エンドウ褐紋病菌サフレッサーの構造と作用機構

エンドウ褐紋病菌サフレッサーの構造と作用機構

1  9  9  4 年3月

加藤敏朗

エンドウ褐紋病菌サフレッサーの構造と作用機構

1  9  9  4 年 3 月

加藤敏朗

S t r u c t u r e  a n d  M o d e  o f  A c t i o n  

o f  S u p p r e s s o r s ，  ^{P a t h o g e n i c i t y  F a c t o r s}  

o f P e a P a ぬ o g e n ，

M y c o s p h a e r e U α p i y 似た s

M a r c h ，  ^{1 9 9 4}  

T o s h i a k i  K a t o  

『エンドウ褐紋病菌サプレッサーの構造と作用機構 J

緒 言 …

第 1章 第 1節

第 1項

エンドウ褐紋病菌サプレッサーの精製および構造解析.…ー…・ー・…4 エンドウ褐紋病菌サプレッサーの精製..…・………・・……….4 胞子発芽液の調製.…………・・・・・・…・・‑……・・...・…・・…...4

第 2項 ( 1 )  ( 2 )  ( 3 )  ( 4 )  ( 5 ) 

第 2節 第 1項 第 2項 第

3

項 第 4項

( 1 )  ( 2 )  ( 3 ) 

(  4  ) 

( 5 )  第

3

節

サプレッサーの精製……・・・…・・・…・………ー…・・・・…一‑一…….7 限外ろ過………・…・……・・・………・・・…………・・・………・・・・・・…7 ゲルろ過...……・・・…・...7 Sep‑PAK C18に よ る 分 離...7 逆相カラムを用いた高速液体ク口マト...ー・...8 イオン配位子カラムを用いた高速液体クロマト…・ー・・・・・・・・・・…8 エンドウ褐紋病菌サプレッサーの構造解析..・・・・・…...8 アミノ酸の組成分析.……・・・・・・……・…一....一…...一…・ー・・・・.10 糖の組成分析………・・…..10 アミノ酸配列の解析.……・・・・・・・・・・一...…・・・ー・.13 核磁気共鳴による構造解析.………ー………..13 

核 磁 気 共 鳴 法(NMR)による構造解析の方法……・・……‑……..13 Supprescin Aの構造解析一...…・・・・・……・・・・・・・・・・・・・・・・・・…...15 S u ppresci n Bの情造解析……・...15 Supprescinの一次構造...'..…・・・…・・・・・・・・・・…...….23 Supprescinの 立 体 槍 造 の 推 定...23

まとめ...姻...23

第 2章 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー お よ び そ の ペ プ チ ド 断 片 の

第 1節 第 1項 第 2項 第

3

項

生理活性 ‑insitu assay‑...ω...29 

実験材料および方法.………・……‑…‑………・…・30 供試試料...・・ω・・・・・・・...30 ピサチンの定量..…・・…………・・・…...一‑一…・・・・・・・ー・…・・・ー・....30 接 種 試 験

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 3 4

一 一 一 一 一 一 一 一 〓 圃

第

4

項 第 2節

第 1項

第 2項

第 3項 第 3節

第 1項 第 2項 第 4節

第

5

節

ATPase活性の組織化学的な検出....…・・・・・……‑一・……・・・・・・・...34 ピサチンの生合成に及ぼす効果...一...一...………....34 フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 の 経 時 的 変 化 に 及 ぼ す

Supprescin Aの効果……ー…………・・・……・・………・・・…・…ー・・34 フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 に 及 ぼ すSupprescin

処理濃度の効果...……・…・・……・…………一……・・・…・…・・…・・...36 フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 に 及 ぼ す 合 成 ペ プ チ ド の 効 果 … ・ ・ ・..36 菌の感染に及ぼす効果…・…一…………・ー…・・・・……・・・…...40 非 親 和 性 菌 の 感 染 に 及 ぼ すSupprescinの効果…・・…・・・・・・・….40 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 の 感 染 に 及 ぼ す 合 成 ペ プ チ ド の 効 果...40 エ ン ド ウ 組 織 に お け るATPase活 性 に 及 ぼ す

Supprescinの効果...ー...43 まとめ ...・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ー・・...43

第 3章 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー お よ び そ の ペ プ チ ド 断 片 の

第 1節 第 1項 第 2項

( 1 )  ( 2 )  ( 3 ) 

(  4  ) 

( 5 ) 

第 3項 第 4項

( 1 )  ( 2 )  ( 3 ) 

(  4  ) 

第 5項

生 理 活 性 ‑invitro assay‑…・・…...…一…・・・・・・・・・・・・…・・46 実験材料および方法…・・………・……….46 供試試料...・・…・・...46 エンドウ原形質膜画分の調製…・・・・・・・・・・…・・・・・……・・・・・・・・・・ー・....46 バ ッ フ ァ 一 類 の 調 製...48

エンドウ上座軸の準備…・・・・・・・・・・・・・・・...49

粗ミクロソーム画分の調製…・・・・・……...一...一・...49

水 性 二 相 分 配 法 に よ る 原 形 質 膜 粗 画 分 の 調 製 … … … … ‑ … ….49

シ ョ 糖 密 度 勾 配 遠 心 分 離 法 に よ る 原 形 質 膜 画 分 の 調 製 ー ・ ….49 ATPase活性の測定…...一...……・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ー・….50 ATPase活性のカイネティクス解析...・・・・・・ー・……・・・・・・・ー・....50 ATPase活 性 の 測 定 .…・・・・・・…・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ー・・・・・・…...51 両逆数プロットによる阻害様式の雄定....・ー・・・・・・・・・…...51 Michaelis定 数(Km)お よ び 最 大 比 活 性 (Vmax)の 算 出 ...51 阻害定数の算出…‑………・・・………51 酸性ホスファターゼ活性の測定…・・…・・・・・・…・・・・・・・・・・・

. . . . . . . . . . . . 5 5

第 6項 第 2節

第 1項 第 2項 第 3項 第 3節 第

4

節 第

5

節

第 4章 第 1節

第 1^項 第 2項 第

3

項 第 2節

第 1^項 第 2項 第 3項 第 3節

第

5

章

第 1節 第 1項 第 2項 第 2節

第 1項 第 2項

プロテインキナーゼ活性の測定…・・・…・・………・・・・・・・……・・・・・・・・55

ATPase活性に及ぼす効果.…・・・・・・・・・・・・・…ー・ー…...58 ATPase活性の阻害効果.・・・・副・・・・・・・・…・・・...・・・・・…...58 ATPase活 性 に 対 す るSupprescinAの効果.………・58

ATPase活 性 阻 害 様 式 の 解 析 ………・………58

酸 性 ホ ス フ ァ タ ー ゼ 活 性 に 及 ぼ す 効 果...…・・・・・・…・…・・・・・・.61 プ ロ テ イ ン キ ナ ー ゼ 活 性 に 及 ぼ す 効 果 … ………ー・・・...67 まとめ...・・一...一..70 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 糖 鎖 の 機 能 に つ い て ...…・・・・….72 実験方法.…・・・……ー……・・・………...72 エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPase活 性 に 対 す る 効 果 … … … ………….72 エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 に 及 ぼ す 効 果 ...72

エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 の 感 染 に 及 ぼ す 効 果 ……….73

実験結果.………・・…………・………・...…・・...…....73 エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPase活性に対する効果………...….73 エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 に 及 ぼ す 効 果 ...…・・・・....73 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 の 感 染 に 及 ぼ す 効 果 … … … ………・・…..76

まとめ

. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .

・一....76

エ ン ド ウ 原 形 質 膜H¥ATPasecDNAの ク 口 一 二 ン グ と 構造解析...・・………・・・…・……・一....一...…‑一・…...….80

高 等 植 物 の 原 形 質 膜H¥ATPase遺 伝 子 の 構 造...81

原 形 質 膜H+‑ATPaseの構造.・・…・・...81

高 等 植 物 の 原 形 質 膜H+‑ATPase遺伝子の比較...…...84

エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPasecDNAの ク ロ ー ニ ン グ...86

PCRプライマーの設計と合成...……ー・・・・…一...ー...86 PCR法 に よ る エ ン ド ウ 原 形 質 膜H+‑ATPase cD NAの 増 幅...86 ( 1 )  ( 2 )  第 3項 鋳 型 と な る エ ン ド ウcDNAの調製一...…・・・…一...一…・.86 PCR法 に よ るATPasecDNAの増幅...・ー・・・・....86 PCR増幅断片のクローニング...・…...……・・・・・…・一一88

項 1 2 3

項1節

1 ( ( ( 2 (

3

第 第

第

( 2 )  第 4節

エンドウ原形質膜H¥ATPasecDNAの構造解析...….88

実験方法.・・・…・…・・・・……・・・...88 デリーションクローンの作成..………・一...….88

塩基配列の決定..・…...・^H ・………・・・…・・・…・・・…・・…………・・・・….92 ゲノミックサザン分析..・・・…ー・………・……・・……・………・...92 結果および考察…………ー…ー・・・………・…ー・………ー・ー・....93

エンドウ原形質膜H¥ATPase遺 伝 子 の 塩 基 配 列 お よ び

推 定 ア ミ ノ 酸 配 列...93 ゲノミックサザン分析………‑…………・・……・・・………一・・...93 まとめ ...99

第 6章 総合考察および結論.…・・・・・・・…・…・・・・・・・・ー・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・…...103

摘 要...・ー・・・・…・・・・・・・…・・・・…....・^H ・..…・・・・・・・・・・・・・・……...一・...115

参考文献....・…・・…・…・・・……・・・………・・・一....………・…...一・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・...118

謝 辞...128

緒 昌

農 耕 の 歴 史 は 、 病 虫 害 と の 戦 い の 歴 史 で あ る と い っ て も 過言 で は な い 。 人 類 は 、 有 史 以 来 、 食 料 の 安 定 的 な 確 保 を 目 指 し て 、 実 り の 少 な い 野 性 種 に 改 良 を 加 え 、 生 産 性 の 高 い 栽 培 種 を 人 工 的 に 作 出 し て き た 。 し か し な が ら 、 こ の よ う に 野 性 種 か ら か け 離 れ た 品 種 を 作 出 し 、 人 為 的 エ ネ ル ギ ー を 費 や す こ とで維持してきた"mono culture"は 、 時 と し て 異 常 気 象 を は じ め と す る 自 然 の 摂 理 の 前 で は も ろ く も 崩 れ 、 人 類 の 生 命 を 脅 か し て き た こ と は 飢 鑓 の 歴 史 が 物 語 っ て い る 。 自 然 生 態 系 に お い て は 、 多 種 多 様 の 生 物 が一 定の 相 互 関 係 の も と に 共 存 し 、 微 妙 な バ ラ ン ス を 保 っ て い る も の と 考 え ら れ る 。 し か し 、 農 業 に お い て は 、 自 然 生 態 系 に み ら れ る よ う な 微 妙 な バ ラ ン ス が 保 た れ て お ら ず 、 生 態 学 的 に 不 安 定 で あ り 、 気 象 条 件 な ど 環 境 の 変 化 に 対 す る 緩 衝 能 が 低 下しており、病害(虫)の大発生を招きやすい状態にあるものと推測される。こ れは、自然状態への回帰とも考えられる。

昨 今 の バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 進 歩 に よ っ て 、 抵 抗 性 を 有 す る 植 物 種 を 効 率 的 に 作 出 す る こ と が 可 能 と な り つ つ あ る が 、 植 物 の 生 理 や 病 気 の 原 理 の 解 明 な く し て は 改 変 の タ ー ゲ ッ ト を 絞 り き れ な い で あ ろ う 。 ま た 、 あ る 種 の 病 気 に 強 い 品 種 が 開 発 で き て も 、 別 の 病 原 菌 の 発 生 に よ っ て 耐 病 性 が 崩 れ さ れ る と い う 従 来 の 交 雑 育 種 に お い て も 問 題 で あ っ た い わ ゆ るbreak‑downが 起 こ る に は そ う 長 い 歳 月 を 必 要 と し な い か も し れ な い 。 一方 、 病 原 菌 や 病 害 虫 に 対 して高い防除効果を有する様々な殺菌(虫)剤が開発されてきたが、これとても 耐 性 を 有 す る 菌 や 虫 の 出 現 に よ っ て 効 力 が 低 下 し 、 さ ら に 強 い 効 果 を 有 す る 農 薬 の 開 発 が 避 け ら れ な く な る 状 況 も 生 ま れ て い る 。 言 う ま で も な く 、 殺 作 用 の 高 い 農 薬 の 使 用 は 人 々 の 健 康 を 損 な う 恐 れ が あ り 、 戦 後 、 農 薬 に 依 存 し た 農 業 に 対 す る 反 省 か ら 低 農 薬 ・ 有 機 栽 培 が 見 直 さ れ て き て お り 、 そ の た め に も 植 物 の 病 気 の 原 理 に 基 づ い た 安 全 か つ 効 果 的 な 防 除 方 法 の 開 発 が 望 ま れ ているのが現状であろう。

「 植 物 は な ぜ 病 気 に ， 躍 る の か 」 を 考 え る 上 で 、 植 物 と 病 原 菌 と の 特 異 性 決 定 機 構 の 解 明 は 避 け て 通 れ な い 課 題 で あ る 。 地 球 上 に は 約 10万種の糸状菌、

約1600種 の 細 菌 が 生 存 す る と い わ れ て い る が 、 こ れ ら の う ち で 植 物 を 加 害 す る も の は 、 糸 状 菌 が 約8000種 、 細 菌 が 約200種とされている(奥 1988)。 し か し、 l種 あ る い は 1品 種 の 植 物 を 加 害 す る の は 高 々 数 十 種 程 度 で あ り 、 さ ら

に 重 要 病 原 菌 と な る と 10指 に も 満 た な い 。 こ の こ と は 、 植 物 は 大 方 の 病 原 微 生物 に 対 し て 抵 抗 性 で あ る こ と 、 換言す れ ば 、 病 原 菌 は 特 定 の 植 物 に 寄生性

を 獲 得 し た 特 殊 な 微 生 物 で あ る こ と を 如 実 に 物 語 っ て い る 。

植 物 の 抵 抗 性 は 、 植 物 体 表 面 の 物 理 的 強 度 や 常 在 す る 抗 菌 性 物 質 な ど に よ る 静 的 抵 抗 性 の 他 に 、 病 原 菌 の 感 染 を 認 識 し て 能 動 的 に 起 こ す 形 態 変 化 や 生 理 変 化 な ど に よ る 動 的 抵 抗 性 と に 大 別 さ れ ( 奥 1988)、 後 者 は 植 物 の 抵 抗 性 に と っ て よ り 重 要 で あ る と さ れ て い る 。 一 方 、 病 原 菌 は 、 植 物 が 本 来 備 え て い る 様 々 な 抵 抗 性 を 乗 り 越 え て 感 染 を 可 能 に す る 特 殊 な 微 生 物 で あ る と 考 え ら れる。 Gaumann(1951)が 提 唱 し た 病 原 菌 と し て の 適 応 条 件 を 、 Oku(1980)は以 下の

3

点にまとめている(奥 1988， 白 石 & 奥 1992)。

1)植 物 に 侵 入 す る 能 力 : 創 傷 部 侵 入 、 自 然 関 口 部 侵 入 、 角 皮 侵 入 な ど 2)宿 主 の 抵 抗 性 に 打 ち 勝 つ 能 力 : 宿 主 特 異 的 毒 素 、 サ プ レ ッ サ ー な ど 3)宿 主 を 加害す る 能 力 : 特 異 的 ・ 非 特 異 的 毒 素 、 細 胞 壁 分 解 酵 素 な ど このような"植物が示す抵抗反応"、および、"病原菌による抵抗反応の抑制"の 実 体 が 解 明 さ れ た あ か つ き に は 、 病 害 防 除 の た め の 新 し い 視 点 や バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー に よ る 植 物 改 変 の タ ー ゲ ッ ト を 提 案 で き る で あ ろ う 。 こ の 結 果 と し て 、 よ り 安 全 な 農 産 物 を よ り 効 率 的 に 生 産 で き る こ と は い う ま で も な い 。

本 論 文 に お い て は 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 に よ る 宿 主 エ ン ド ウ の 抵 抗 反 応 を 抑 制 す る 仕 組 み に つ い て の 解 明 を 試 み た 。 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 に 関 し て は 、 以 前 の 研 究 か ら 、 褐 紋 病 菌 胞 子 発 芽 液 中 に 、 エ ン ド ウ の 抵 抗 反 応 を 誘 導 す る 引 き 金 と な る 物 質 " エ リ シ タ ー(elicitor)"と と も 抵 抗 反 応 を 抑 制 す る 物 質 " サ プ レ ツ サー(suppressor)"の 存 在 す る こ と が 明 ら か と な っ て い る(Oku et  al.  1977，  Shiraishi et al.  1978b)。 そ の 後 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 以 外 の 植 物 病 原 菌 に 関 し て

も 、 サ プ レ ッ サ ー 活 性 を 示 す 物 質 の 存 在 が 報 告 さ れ (Doke 1975， Heath 1981，  Kessman & Barz 1986， Ziegler & Pontzen 1982， Oku et al.  1987， Storti et al.  1988， Kodama et al.  1989)、 サ プ レ ッ サ ー が 病 原 性 決 定 因 子 と し て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る も の と 考 え ら れ る よ う に な っ た(Shiraishiet  al.  1991b)。 病 原 性 決 定 因 子 と し て は 宿 主 特 異 的 毒 素(HST)が 知 ら れ て い る が 、 HST生 産 菌 は Alternaria属 菌 と Helm in th os pori um属菌(この他にはPhyllostictamaydisのみ)に 限 ら れ て い る こ と か ら 、 大 多 数 の 植 物 病 原 菌 の 宿 主 特 異 性 決 定 に は サ プ レ ツ サ ー が 関 与 し て い る も の と 考 え ら れ て い る 。 し か し 、 1970年 代 後 半 か ら 現 在

ま で そ れ ら の 構 造 や 作 用 の 詳 細 は 不 明 で あ っ た 。

エ ン ド ウ に 対 す る サ プ レ ッ サ ー の 生 理 的 作 用 と し て は 、 1)動 的 抵 抗 反 応 の

‑2‑

中 心 で あ る フ ァ イ ト ア レ キ シ ン の 蓄 積 抑 制 効 果(Oku et al.  1977)、2)エンドウ 原 形 質 膜ATPase活 性 の 阻 害 効 果(Yoshiokaet al.  1990， Shiraishi et al.  1991a)、 3)エンドウ組織の局部的権病化(受容化;本来感染できない非親和性菌の感染が 可能となる)の誘導作用(Oku et al.  1980)が 既 に 判 明 し て い る 。 さ ら に 、 フ ァ イ ト ア レ キ シ ン の 蓄 積 阻 害 に 関 し て は 、 エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン ( ピ サ チ ン ) 生 合 成 系 の 鍵 酵 素 と さ れ る フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン ア ン モ ニ ア リ ア ー ゼ (PAL)お よ び カ ル コ ン 合 成 酵 素(CHS)の 遺 伝 子 発 現 が 、 サ プ レ ッ サ ー に よ っ て 遅 延 す る こ と が 明 ら か に さ れ て い る(Yamada let  al.  1989， Yoshioka  et  al.  1990)。 こ の よ う に 、 サ プ レ ッ サ ー は エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 の 病 原 性 を 決 定 す る 因 子 と し て 中 心 的 な 役 割 を 果 た し て い る(Shirais hi  et al.  1991 b)と い う 生 理 学 的 証 拠 が 蓄 積 し て き た に も か か わ ら ず 、 他 の サ プ レ ッ サ ー と 同 様 に そ の 化 学 構 造 や エ ン ド ウ 細 胞 中 の 標 的 分 子 に 対 す る 作 用 機 作 の 詳 細 は 不 明 で あ っ た 。

本 論 文 に お い て は 、 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 単 離 精 製 と そ の 化 学 構 造 の 決 定 ( 第 1章 ) 、 精 製 サ プ レ ッ サ ー の 生 理 活 性 お よ び サ プ レ ッ サ ー と し て の 活 性 を 有 す る 化 学 構 造 の 特 定 ( 第 2章 、 第 3章 、 第 4章 ) 、 サ プ レ ッ サ ー の 第 一 次 作 用 点 と 予 測 さ れ て い る エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPaseの遺伝子解析(第 5章) に つ い て 述 べ 、 得 ら れ た 知 見 を 第 6章において総合的に考察した。

な お 、 本 論 文 作 成 に あ た り 、 終 始 御 指 導 ・ 御 援 助 頂 い た 岡 山 大 学 農 学 部 奥 八 郎 名 誉 教 授 、 白 石 友 紀 教 授 、 山 田 哲 治 教 授 、 一 瀬 勇 規 助 教 授 を は じ め 植 物 病 学 研 究 室 お よ び 応 用 遺 伝 子 工 学 研 究 室 の 学 生 諸 氏 、 ま た 、 サ プ レ ツ サ ーの精製と NMRに よ る 構 造 解 析 に 関 し て 絶 大 な 御 援 助 を 賜 っ た 新 日 本 製 織 株 式 合 社 先 端 技 術 研 究 所 解 析 科 学 研 究 部 斎 藤 公 児 主 任 研 究 員 お よ びCTCラボ ラ ト リ ー ズ 株 式 会 社 田 中 昌 子 リ ー ダ 一 、 さ ら に 、 本 研 究 の 機 会 を 作 っ て 頂 い た 新 日 本 製 銭 株 式 曾 社 技 術 開 発 本 部 技 術 開 発 企 画 部 ラ イ フ サ イ エ ン ス 企 画 グ ル ー プ 藤 武 義 秀 部 長 お よ び 同 社 先 端 技 術 研 究 所 ラ イ フ サ イ エ ン ス 研 究 セ ンター 田原 誠 主 任 研 究 員 に 、 厚 く 御 礼 申 し 上 げ る 。

‑3 ‑

第

1 章

エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 精 製 お よ び 構 造 解 析

植 物 は 、 様 々 な 病 原 菌 か ら 身 を 守 る た め に 種 々 の 防 御 機 構 を 備 え て い る (Ouchi  1991)。 微 生 物 の 攻 撃 に よ っ て 植 物 体 内 に は フ ァ イ ト ア レ キ シ ン ( 微生 物 の 攻 撃 を 受 け 植 物 が 生 産 す る 低 分 子 の 抗 菌 物 質 ) や P R蛋 白 質(Pathogenesis‑ related  protein)、 リ グ ニ ン を は じ め と す る 多 数 の 化 学 的 、 物 理 的 障 壁 が 形 成 さ

れ る 。 植 物 の 防 御 反 応 を 誘 導 す る 物 質 は 、 " エ リ シ タ ー " と 呼 ば れ(review; 

Darvill & Albersheim 1984)、 菌 の 培 養 ろ 液(deWit 1986)や 胞 子 発 芽 液(Okuet  al.  1977， Shiraishi et  a1.  1978b)中 に 見 い 出 さ れ て い る 。 数 種 の エ リ シ タ ー は 、 単 離 ・ 精 製 さ れ 、 そ の 化 学 構 造 が 決 定 さ れ て い る(Colemanet a1.  1992， de Wit 

& Kadde 1981， Farmer & Helgeson  1987， Parker et  al.  1991， Sharp et  al.  1984， Toppan & Esquerre四日gaye1984)。 一 方 、 病 原 菌 は 、 エ リ シ タ ー に よ っ て 誘 導 さ れ る 宿 主 植 物 の 防 御 反 応 を 抑 制 す る 能 力 を 備 え て い る こ と が 次 第 に 明 ら か と な っ て き た 。 宿 主 植 物 の 抵 抗 反 応 の 起 動 を 抑 制 あ る い は 遅 延 さ せ る 物 質 は " サ プ レ ッ サ ー " と 呼 ば れ 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌(Okuet al.  1977， Shiraishi  eta1.  1978b)の他、 Table1^・1に 掲 げ た 数 種 の 植 物 病 原 菌 の 培 養 ろ 液 あ る い は 胞 子 発 芽 液 中 に 見 い 出 さ れ て い る(Doke 1975， lIeath  1981， Kessman  & Barz  1986， Ziegler & Pontzen 1982， Oku et al.  1987， S torti et a1.  1988， Kodama et  al.  1989)。しかし、 Table 1‑1に 示 し た よ う に 、 サ プ レ ッ サ ー の 多 く は 水 溶 性 の 糖 あ る い は 糖 ペ プ チ ド で あ り 、 現 在 ま で い ず れ も 単 離 精 製 さ ら に 化 学 構 造 決 定 に は 至 っ て い な か っ た 。 本 章 に お い て は 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 Mycosphaerella  pinodesが 産 生 す る サ プ レ ッ サ ー 2種 類 を 単 離 精 製 し 、 そ れ ら

の 化 学 構 造 を 解 析 し た 経 緯 と 結 果 に つ い て 述 べ る 。

第 1節 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 精 製

精 製 の 手1)頂をFig.l‑1に 示 し 、 以 下 に そ の 詳 細 を 述 べ る 。

第 1項 胞 子 発 芽 液 の 調 製

エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌Mycosphaerella pinodes 

0 

M 

P 

1株(ATCC42741， IFO‑

30342)をCzapek培地に植種し、 20tにて 6日 間 培 養 し て 、 形 成 さ れ た 胞 子 を 回 収 し た 。 得 ら れ た 胞 子 を 1mlあたり 1‑‑‑‑2 x 1 0⁶胞 子 と な る よ う に 滅 菌 水 に

‑4‑

T a b l e   1 ‑ 1 .   L i s t   o f   phytopathogenic  f u n g i   producing  suppressors  f o r   p l a n t   d e f e n s e  r e a c t i o n  

Pa

^位logenic

f u n g u s   Co

m"戸 煽tion

Hostp 1 a n t  R

^怠ferモnces Phytophthora infestαns  Glucan， Phosphoglucan  Potato  Doke (1975)  Mycosphaerellαpinodes  G lycopeptide  Pea  Oku et al. (1977) 

tノE

Uromyces phαseoli var. typicα  ^?  Bean  Heath (1981)  Phytophthora megaspermαf.sp. glycinea  Mannan‑glycoprotein  Soybean  Ziegler & Pontzen (1982)  Ascochytαrαbiei  Glycoprotein  Chickpea  Kessman & Barz (1986)  Mycosphaerella ligulicola  Glycopeptide?  Chrysanthemum  Oku et al. (1987)  Mycosphαerellαmelonis  Glycopeptide?  Cucumber  Oku et al. (1987)  Phytophthora infestαns  ^?  Tomato  Storti et al. (1988)  Botrytis sp.  Peptide+?  Onion  Kodama et al. (1989) 

Modified from Shiraishi & 

O k u ( 1 9 9 2 ) .  

preg?pycnospomofMpmω  Suspend t h e  spores i n  s t e r i l i z e d  w ' a t e r  

and shake f o r  20h a t  20

⁰

C 

認~

Ultra~iltrate

through M i l l i p o r e  

PTG(~142(MW.1

0000 c u t )  

Low M W   f r .   ( <   10 ， 000) 

寄与

High M W   f r 七 : : : t E I  i c i t o r  f r a c t i o n l   ( >   10 ， 000)  ・ ‑ r

^{4 1}

GFC [Toyopearl HW40F] 

ressor f r a c t i o n  

void ( 0 0 / 0 )   寄与

2 0%  MeOHaq] 

ぐ~

HPLC [ I n e r t s . i l ‑ O D S ;  H20

・

MeOHg r a d i e n t ]  

ぐ多

HPLC[HPX

・

4 : 2A;H20] 

長》

9upprescin A)  Q山一戸?~

自

Determine t h e i r  c h e m i c a l  s t r u c t u r e s   .Amino a c i d  c o m p o s i t i o n  

.Amino a c i d  s e q u e n c e s  

. 1 3 C . ， lH‑NMR 

F i g .  1 ‑ 1 .   P u r i f i c a t i o n  p r o c e d u r e  o f ル 1 .p i n o d e s

^・

s u p p r e s s o r s .

‑6 ‑

」 三 二 a 

懸濁し、 20tにて20時 間 振 壷 培 養 し て 胞 子 を 発 芽 さ せ た 。 培 養 後 、 遠 心 分 離 な い し ろ 過 に よ り 、 菌 体 を 除 去 し て 得 ら れ た 遠 心 上 清 あ る い は ろ 液 ( 胞 子 発 芽 液 と 呼 ぶ ) か ら サ プ レ ッ サ ー の 精 製 を 行 っ た 。 1fの胞子発芽液から1.5gの 乾燥物が得られた。

第 2項 サ プ レ ッ サ ー の 精 製 ( 1 ) 限 外 ろ 過

ポ ア サ イ ズ10000の ミ リ ポ アPTGC142を 用 い て 胞 子 発 芽 液 の 限 外 ろ 過 を 行 な っ た 。 高 分 子 量 画 分 は エ ン ド ウ の 動 的 抵 抗 反 応 を 誘 導 す る エ リ シ タ ー を 含 み 、 低 分 子 量 画 分 に サ プ レ ッ サ ー 活 性 が 認 め ら れ て い る(Shiraishiet a1.  1978b)。 高 分 子 量 画 分 に つ い て は 、 さ ら に 透 析 に よ り 脱 塩 を 行 な い 、 凍 結 乾 燥 後 、 脱

イ オ ン 水 に 溶 解 し 、 グ ル コ ー ス を 標 品 と し て フ ェ ノ ー ル 硫 酸 法(Dubois  et  a1.  1956， Hodge & Hofreiter  1962)で 定 量 し 、 所 定 の 濃 度 に 調 製 し て 、 褐 紋 病 菌 エ リ シ タ ー と し て 以 降 の 実 験 に 用 い た 。 一 方 、 低 分 子 園 分 は 、 凍 結 乾 燥 し 、 脱 イ オ ン 水 に 溶 解 し 、 以 下 の 精 製 に 供 し た 。 1fの 胞 子 発 芽 液 か ら 乾 燥 重 量 で 560mgの 低 分 子 量 画 分 が 得 ら れ た 。

( 2 ) ゲ ル ろ 過

限 外 ろ 過 で 得 ら れ た 低 分 子 量 画 分 を 遠 心 分 離(12，000rpm，5分間)し、上清 をToyopear1HW40Fカラム(2.5cmi. d.  x 40cm;TOSOH社製)で分画した。ピサ チ ン ( エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン ) 蓄 積 抑 制 効 果 を 指 標 と し て 、 顕 著 な サ プ レ ッ サ ー 活 性 が 認 め ら れ た 画 分 を 回 収 し た 。 1fの 胞 子 発 芽 液 よ り 乾 燥 重 量 で 170mgの サ プ レ ッ サ ー 画 分 を 得 た 。 こ の 画 分 は 、 ピ サ チ ン の 蓄 積 抑 制 だ け で な く 原 形 質 膜ATPaseを阻害する (Yoshiokaet a1.  1990)。

( 3)  SepPAK C18に よ る 分 離

さ ら に 、 サ プ レ ッ サ ー 画 分 をSep‑PAKC18カ ー ト リ ッ ジ(Waters社製)に通し、

素 通 り し た 画 分 お よ び 各 濃 度(0，10，20，40，60，80，100%(v/v))の メ タ ノ ー ル 水 で 溶 出 し た 画 分 を 各 々 回 収 し た 。 こ れ ら の ピ サ チ ン 蓄 積 と invitroに お け る エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPase活 性 に 対 す る 効 果 を 調 べ た 結 果 、 Sep‑PAK C18を素通り し た 画 分 お よ び10‑20%メ タ ノ ー ル で 溶 出 さ れ た 画 分 に は 、 顕 著 な ピ サ チ ン 蓄 積 抑 制 効 果 が 認 め ら れ た 。 一 方 、 ATPase阻害効果は、 20%メ タ ノ ー ル で 溶 出 さ れ た 画 分 に の み 認 め ら れ た 。 以 上 の 結 果 か ら 、 両 溶 出 画 分 に は 、 そ れ ぞ れ

‑7 ‑

作 用 の 異 な る サ プ レ ッ サ 一 分 子 が 存 在 す る こ と が 強 く 示 唆 さ れ た 。 両 画 分 を 各 々 のA画分、 B画 分 と し て 、 さ ら に 精 製 を 進 め た 。

(  4 

) 逆 相 カ ラ ム を 用 い た 高 速 液 体 ク ロ マ ト

A，B画 分 と も Inertsil・ODSカラム(4.6mmi.d.  x 250mm;Gasukuro  Kogyo社 製 ) を 用 い て 、 水 と メ タ ノ ー ル の グ ラ ジ ェ ン ト 法 に て 分 画 ・ 分 取 し た 。

A画 分 に つ い て は 、 4つ の 画 分 と し て 分 取 し 、 ピ サ チ ン 蓄 積 お よ び 、ATPase 活 性 に 及 ぼ す 効 果 を 調 べ た 結 果 、 い ず れ の 画 分 も ピ サ チ ン 蓄 積 を 抑 制 す る 効 果 を 有 し て い た が 、 分 取 前 のA画 分 と 同 様 にATPase活 性 に 対 す る 阻 害 効 果 は 認 め ら れ な か っ た 。 こ の う ち 、 最 も メ ジ ャ ー な ピ ー ク を 含 む 画 分 は 、 胞 子 発 芽 液 1fか ら 乾 燥 重 量 で2.2mg得られたので、 Supprescin Aと 命 名 し て 化 学 構 造 の 決 定 に 供 し た 。

一方、 B画 分 に つ い て は 上 述 のODSカ ラ ム で は 数 種 の 物 質 の 混 在 が 見 ら れ た も の の ほ と ん ど が ボ イ ド に 溶 出 さ れ た の で 、 イ オ ン 配 位 子 カ ラ ム を 用 い て 精 製を試みた。

( 5 ) イ オ ン 配 位 子 カ ラ ム を 用 い た 高 速 液 体 ク ロ マ ト

HPX‑42Aカラム(7.8mmi. d.  x 300mm;Biorad社 製 ) を 用 い て 、 水 を 移 動 相 と して80tで分離し、 5分 画 を 分 取 し(Fig.1‑2(a))、 エ ン ド ウ 原 形 質 膜ATPase活 性 に 対 す る 阻 害 効 果 を 調 べ た と こ ろ 、 Fig.1^・2(b)に 示 し た よ う に 、 程 度 に 違 い は あ る も の の 5つ の 分 画 す べ て でATPase活 性 阻 害 効 果 が 認 め ら れ た 。 B 1画 分は1.8mgの 乾 燥 標 品 を 得 る こ と が で き た が 、 そ の 他 の 分 画 は 構 造 解 析 に 必 要 な量を確保できなかったので、その後の解析は.、 B1分画(以下、 Supprescin  Bと 呼 ぶ ) に つ い て の み 実 施 し た 。

第 2節 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 構 造 解 析

S hirais hi  et  a1. (1978)は 、 薄 層 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て 純 化 し た サ プ レ ッ サ ー が ニ ン ヒ ド リ ン 反 応 陽 性 で あ る こ と や 、 ま た 、 Okuet a1.(1980)はpronaseや proteinase  K処 理 に よ り サ プ レ ッ サ ー 活 性 が 失 活 す る こ と を 報 告 し て お り 、 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の 活 性 発 現 に は ペ プ チ ド 鎖 が 必 要 で あ る こ と は 既 に 判 明 し て い た 。 さ ら に 、 当 研 究 室 に お い て 、 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー は 糖 を 含 む 化 合 物 で あ る と の 予 備 的 な 実 験 結 果 も 得 て い た 。

‑8 ‑

三了一一一一一~ -

( a )  

210nm 

‑ ‑256nm  F r . 8 5  

F r . 8 4   F r . 8 1  

‑ー弘.e3 F r . 8 3  

︒ υ

c c D

﹄

O

ω D

︽

炉

25 

10  15  20 

R e t e n t i o n  t i m e  

。

5 

n  m 

︑ ︐

''F '

L υ  

/' EK  

︑ ︑

A︑ .

︑ ︑

︑.. ︑

︑ ︑ ︑

︑ ︑ ︑

i︐ ︑

︑ 口 ︑

ー

︑ ︑ .

︑ ︑

︑ ︑..

︑   ︑

︑ ︑

︑ ︑

. ‑ Fr. B1 

‑‑0‑ Fr. B2 

‑ ‑ Fr. B3 

‑‑‑0‑‑‑Fr. B4 

一一企一‑ Fr. BS 

110  100 

90  80 

60  70  (3

bZ 00

﹄O

WC Bh oJ_小)

K A Z

﹀Z

06 0ω ca ト︽

O﹀ 一

MC

一ω匡

50 

.01  1000 

F i g .  1 ‑ 2 .   S e p a r a t i o n  o f  t h e   f r a c t i o n   B by HPX

・

42A‑HPLC(a) and t h e  e f f e c t  o f  f r a c t i o n s  on t h e  plasma  mem  brane A  TPase a c t i v i t y ( b ) .  

100  (ド~~

/  ml ，  w / v )  

10 

1 

C o n c e n t r a t i o n  

.1 

‑9 ‑

Supprescin  Aお よ びBと も 、 精 製 の 際 の 高 速 液 ク ロ(HPLC)で は 紫 外 部 吸 光 の 他 に 屈 折 率(RI)検 出 器 を 用 い た モ ニ タ リ ン グ も 行 っ た 結 果 、 210nm吸 光 度 と RIの ピ ー ク が 一 致 す る こ と か ら 、 2種 の サ プ レ ッ サ ー は と も に 糖 ペ プ チ ド で

あ る も の と 予 想 さ れ た 。 こ れ は 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー が ニ ン ヒ ド リ ン 反 応 お よ び 糖 反 応 と も に 陽 性 で あ る と す る 上 述 の 報 告 と 一致 す る 見 解 で あ る 。 そ こ で 、 ま ず 、 糖 お よ び ア ミ ノ 酸 の 組 成 分 析 、 ア ミ ノ 酸 配 列 解 析 を 行 い 、 つ い で 、 核 磁 気 共 鳴 (NMR) に よ る 構 造 解 析 を 実 施 し た 。 NMRに よ る 構 造 解 析 は 、 新 日 銭 ( 株 ) 斎 藤 公 児 主 任 研 究 員 の 御 助 力 の も と に 実 施 し た 。

第 1項 ア ミ ノ 酸 の 組 成 分 析

Supprescin  A， Bと も 、 ま ず 、 ス ミ ス 分 解(Abdel‑Akheret  al.  1952， Smith & 

Van‑Cleve  1955)に よ っ て 糖 と ペ プ チ ド 鎖 と に 分 解 し た 。 す な わ ち 、 O.IM 酢 酸緩衝液、 O.25M 過 ヨ ウ 素 酸 ナ ト リ ウ ム に 溶 解 し 、 遮 光 条 件 で4t，24時 間 反 応 さ せ 、 さ ら に 過 剰 の 亜 ヒ 酸 ナ ト リ ウ ム を 添 加 し 、 水 素 化 ホ ウ 素 ナ ト リ ウ ム 存 在 下 で4t，24時 間 還 元 反 応 を 実 施 し 、 酢 酸 で 反 応 、 を 停 止 し て 、 脱 塩 後 、 凍 結乾燥した。

アミノ酸の同定は、 Supprescin A， Bと も ス ミ ス 分 解 物 を 6N  HCl存 在 下 で 110⁰C・24時 間 加 水 分 解 し た 後 に 、 目 立 社 製 ア ミ ノ 酸 ア ナ ラ イ ザ ー(model L‑

8500)により実施した。

分 析 結 果 をTable 1‑2に示した。 Supprescin Bでは 5種 類 の ア ミ ノ 酸 、 す な わちAsp， G 1 u， G 1 y， T h r， S erが観察され、 Serの み が2当 量 存 在 す る と の 結 果 を 得た。一方、 Supprescin Aでは、 SerとGlyの2種 類 の ア ミ ノ 酸 が2:1の 組 成 で 含むことが判った。 Okuら(1980)は 、 エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー の ひ と つ

F 

5の ア ミ ノ 酸 組 成 に 関 し てAsp:Gly :Ser= 1: 1:2と報告しており、 Sup pres cin  Bとの関連が伺えた。

第 2項 糖 の 組 成 分 析

糖 の 同 定 は 、 ア ミ ノ 酸 の 場 合 と 同 様 に 、 両 化 合 物 と も ス ミ ス 分 解 物 を lN HClにて加水分解した後に、 Lichrosorb‑NH2カラム(4mm i.d.  x  250mm  Waters社 製 ) を 用 い て 、 ア セ ト ニ ト リ ル .15mM  リ ン 酸 緩 衝 液 (80:20(V/V)) 

を 溶 媒 系 と し たHPLCにて、分析した。

Supprescin A に つ い て は GalNAc [N ‑acetyl galactosamine]の ピ ー ク の み 検 出された。一方、 Supprescin  Bの 分 析 結 果 はTable 1‑3に示すように、 Gal

‑10‑

に 一 一

併‑‑' 併・・・4

Table  1

・

2 . Amino a c i d   compositions  o f  t h e   S l l p p r e s c i n   A and B  p l l r i f i e d   from  t h e  germination f l l l i d   o f  pycnospores o f  a  pea pathogen ，  Mycosphaerella pinodes 

Supprescin A  Supprescin  B  Amino a c i d  

nmol  Ratio(X/Gly)  nmol  Ratio(X/Gly)  A s p a r t i c   a c i d   N D   0.000  1.257  0.963 

Glutamic a c i d   N D   0.000  1.239  0.949 

Glycine  1.927  1.000  1.305  1.000 

Serine  3.904  2.026  2.625  2 . 0 1 1  

Threonine  N D   0.000  1.378  1.056 

Suppressors were hydrolyzed i n   a s o l u t i o n   o f  6N HCl  a t   110

⁰

C f o r  24 h ，  and t h e n  t h e  

amounts o f  amino a c i d s  i n   t h e   h y d r o l y s a t e s  were d e t e r m i n e d .  ND: no   . t d e t e c t e d .  

←4 

N 

T a b l e   1 ‑ 3 .   Sugar  compositions  o f   t l l e   Supprescin  B p u r i f i e d   from t h e   germination  f l u i d   o f   pycnospores  o f   a pea  pathogen ， 

Mycosph α e r e l l a   pinodes 

Sugars  Retention  time 

Area  Ratio 

(min)  (X/Ga!) 

Gal  8 . 5 5   15970021  ( 1 . 0 0 )  

GalNAc‑OH  6 . 9 3   16433564  1 . 0 3  

[Galactose]とGalNAcが1:1の組成比で検出された。

第

3

項 ア ミ ノ 酸 配 列 の 解 析

ABI社 製 ペ プ チ ド シ ー ケ ン サ ー(model477 A)により実施した。

Supprescin  Bに つ い て は そ の ア ミ ノ 酸 配 列 を Ser‑Ser‑Gly‑Asp‑G lu‑Thrと決 定できたが、 Supprescin Aに つ い て は ア ミ ノ 酸 配 列 を 決 定 で き な か っ た 。 こ れ はSupprescinAの 分 子 が 非 常 に 小 さ い こ と を 意 味 し て お り 、 ア ミ ノ 酸 組 成 分 析 の結果を考慮して、 Supprescin AとSupprescin Bと が 類 似 し て い る と 仮 定 す る

と、 S u ppres cin  Aの ペ プ チ ド 部 分 はSer‑Ser‑Glyと い う ア ミ ノ 酸 配 列 を 持 つ こ とが予想された。

第

4

項 核 磁 気 共 鳴 に よ る 構 造 解 析

糖 ペ プ チ ド で あ る 2つのSupprescinの ア ミ ノ 酸 配 列 、 糖 鎖 の 結 合 な ど の 化 学 構 造 を 確 定 す る た め に 核 磁 気 共 鳴 (NMR) による分析を実施した。

( 1 ) 核 磁 気 共 鳴 法(NMR)に よ る 構 造 解 析 の 方 法

NMRの 測 定 は 、 高 精 度 温 度 制 御 装 置 お よ び 低 温 空 気 供 給 装 置 を 付 設 し た 日 本 電 子 社 製 α‑400，EX‑400ス ペ ク ト ロ メ ー タ ー を 用 い た 。 測 定 温 度 は24.0tと

し、 lHの 測 定 は400.05MHzでH5プロープを、 13Cの 測 定 は 100.50MHzでTH5 プロープを使用した。

実施した測定手法は、 Ernst著"Principles of  NMR  in  one  and  two  dimensions" (1987)を 参 考 書 と し て 、 以 下 の よ う に 実 施 し た 。

1)ス ピ ン の 帰 属 に つ い て : lH:  一次元、

Absolute and Phase‑sensitive DQF‑COSY、 Relayed‑COSY、

Absolute and Phase‑sensitive HOHJlliA(重水、軽水)、

13C:一次元、

C‑HCOSY

、

COLOC、

2)立 体 構 造 情 報 に つ い て : lH:  一次元差NOE、

Absolute and Phase‑sensitive NOES Y(重水、軽水)、

‑13 ‑

一 十 三 て二. ー い 一 一 』

13C:  lHデカップリング、

lHノンデカップリング、

選 択 的lHノンデカップリング、

3)そ の 他 :

必 要 に 応 じ て 、 デ カ ッ プ リ ン グ 実 験 を 実 施 、 ま た 、 重 水 あ る い は 軽 水 の 吸 収はHMG法 お よ びDANTEパ ル ス に よ る pres atUl rate d法 を 使 用 し た 。 測 定 試 料 は、 pH5.0に 調 整 し た 重 水 な い し 軽 水 の リ ン 酸 緩 衝 液 を 溶 媒 と し 、 5mM程 度 の濃度に調整した。

以 下 の 測 定 条 件 に てNMRス ペ ク ト ル を 計 測 し 、 日 本 電 子 社 製 の オ リ ジ ナ ル ソ フ ト ウ ェ ア を 活 用 し て ス ペ ク ト ル の 処 理 を 実 施 し 、 必 要 に 応 じ て ド リ フ ト コレクションや位相補正を実施した。

l)lH一次元NMRス ペ ク ト ル の 測 定 :

積 算32‑128因 。 ス ペ ク ト ル 幅8000Hz。 デ ー タ ポ イ ン ト 32K。 delay time 4sec

。

2)lH二次元NMRス ペ ク ト ル の 測 定 :

積 算16ないし32回 。 デ ー タ サ イ ズF2=1024，F1 =5120 ゼロフイリ ング後1K X 1 Ko sinesquereによるフーリエ変換。

NOESYについては、 mixing^・timeを100‑800msecま で 検 討 し 、 ス ピ ン 拡 散 の 影 響 を 検 討 し て 最 適 値 を500msecと 決 定 。 ス ペ ク ト ル 幅4500Hzodelay  tlme  3sec 。ゼロフイリング後~lKX 1K。 gausiaanによるフーリエ変換。

3)13C一次元NMRス ペ ク ト ル :

積 算1000‑4000因 。 デ ー タ ポ イ ン ト 32K。 ス ペ ク ト ル 帽4000Hz。 delay time 3. 8sec。

INEPTな ど に つ い て は 、 積 算10000‑40000回、 delay time  5secで 実施した。

4)13C̲1H二次元NMRス ペ ク ト ル :

積 算512因 。 デ ー タ サ イ ズF2=512，F1=512。 ゼ ロ フ イ リ ン グ 後1K X 1Ko exponentialによるフーリエ変換。

COLOCについては、 J値を 3.5.8Hzに 設 定 し て 、 そ れ ぞ れ 測 定 し た 。 ス ペ ク ト ル 幅4000Hzodelay tiJme 4s ec。

‑14‑

一〕山一… 』

(2) Supprescin Aの 構 造 解 析

Supprescin  Aは、 加水分解 後 のアミノ酸分析などの結果から、 Ser， Gly，  GalNAcを 有 し て い る こ と が 判 明 し て い る 。過去の研 究 例 か ら 、 糖 で あ る GalN AcはSerないしThrと 結 合 し て ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド を 形 成 す る か 、 ある

いは、 Asnと 結 合 し て 複 合 型 の 糖 ペ プ チ ド を 形 成 す る か の い ず れ かであること が示されている(三崎ら 1976，Vligethurt et  a1.  1983)0 Supprescin Aについて は、 Table 1^・2で 示 し た よ う にAsnが 認 め ら れ な か っ た ことからSerと結 合 し た ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド で あ る 可 能 性 が 高 い 。 SupprescinAの ペ プ チ ド 部分のア ミ ノ 酸 配 列 を プ ロ テ イ ン ・ シ ー ケ ン サ ー で 決 定 す る こ と が で き な か ったので、 lH̲，¹³C̲NMRス ペ ク ト ル で 検 出 さ れ た す べ て の 吸 収 を二次 元手法 な ど を 用 い て 解 析 し 、 さ ら に ペ プ チ ド 結 合 し て い る ア ミ ド 水 素 と カ ルポ ニル 炭素の帰 属を COLOC法を用いて決定した。

Fig.1^・3に一次 構 造 決 定 の 論 拠 と な っ た^lH̲，13IC‑NMRス ペ ク ト ル を 例示し、

解 析 結 果 をTable1‑4に示した。

(3)  Supprescin Bの 構 造 解 析

Supprescin Bは 、 加 水 分 解 後 の ア ミ ノ 酸 お よ び 糖 分 析 の 結 果 か ら 、Ser，Gly，  Asp，Glu， Thrお よ びGalNAc，Galの 含 ん で い る こ と が 判 明 し て い る(Table1‑2，3)。 前 述 の よ う に 、 糖 で あ るGalNAc はSerないしThrと 結 合 し て ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド を 形 成 す る か 、 あ る い はAsnと 結 合 し て 複 合 型 の 糖 ペ プ チ ド を 形 成 す る か のいずれである(三崎ら 1976，Vligethurt et al.  1983)。 し か し 、 複 合 型 の 糖 ペ プチドの場合、 GalNAc以 外 の 糖 、 例 え ばGlcN)~c や Man が存在するはずである

が、 Su ppres cin Bに お い て は こ れ ら の 存 在 は 認 め ら れ な か っ た。ま た 、 ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド はSer‑X‑Asp‑X‑Thrと い う ア ミ ノ 酸 配 列 を 有 す る こ と が 多 く 報 告されており (Oppenheimeret  a1.  1989)、SupprescinB はSSGDETのア ミノ酸 配 列 を 有 し て い た こ と か ら も 、 SerないしThrと

0‑

グ リ コ シ ド 結 合 し た ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド で あ る 可 能 性 が 強 く 示 唆 さ れ た 。

Supprescin  Bに つ い て は 、 先 のSupprescin Bと同様にNMRス ペ ク ト ル に お いて、 lH̲，¹³C̲NMRス ペ ク ト ル で 検 出 さ れ た す べ て の 吸 収 を二次 元手法 な ど で 解 析 し 、 さ ら に ペ プ チ ド 結 合 し て い る ア ミ ド 水 素 と カ ル ポ ニ ル 炭 素 の 帰 属 を COLOC法 で 決 定 し た 。 ま た 、 様 々 な 立 体 構 造 情 報 は 、 NOESYス ペ ク ト ル や INEPTな ど で 得 ら れ る 結 合 定 数 の 解 析 か ら 決 定 し た 。

Fig.1‑4に一次 構 造 決 定 の 論 拠 と な っ たlH̲，13C‑N M Rス ペ ク ト ル を 例 示 し 解 析 結 果 をTable1‑5に示した。

‑15 ‑

」 ^{一 一 一} J

.φN22司王

∞ど︽白色ロ∞ち ω

g

ωω ロお 仏∞出明白

ZE

.(mw)mE}[

国同

ω ・

一凶

(Ea

N  仏)

lt) 

.φN

︽回口一司王 ω

∞ど︽凶︽山口∞ち窓口﹄￡

ωω

︽同∞出明白

‑ZEU2

(Eaa) 

o σ〉

。

守o LO 

o ω 

o r、

.(A)mE

ω

同・

一回

o αコ

o 0') 

OOF 

‑17 ‑

Table  1 ‑ 4 .   NMR  spectral parameters of Supprescin A 

α‑ GalNAc  Ser  Ser  Gly 

13 

C 

_{C1=92.1  C2=55.1}  C3=72.0  (ppm)  ^carbonyl{ppm)  175.1  175.7  174.8  C4=71.5  C5=72.5

， 

62.2 

C α  (ppm)  57.3  58.1  49.1  3 J(COCH)=5.7 (Hz) 

トー.. 

。

。

_{1 H}  

J(1

，

2)= 3.7  J(1

，

3)= 0.8  3J  (8)=  3.1  2.9  3.0  J(1

，

4)= ‑1.2  J(2

，

3)= 9.7  wα  (ppm)  3.91  3.94  3.75  J(3

，

4)= 3.6  J(4

，

5)= 0.6  w s   (ppm)  3.95

， 

3.99  3.97

， 

3.99 

J(5

，

5)= 6.4  (Hz)  N H  (ppm)  8.35  8.24  8.49  J(α

s ) 

(Hz)  4.6

， 

8.5  4.7

， 

8.4 

w2・w3=22 (Hz)  J( 

s s   ) 

(Hz)  8.3  8.1  H1=4.85  H2=4.40  H3=4.03  (ppm) 

H4=3.51  H5=4.22  H6=3.69

， 

3.63 

.φNQE ω 泊五

∞ど︽迂ロ∞﹄︒

gz'MWωω

︽凶

出削

ω

出回

J{ZE

Eaa) 

。

4

︒

Fヲ

v 

二二フ

一一 =====・・・h‑‑・E

，‑

lO 

(Eaa)m.

ω.nh. 円 円∞.円︒.円︒.守

. F

N. マ 守門.マ

‑一一一一二一一一一一一一一一一一一一一‑一一一一一一二一一一一一一一一一一一一一

.(符)寸

・

E}[

ω

戸山

I.D r、

α3 。予

‑19 ‑

(Eaa) 

.φN22

ω

筒口一

‑E む

︽山口∞

︒

h

gE

ωω 主

J‑z 仏∞出削

︐ hV2

.(兵)寸

E}[.ω

一回

O LO 

‑20 ‑

幽圃幽幽幽山田一一

ト

、2

トー4

Table 1

・

5 ( a ) NMR  s p e c t r a l  parameters o f  Supprescin B  (Sugar  p a r t )  

13 

C 

lH 

s ‑ Gal 

Cl=104.1  C4=70.1 

C2=69.9  C3=70.8  (ppm)  C5=76.1

， 

62.4 

3 J(COCH)=7.2 (Hz) 

3 J(HCOC)=7.7 (Hz) 

J(I

，

2)= 8.1  J(I

，

3)= 0.4  J(I

，

4)=・0.5 J(2

，

3)= 9.9  J(3

，

4)= 3.8  J(4

，

5)= 0.9  J(5

，

5)= 7.7

， 

3.5  (Hz)  w2・w3=29 (Hz) 

Hl=5.57  H2=3.57  H3=3.67  (ppm)  H4=4.11  H5=3.55  H6=3.73

， 

3.65 

1

^圃

>4 α‑ GalNAc 

C2=55.4  C3=72.3  (ppm)  Cl=92.3 

C4=80.1  C5=72.4

， 

62.5 

3 J(COCH)=5.0 (Hz) 

J(I

，

2)= 3.6  J(I

，

3)= 0.8  J(I

，

4)=・1.1 J(2

，

3)= 9.5  J(3

，

4)= 3.6  J(4

，

5)= 0.6  J(5

，

5)= 6.4  (Hz)  w2・w3=25(Hz) 

Hl=5.02  H2=4.35  H3=4.11  (ppm)  H4=3.06  H5=4.27  H6=3.66

， 

3.60 

Table 1

・

5 { b ) NMR  s p e c t r a l  parameters o f  Supprescin B  (amino acid p a r t )  

Ser  Ser  Gly  Asp  Glu  Thr 

13 

C 

_{￨carbonyl(ppm)  175.1  175.7  174.8  179.2  178.1  177.5} 

C 

α 

(ppm)  57.3  58.1  49.1  50.0  53.5  59.5 

トt^サJ 

lH  I 

3 

J 

_{(8)=  3.1  2.9  3.5  3.8  2.1  4.1} 

wα 

(ppm)  3.91  3.94  3.75  4.01  3.75  3.62  C γ 

ws 

^{(ppm)  3.95}

，

3.99  3.97

，

3.99  2.95

，

2.87  2.11

， 

2.01  3.97

， 

3.92  1.35 

N H  (ppm)  8.35  8.24  8.49  8.55  8.24  8.50 

J ( α ' s   ) 

(Hz)  4.6

， 

8.5  4.7

， 

8.4  4.0

， 

8.0  7.4  5.0 

J (   s s   ) 

(Hz)  8.3  8.1  16.5  Pγ8.1  6.7 

(4) Supprescinの 一 次 構 造

NMRに よ る 構 造 解 析 の 結 果 か ら 導 か れ たSUP1prescinAお よ びBの 化 学 構 造 を Fig.1・5に 示 し た 。 両Supprescinと も ペ プ チ ド 配 列 中 のSer残 基 に 糖 が

0‑

グリ コ シ ド 結 合 し て い る ム チ ン 型 の 糖 ペ プ チ ド で あ っ た 。 GalNAc‑Ser‑S er‑G 1 yの 構造を有するSupprescin  Aは、 Gal‑GalNAc‑Ser‑Ser‑Gly‑Asp‑Glu‑Thrの 構 造 を持つSupprescinBの 一 部 分 で あ る こ と が 判 明 し た 。 両 者 と も ペ プ チ ド 鎖 が 、 低 分 子 の ペ プ チ ド と し て は 非 常 に 珍 し い αヘ リ ッ ク ス 型 の 構 造 を 有 し て い た 。

(5)  Supprescinの 立 体 構 造 の 推 定

NMRに て 得 ら れ た 立 体 構 造 に 関 す る 情 報 を 基 に 、 水 溶 液 中 に お け る 両 化 合 物 の 立 体 構 造 の 推 定 を 行 な っ た 。 CTCラボラトリーズ(株)の協力で、 IRIS4D 70Gワ ー ク ス テ ー シ ョ ン に て 、 分 子 動 力 学 計 算 プ ロ グ ラ ム CHARMm(Karplus et al.  1991)を 活 用 し て 立 体 構 造 の 推 定 を 実 施 し た 。

そ の 結 果 をFig.1‑6および、Fig.1^・7に示す。 Fig.1^・6および、Fig.1^・7(a)で は 、 炭 素 原 子 を 青 色 、 酸 素 原 子 を 赤 色 で 表 現 し た ボ ー ル ス テ ィ ッ ク と し て 表 示 し た 。

また、 Fig.1‑7(b)で は 、 ス テ ィ ッ ク 表 示 し た 化 学 構 造 の 骨 格 と と も に 、 電 荷 分 布を色で表示した[赤色:正電荷、青色:負電荷、黄色;電荷なし]0NMRによる 種 々 の 解 析 に て 得 ら れ た 情 報 を 反 映 さ せ る と 、 両 化 合 物 と も ペ プ チ ド 鎖 は α

ヘ リ ッ ク ス 型 の 構 造 を と り 、 糖 鎖 と ペ プ チ ド 鎖 がV字 型 の 配 座 を 保 持 す る 特 異 な 構 造 で あ る こ と が 推 定 さ れ た 。 さ ら にSupprescinBのV字 型 部 分 に は 正 電 荷が局在しており、 N末 の ア ミ ド と と も に 糖 鎖 や ペ プ チ ド の 電 荷 がV字 型 部 分

に集中していることが推定された。

種 々 の 生 体 反 応 、 は 、 そ れ に 関 わ る 物 質 の 微 細 な 立 体 構 造 の 効 果 と エ レ ク ト ロ ス タ テ ィ ッ ク な 効 果 と の 影 響 が 支 配 的 で あ る と 考 え ら れ て お り ( 日 本 化 学 会 編 「 実 験 化 学 講 座 生 物 有 機

J

1991)、Supprescin Bで 観 察 さ れ た 特 異 な 立 体 構 造 と 電 荷 分 布 は サ プ レ ッ サ ー の 機 能 上 重 要 な 意 味 を 持 つ も の と 推 察 し た 。

第 3節 まとめ

エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 胞 子 発 芽 液 中 よ り 2種 類 の サ プ レ ッ サ ー を 精 製 し 、 世 界 に 先 駆 け て そ の 化 学 構 造 を 明 ら か に す る こ と が で き た 。 両 者 は ム チ ン 型 糖 ペ プチドであり、 GalNAc‑Q^・Ser‑Ser‑Gly(分 子 量452Da)をSupprescin  A、Gal‑

‑23‑

Ser  Ser  Gly  Asp  Glu  Thr 

Supprescin  A 

α‑GaINAc 

Ser  Ser  Gly 

Supprescin 

'NA' 

9

・Gal(1→4)

O O 

H O H  

¥ H  

匂

ii

しf

i‑

‑i

酬

C H O 一

∞ 同 均 H¥

制CICIClC

⁝ /  

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O H C /   H 均 ω

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ig i¥ 53 ii  

O H C /   H

¥  CIClO  H吋 u

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j  

C H O  

/ 

F i g . l ・ 5 . Che s1 i c a l  s t r u c t u r e s  o f  two s u p p r e s s o r s .  

F i g . l

^・

6 . The s t r u c t u r e  o f  

SUI~prescin

A i n  w a t e r .  

‑25 ‑

i g . l

・

7 ( a) .   r 

‑2(・・

.  ^{‑ 7}   . 

a t e   e  . 

‑27 ‑

GalNAc・O‑Ser‑Ser‑Gly‑Asp‑G lu‑Thr(分 子 量959Da)をSupprescin Bと命名した。

Supprescin Aの 構 造 はSupprescin Bの 構 造 の一部 分 で あ る こ と か ら 、 両 者 は 共 通 の 生 成 系 か ら 生 じ た も の と 考 え ら れ る 。

Supprescin Bの ア ミ ノ 酸 配 列 に 関 し て 、 蛋 白 配 列 デ ー タ ベ ー スNBRF‑PIRを 用 い て ホ モ ロ ジ ー 検 索 を 実 施 し た 結 果 、 完 全 一 致 す る も の は 見 い 出 せ な か っ

たが、 6残 基 中 連 続 す る5残 基 が 一 致 す る 蛋 白 は 多 数 見 い 出 さ れ た 。 例 え ば 、 ヒトのIL・1ra[Interleukin‑1 receptor  antagonis t] (Carter  et a1.  1990)、 酵 母 の SEC2蛋白(Nair et a1.  1990)お よ びSEC7蛋白(Achstetteret a1.  1988)、 エ ン 麦 の 液泡HぺATPaseの プ ロ テ オ リ ピ ド ・ サ プ ユ ニ ッ ト (Lai et al.  1991)な ど の 膜 系 に 作 用 す る 蛋 白 に 相 向 性 が み ら れ た こ と か ら 、 SupprescinBが 膜 系 に 作 用 す る 可能性が推定された。

褐 紋病菌サプレッサーには 、 Supprescin  Aお よ びB以 外 の 別 の 分 子 種 が 存 在 する(Fig.1^・2)の で 、 実 際 の 感 染 現 場 に お い て は 複 数 の サ プ レ ッ サ 一 分 子 が 相 加 あ る い は 相 乗 的 に 作 用 し て 、 よ り 強 い サ プ レ ッ サ ー と し て の 活 性 が 具 現 し ているものと推察できる。

‑28‑

← 一 一 十 ， ‑

第

2 章

エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー お よ び そ の ペ プ チ ド 断 片

の生理活性 ‑ i n  s i t u   assay‑

部 分 純 化 し た エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー に 関 し て は 、 以 下 の 様 な 知 見 が 既 に 明 ら か に さ れ て い る 。 ま ず 、 サ プ レ ッ サ ー は 、 エ リ シ タ ー に よ っ て 誘 導 さ れ る エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン ( ピ サ チ ン ) の 蓄 積 を 抑 制 あ る い は 遅 延 させる効果(Okuet al.  1977)を 有 し て お り 、 こ の 蓄 積 抑 制 は 、 ピ サ チ ン の 生 合 成 に 関 与 す る 鍵 酵 素 で あ る フ ェ ニ ル ア ラ ニ ン ア ン モ ニ ア リ ア ー ゼ(PAL)お よ び カ ル コ ン 合 成 酵 素(CHS)の 両 遺 伝 子 のde novoな 発 現 が 抑 制 さ れ た 結 果 で あ る (Yamada et  al.  1989， Yoshioka et  al.  1990)。 ま た 、 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー は 、 エ ン ド ウ に 対 し て 本 来 感 染 が で き な い 非 親 和 性 の 菌 の 感 染 を 可 能 に す る こ と

も示されており (Okuet al.  1980)、 褐 紋 病 菌 の 病 原 性 を 決 定 す る 因 子 と し て 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る こ と が 判 明 し て い る(Shiraishiet  al.  1991b)。さらに、

サ プ レ ッ サ ー は 、 エ ン ド ウ の 原 形 質 膜 のATPas^，e活 性 を 阻 害 す る こ と がin vitro  (Yoshioka et al.  1990)お よ びinsitu (Shiraishi et al.  1991a)の 実 験 で 確 か め ら れている。

さらに、 Okuet  al. (1980)は 、 褐 紋 病 菌 由 来 の 粗 サ プ レ ッ サ ー 画 分 がpronase あるいはproteinase K処 理 を 施 す と サ プ レ ッ サ ー 活 性 が 消 失 す る こ と よ り 、 サ プ レ ッ サ ー の ペ プ チ ド 部 分 が サ プ レ ッ サ ー 活 性 に と っ て 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る こ と を 報 告 し て い る 。 第 l章 で 明 ら か に し た よ う に エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プレッサーが、 GalNAc‑Ser‑Ser‑Glyおよび、Gal.‑GalNAc‑Ser‑Ser‑G ly‑Asp‑G lu‑ Thrと い う 構 造 を 有 す る 糖 ペ プ チ ド で あ っ た こ と は 、 そ れ ら の ペ プ チ ド 部 分 が サ プ レ ッ サ ー 活 性 発 現 に 重 要 で あ る こ と を 強 く 示 唆 し て い る 。

本章においては、 2種 類 の 精 製 サ プ レ ッ サ ー が 従 来 報 告 さ れ て い る 部 分 純 化 サ プ レ ッ サ ー の 生 理 活 性 を 担 っ て い る こ と を 検 証 す る と 共 に 、 サ プ レ ッ サ ー の ペ プ チ ド 部 分 だ け で 活 性 を 有 し て い る か 否 か を 明 ら か に す る た め に 、 精 製した 2種 類 の サ プ レ ッ サ ー と 、 そ の 配 列 に 基 づ い て 化 学 合 成 し た ペ プ チ ド 断片について、 insituで 活 性 を 調 べ た 結 果 に つ い て 報 告 す る 。 具 体 的 に は 、 1) エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン 蓄 積 を 抑 制 す る 効 果 、 お よ び2)エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 な い し 非 親 和 性 菌 の 感 染 促 進 の 効 果 、 さ ら に 、 3)エ ン ド ウ 組 織 のATPase 活性の阻害効果について調べた。

‑29‑

第1節 実 験 材 料 お よ び 方 法

第 1項 供 試 試 料

本 章 あ る い は 次 章 の 実 験 に 用 い た 試 料 の 一 覧 をTable2^・1に 示 し た 。 前 章 に お い て 精 製 し 、 化 学 構 造 を 決 定 し た 2種 類 の エ ン ド ウ 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー (Supprescin A and B) の ア ミ ノ 酸 配 列 に 基 づ い て 合 成 し た2‑‑6残 基 の11種 類 の ペ プ チ ド を 供 試 試 料 と し た 。 2種 の ジ ペ プ チ ド S Gお よ びG Dは、 Sigma Chemical Company (St.  Louis， M O， U.S.A.)より、 G G GはPeptideInstitute  Inc. (Osaka，  J apan)よ り 、 そ れ ぞ れ 購 入 し た 。 そ の 他 の 8種 類 の ペ プ チ ド は Fmoc固 相 合 成 法(Merrifield 1963)によって合成し、 0.05% ト リ フ ル オ ロ 酢 酸 を含む0‑‑60%の ア セ ト ニ ト リ ル 濃 度 勾 配 に よ っ て 、 Cosmosil 5C18カ ラ ム

(4.6mm i.d.  x 150mm; Nakarai Chemicals， Kyoto， Japan)を 用 い たHPLCにて 精 製 し た 。 こ れ ら の ペ プ チ ド の ア ミ ノ 酸 組 成 は ; 、 HITACHI製 ア ミ ノ 酸 ア ナ ラ イザー(modelL‑8500)に て 分 析 し 、 そ の 結 果 をTable2‑2に示した。

第 2項 ピ サ チ ン の 定 量

エ ン ド ウ の フ ァ イ ト ア レ キ シ ン で あ る ピ サ チ ン の 蓄 積 に 対 す る 各 種 ペ プ チ ドの組害効果の検定は、 Fig.2・1に示す手)1¥夏で実施した。実験では、播種後、

20‑‑22tの暗所恒温室内にて、 6‑‑9日 間 生 育 さ せ た エ ン ド ウ (Pisam sativum  L.  cv.  Midoriusui)の上脹軸を用いた。実験に先立って、上目玉軸を長さ 1.5cm

に 切 断 し 、 さ ら に 軸 方 向 に 2分 し た 。 褐 紋 病 菌 エ リ シ タ ー を 終 濃 度500μ g/ml(グ ル コ ー ス 換 算 ) に な る よ う に 添 加 し た 供 試 液50μ1に 上 述 の 上 脹 軸 切 片

を浸漬し、 22t・暗所で18時 間 静 置 後 に 蓄 積 し た ピ サ チ ン を 熱 エ タ ノ ー ル で 抽出し、減圧乾国後、下記の溶媒に溶解.し、 Matsudaet  al.(1983)の 方 法 で 以 下 の 条 件 に よ り HPLCにて定量した。

カ ラ ム LichrosorbSi100 

溶 媒 n‑Hexan:Tetrahydrofuran:Aceticacid， 88: 12:0. 5(v/v)  検 出

o

D309nm 

対 照 区 と し て 、 エ リ シ タ 一 、 エ リ シ タ ー と 褐 紋 病 菌 サ プ レ ッ サ ー 粗 函 分 (100μg/ml， BSA換 算 ) お よ び 脱 イ オ ン 水 処 理 組 織 に つ い て 同 様 の 実 験 を 行 な った。

‑30‑