47 32
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4 考 察
B. thuringiensis は 、1901年 に 日 本 人 の 石 渡 繁 胤 博 士 が カ イ コ の 卒 倒 病 菌 と し て 日 本 語 で 報 告 し て 以 降(石 渡, 1901)、 本 菌 は 日 本 に お い て カ イ コ に 重 篤 な 毒 性 を 示 す 病 原 菌 と し て 認 知 さ れ て き た 。し か し 、1915年 に ド イ ツ 人 の エ ル ン ス ト・
ベ ル リ ナ ー が 同 菌 を 中 部 ド イ ツ の チ ュ ー リ ン ギ ア(Thuringia)で 発 見 し 、B.
thuringiensisの 名 称 で 初 め て 国 際 論 文 に 投 稿 し た こ と に よ り 、B. thuringiensis の 正 式 名 が 決 定 す る と と も に そ の 存 在 が 知 れ 渡 っ た(Berliner, 1915)。そ の 後 、カ イ コ の 餌 と な る ク ワ 葉 を は じ め と す る 植 物 体 や 、 土 壌 、 水 な ど か ら B.
thuringiensisの 分 離 が 試 み ら れ 、B. thuringiensisの 分 布 状 況 の 調 査 が 行 わ れ て き た 。 従 来 ま で の 分 離 方 法 は 、 土 壌 や 水 な ど を 現 地 で サ ン プ リ ン グ し 、 研 究 施 設 に 持 ち 込 ん で か ら 70℃ 約 30 分 の 加 温 処 理 を 行 う こ と で 、B. thuringiensis を は じ め と す る 芽 胞 を 持 つ 細 菌 以 外 の 細 菌 を 死 滅 さ せ 、 セ レ ク シ ョ ン を 行 う と い う も の で あ っ た 。 こ の よ う に B. thuringiensis の 検 索 は 自 然 環 境 下 を 主 体 と し て 行 わ れ て き た 。 し か し な が ら 、 自 然 環 境 に お け る こ れ ま で の 分 離 報 告 で は 、 土 壌 に お い て 3%(百 武 ・水 城, 2008)、河 川 の 水 に お い て 4.4%(Ichimatsu et al., 2000)、植 物 体 表 面 に お い て は 3.4%(Mizuki et al., 1999)と 、 必 ず し も 高 い 割 合 と は 言 え な か っ た 。 こ れ を 受 け 、 本 実 験 で は 視 点 を 変 え 、 都 市 環 境 と い う こ れ ま で 報 告 の 少 な か っ た 場 所 に お い て 6 年 間 の 継 続 し た 分 離 実 験 を 行 い 、 分 離 率 を 算 出 し た 。そ の 結 果 、6 年 間 す べ て の 年 で 分 離 率 50%以 上 を 記 録 し た 。6 年 間 平 均 で は 68.0%
と 、 過 去 の 報 告 と 比 較 し て 飛 躍 的 に 分 離 率 を 向 上 す る こ と が で き た 。 ま た 、 本 実 験 手 法 で あ れ ば 、 従 来 法 で は 対 象 と す る こ と が 難 し か っ た 無 機 物 や 建 造 物 の よ う な 場 所 に お い て も 、 簡 単 に ス ク リ ー ニ ン グ す る こ と が 可 能 で あ っ た 。 加 え て 、 屋 内 外 を 問 わ ず 検 索 場 所 を 選 定 で き る た め 、 今 ま で 実 施 さ れ な か っ た 場 所 も ス ク リ ー ニ ン グ の 候 補 と す る こ と が で き た 。
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今 回 の ス ク リ ー ニ ン グ に お け る 各 年 の 最 多 分 離 場 所 は 屋 内 外 と も に 人 々 の 足 元 付 近 が 多 い 傾 向 に あ る こ と が 判 明 し た 。 こ れ は 、 大 学 と い う 不 特 定 多 数 の 人 々 が 行 き 交 う 場 所 を 検 索 場 所 と し た こ と に 起 因 す る 。 す な わ ち 、 頻 繁 に 人 や 物 資 の 移 動 が 起 こ る 都 市 環 境 で は 、 人 や 物 資 に 付 着 し た 微 生 物 が 各 所 よ り 持 ち 込 ま れ る こ と に な り 、 そ れ が 原 因 で 微 生 物 相 が 激 し く 変 動 し て い る と 推 察 さ れ る 。B.
thuringiensisは 芽 胞 形 成 細 菌 で あ り 、そ の 芽 胞 は 太 陽 光 線 や 紫 外 線 、乾 燥 を は じ め と す る 外 部 ス ト レ ス に 対 し て 耐 性 を 有 す る 。 ク リ ー ン ル ー ム の よ う な 、 本 来 滅 菌 が 徹 底 し て い る 場 所 で さ え Bacillus属 の 菌 体 が 分 離 さ れ る こ と も あ る(Wu and Liu, 2007) 。こ の こ と か ら 、多 数 の 微 生 物 が 付 着 す る 場 所 に お い て 、芽 胞 状 態 の B. thuringiensis が 残 存 し て い た こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 風 に よ っ て 建 造 物 の 壁 な ど に 微 生 物 が 集 積 し た 場 合 に も 、 芽 胞 形 成 菌 な ら ば 長 期 間 生 存 す る こ と は 可 能 で あ る(間 淵 ・ 佐 野 、2008)。 こ の よ う に 、 他 の 微 生 物 で あ れ ば 生 存 不 可 能 な 場 所 に お い て も 、B. thuringiensis は 芽 胞 状 態 で 生 存 し 得 る こ と で 、 こ れ ら の 場 所 か ら 多 数 の 株 が 分 離 さ れ た と 思 わ れ た 。 加 え て 、 他 の 微 生 物 が 生 存 し に く い 環 境 で あ る か ら こ そ 、B. thuringiensis の よ う な 芽 胞 形 成 細 菌 だ け が 生 存 し 、 本 実 験 で 得 ら れ た 高 い 分 離 率 を 実 現 で き た と 推 察 さ れ た 。 こ の こ と か ら 、DD チ ェ ッ カ ー を 用 い る こ と で 、 大 学 敷 地 内 で な く と も 都 市 環 境 に 準 ず る 場 所 な ら ば 、B.
thuringiensisの 検 索 が 可 能 に な る こ と が 示 唆 さ れ た 。
都 市 環 境 に お け る 検 索 で B. thuringiensisの 高 い 分 離 率 が 記 録 さ れ た 一 方 、 過 去 の 知 見 で は 、1 ヶ 所 あ た り の 分 離 率 は 必 ず し も 低 い ば か り で は な い 。 例 え ば 、 Ichimatsu et al. (2000)の 報 告 で は 、1ヶ 所 あ た り の 最 高 分 離 率 は 49%で あ っ た 。 つ ま り 、1 サ ン プ ル に お け る 分 離 率 に 限 れ ば 、 高 い 分 離 率 を 示 す 場 合 も あ る 。 こ れ ら の 知 見 で は 、全 て の Bacillus属 コ ロ ニ ー の 中 に お け る B. thuringiensisの 割 合 と し て 分 離 率 を 算 出 し て い る 。 本 研 究 に お い て も 、 同 様 に 分 離 率 の 評 価 を 行 っ
