学 位 論 文 の 要 旨
チオフラビン T の誘導体化および機能拡張に関する研究 (Studies on derivatization and functional expansion of thioflavin T)
氏 名 片 岡 由 佳 印
(Yuka Kataoka)
蛍光プローブは、標的分子に直接結合し、その蛍光発光変化を解析するものや、標的認識部位（抗 体などのタンパク質や核酸、リガンド分子などの有機化合物）に蛍光標識をコンジュゲート化し、
その蛍光発光を解析するものなどに大別される。これまでに、in vitroにおける標的分子の定量解析 や、細胞中やin vivoにおける標的分子の細胞内動態の定量的な観察や可視化のために、さまざまな 蛍光プローブが開発されている。しかしながら、抗体や核酸などとのコンジュゲート化をすること なく、色素だけを用いて高感度・高選択的なインジケーター（指示薬）を開発することは難しく、
未だ改善の余地があるのが現状である。
本学位論文は、アミロイド線維の高感度なインジケーターとして広く用いられるチオフラビンT
（ThT）の誘導体の創製を検討し、その機能拡張に関する研究成果をまとめたものである。ThTの N3位はジメチルアミノベンゼン環とベンゾチアゾール環の環間の回転軸であるC−C単結合の最も 近傍にあり、この部位における立体障害の度合いは、回転の自由度に大きな影響を及ぼすことが想 到される。そこで本研究では、N3位に置換基を導入することによって、ThTの結合特異性を改変す ることができるのではないかと考えた。N3位に導入する置換基を変えることで、種々の標的に対す る蛍光プローブが開発され、それらが診断薬などに応用されることが期待される。
第2 章ではグアニン四重鎖（G4）構造に対する結合特異性の改変を指向し、ThT のN3位に置換 基を導入した N3位修飾 ThT 誘導体を合成し、その蛍光特性および結合特性を評価した。Mohanty らの分子動力学シミュレーションによると、ThTのN3位への置換基導入により、パラレル型のG4 構造を選択的に検出できる可能性が示唆されていた。合成したN3位修飾ThT 誘導体は、予想通り パラレル型のG4構造を、特にNa+存在下では27Mycを選択的に識別することを明らかにした。さ らに、これらN3位修飾ThT誘導体は、標的の非存在下ではほとんど蛍光を発しないことが分かり、
バックグラウンド発光の低い、コントラストが非常に高い蛍光イメージを与えることを実証した。
また、ThT誘導体は未修飾のThTでは見られなかった配列のG4構造の誘起も導くことも明らかに した。以上より、筆者は、G4構造認識分子としてのThT誘導体の開発において、N3位への置換基 導入の有用性を示した。これらThT誘導体は、G4構造の検出のための蛍光プローブとしてだけで はなく、転写の制御を行う遺伝子発現制御薬の候補化合物としての応用が期待される。
第3 章では、標的対象の拡張を指向し、ThT の N3位にリンカーを介してリガンド分子をコンジ ュゲート化し、未修飾のThT とは異なる標的指向性を有する蛍光プローブ分子の創出を検討した。
その結果、リガンド・コンジュゲート化ThT誘導体は特異的に、かつ定量的に標的タンパク質を検 出できることを明らかにした。さらに、試験管内だけではなく、固定化した細胞中の受容体も特異 的に染色できることを実証した。また、リガンド分子を導入しても、ThT誘導体はバックグラウン ド発光が低いという蛍光ローター分子としての特性を保持することも明らかにした。このように、
リガンド・コンジュゲート化によるN3位修飾ThT 誘導体の発展性は、今後、様々な標的タンパク 質の簡便検出を可能にすることが期待される。
本学位論文において、ノンカノニカルな核酸構造を標的としたN3位修飾ThT誘導体が選択性の 高い小分子リガンドとなり得ることが示唆された。現在、パラレル型のG4構造を高感度・高選択 的に染色できる色素として、検出系に応用できることが報告されている。例えば、新規簡便等温増 幅（Single Amplification by Ternary Initiation Complexes：SATIC）法では、ヒドロキシエチル基を導 入したThT誘導体で核酸増幅産物であるパラレル型のG4構造を染色することによって標的のバイ オマーカーを感度よく特異的に検出することができる。また、今後さらなる誘導体化によって化学 構造と遺伝子発現制御の相関が明らかにされることで、抗がん剤などの医薬品の研究開発や細胞の 初期化や分化誘導など再生医療関連分野などへの応用も期待される。
さらに、リガンド・コンジュゲート化ThT誘導体が試験管内の標的化合物や固定化細胞中の標的 タンパク質を特異的に検出できることを実証した。本研究が基礎となり、標的対象を拡張するため の分子設計・創出方法が確立されれば、酵素結合免疫吸着法や免疫組織化学染色法などに代わる生 体分子や細胞などの新しい特異的検出法として病理診断や術中迅速診断に応用されるかもしれな い。また、生細胞内に導入することができれば、ライブイメージングへの応用が可能となるだろう。
Fluorescence probes can be dyes that directly stain the target molecule, or fluorescent tags that conjugate with the recognition domain of the target. In the second category, the target can be a protein (such as an antibody), a nucleic acid, or an organic compound (such as a ligand molecule), and the tag emits the fluorescence to be analyzed. Various fluorescence probes can quantitatively detect target molecules in vitro;
other probes can visualize target molecules in vivo or in cell culture. However, developing indicators with high sensitivity and selectivity to antibodies, nucleic acids, and other targets remains a challenging task.
This thesis summarizes the recent knowledge and functional expandability of derivatized thioflavin T (ThT), a highly sensitive indicator of amyloid fibrils. The N3-position of ThT is adjacent to the dihedral angle between the benzothiazole rings and dimethylaminobenzene rings around the single C–C bond. Therefore, the steric hindrance at this position greatly depends on the flexibility of the rotation angle. I thus anticipated that introducing functionalities to the N3-position of ThT would change the binding specificity of ThT derivatives. I expect that by changing the functional groups at the N3-position of ThT, we can develop fluorescent probes of various target molecules, and new diagnostic reagents.
In Chapter 2 of this thesis, I modulate the specificity of G-quadruplex (G4) structures. For this purpose, I synthesized novel N3-modified ThT derivatives, and evaluated their fluorescence and binding properties.
Referring to the results of molecular dynamics simulations by Mohanty et al., I assumed that introducing substituents at the N3-position would change the specificity to G4 topologies from antiparallel type to parallel type. The N3-modified ThT derivatives indeed selectively detected parallel G4s, especially 27Myc in the presence of Na+. Furthermore, these derivatives produced very low background fluorescence in the absence of target G4s, and provided high contrast images when binding to the targets. The ThT derivatives also induced topological changes of G4s by their binding to G4. Namely, modifying the N3-position of ThT is effective for developing ThT derivatives that recognize G4 molecular structures. Therefore, ThT derivatives are expected not only as fluorescence probe for G4s, but also as drug candidates that regulate gene expression.
In Chapter 3, I attempted to create fluorescence probes with different target-directing properties from unmodified ThT. To expand the target range, I conjugated ligand molecules via linker chains at the N3-position of ThT. The ligand-conjugated N3-modified ThT derivatives specifically and quantitatively detected various target proteins. Ligand-tethering ThT derivatives could stain the target receptor in fixed cells. Furthermore, introducing the ligand molecules at the N3-position retained the desirable properties of the fluorescent molecular rotor (such as low background emission). Therefore, I expect that the ligand-conjugated N3-modified ThT derivatives will become useful tools for detecting various target proteins.
In summary, I demonstrated the potential for N3-modified ThT derivatives as small molecular ligands with high selectivity for non-canonical nucleic acids. Recently, I reported that a ThT derivative that stains parallel G4s is applicable to detection systems. For example, ThT derivatives modified with a hydroxyethyl group at the N3-position can stain isothermal amplification products including multiple G4s, and thereby, the system can detect target biomarkers in a novel rapid and convenient isothermal amplification method called single
amplification by ternary initiation complexes. In future, I expect that ThT derivatives will be developed as pharmaceutical agents for cancers and regenerative medicine purposes (cell reprogramming and differentiation). Further derivatization of ThT will reveal the correlation between the chemical structure of ThT derivatives and the efficacy of their gene-expression regulation.
Finally, I demonstrated that ligand-conjugated N3-modified ThT derivatives can detect target molecules in vitro and in fixed cells. Once the design approach and synthesis method for expanding the target-directing properties of these derivatives is established, I hope that the derivatives will displace enzyme-linked immune sorbent assay and immunohistochemistry methods in bedside diagnosis and fast operative pathologic diagnosis. I also anticipate that the derivatives will enter living cells, realizing live cell imaging in future.
