技術論文
Daptomycin の Etest 法による MIC 測定における
精度管理の重要性および問題点
中島 英恵
1)1) 長野市民病院臨床検査科（〒 381-8551 長野県長野市富竹 1333-1）
要 旨
ダプトマイシン（DAP）非感性株を含む Staphylococcus aureus（S. aureus）13 株を使用し，市販の 3 ブランド（BD，栄 研，極東）のミュラーヒントン寒天培地を用いた際の Etest 法による DAP のブレイクポイント（BP）（MIC 値が 1 μg/mL） 付近の MIC 値の測定精度について，微量液体希釈法を基準に，比較検討した．精度管理（QC）株には，S. aureus ATCC29213 および Enterococcus faecalis ATCC29212 を使用した．S. aureus 13 株に対する MIC 測定では，QC 株に対する MIC 値が QC レンジ外であった栄研及び極東で，偽感性が発生した．BD は，QC 株に対する MIC 値は QC レンジ内であったが，偽非 感性が発生した．S. aureus に対する DAP の MIC 測定では，BP とかけ離れた MIC 値を示す S. aureus ATCC29213 だけでな く，DAP の BP 値を示す S. aureus 株も QC 株として設定していく必要がある． キーワード ダプトマイシン，黄色ブドウ球菌，最小発育阻止濃度，Etest，精度管理 Daptomycin（DAP）は，日本において 2011 年 9 月 に 5 番目の抗 Methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）薬として発売になった．DAP の薬 剤 感 受 性 検 査 法 に は ， 微 量 液 体 希 釈 法 broth
microdilution（BMD 法）もしくは Etest 法による MIC
測定があり，使用する培地中の Ca2+濃度が MIC 値の
変動要因となることが知られている1)．従って，
Clinical and Laboratory Standard Institute（CLSI）で
は，BMD 法の Mueller-Hinton broth の Ca2+濃度を， 生理的濃度の 50 mg/L に調整するよう規定してい る2)．一方，Etest 法では，Ca2+濃度が 25～40 mg/L の Mueller-Hinton Agar（MHA）を用いるよう添付文 書に記載されている3)．しかし，MHA の Ca2+濃度は 標準化されておらず，市販の MHA はブランドおよ びロット毎に Ca2+濃度が異なる1)． そこで私たちは，先に，被検菌株に臨床分離 MRSA 98株を使用し，日本で生培地として市販されている 3ブランドの MHA を用いた際の Etest 法における MIC値のばらつきを，BMD 法を基準として比較し， 3ブランド各々が BMD 法と有意な差を認めている
（p < 0.0001）4)．S. aureus に対する DAP の MIC 値は，
日本で市販の 3 ブランドの MHA を用いて Etest 法で 測定した場合，DAP の MIC 測定の標準法である BMD法とは異なる結果となる可能性があることが 判明した．しかし，先の検討では被検菌株が，BMD 法で≦0.06～0.5 μg/mL の MIC 値を示す株のみで あった．臨床分離 S. aureus に対する DAP 非感性株 の割合は，0.1%以下であり，DAP 非感性株を用い て，日本で市販の MHA を用いた際の Etest 法におけ るブレイクポイント付近の MIC 値の測定精度に関す る報告は未だ無い1)．今回，DAP 非感性の S. aureus
を用い，S. aureus の DAP ブレイクポイント（MIC 値が 1 μg/mL）付近に対する Etest 法における MIC 値の測定精度について検討を行った．
I 対象および方法
1．対象菌株，精度管理 Quality Control（QC）株
対象菌株は，Cubist 社から提供された S. aureus 13 株（C1～C13）を用いた．QC 株は，CLSI および
Etest添付文書に従い，S. aureus ATCC29213 および
Enterococcus faecalis ATCC29212を使用した2),3)．
2．Etest 法で使用した MHA と MHA 中の Ca2+濃度
の測定 MHA は，ミュラーヒントン II 寒天培地（lot 2095349，2103030，2110020）（ベクトン・ディッキ ンソン，以下，BD-MHA），ポアメディア ミュラー ヒントン S 寒天培地（lot 24010，24011，24012）（栄 研化学，以下，栄研-MHA），バイタルメディア 変 法ミュラーヒントン寒天培地（lot COAD3601， COAD4D01，COAD5S01）（極東製薬工業，以下，極 東-MHA）の 3 ブランド各々 3 ロットを使用した．
MHA中の Ca2+濃度は，Radiometer ABL800 FLEX（ラ
ジオメーターメディカル）で測定し，算出した1),5)．
3．MIC 測定方法
BMD法は，MIC 測定パネルに Mueller-Hinton broth
の Ca2+濃度が 50 mg/L に調整されたフローズンプ レート‘栄研’（lot 25001）（栄研化学）を用い，検査方 法は添付文書に従った．なお，MIC 測定パネルは薬 剤濃度を 0.12～8 μg/mL とし，希釈系列は Etest 法と 同様（0.12，0.19，0.25，0.38，0.5，0.75，1，1.5， 2，3，4，6，8 μg/mL）とした．Etest 法は，MIC 測 定試薬に Etest ストリップ（lot 1000779020）（シス メックス・ビオメリュー）を用い，検査方法は添付 文書に従った．BMD 法と Etest 法による MIC 測定 は，接種菌液の濃度調整に濁度計を使用し，同じ菌 液から同時に実施した．QC は，対象菌株の MIC 測 定日ごとに実施した．MIC 値の解釈は CLSI に準じ MIC ≦ 1 μg/mL を感性，MIC > 1 μg/mL を非感性と した2)．BMD 法と Etest 法の MIC 値の比較は，BMD 法を基準とし，BMD 法で感性かつ Etest 法で非感性 を偽非感性 major error（ME），BMD 法で非感性かつ
Etest法で感性を偽感性 very major error（VME）とし
た． II 結 果 1．MHA 中の Ca2+濃度 MHA中の Ca2+濃度は，BD-MHA が 27.0～27.2 mg/ L，栄研-MHA が 48.0～48.8 mg/L，極東-MHA が 42.2 ～42.8 mg/L で，栄研-MHA および極東-MHA は，添 付文書で推奨の Ca2+濃度の範囲外であった． 2．QC 株の MIC 測定結果
QC株の MIC 測定結果を Table 1 に示す．S. aureus
ATCC29213 に 対 す る MIC 値 は ， BMD 法 が 0.25
μg/mL（CLSI の BMD 法の QC レンジは，0.12～1 μg/mL）に対し，Etest 法は，BD-MHA が 0.25 μg/mL， 栄研-MHA が 0.12 μg/mL，極東-MHA が 0.09 もしく は 0.12 μg/mL であった．E. faecalis ATCC29212 に対 する MIC 値は，BMD 法が 1 μg/mL（CLSI の BMD 法の QC レンジは，1～4 μg/mL）に対し，Etest 法 は，BD-MHA が 1.5 もしくは 2 μg/mL，栄研-MHA が 0.75 もしくは 1 μg/mL，極東-MHA が 0.38 μg/mL であった．なお，Etest 法の QC レンジは，S. aureus
ATCC29213は 0.25～1 μg/mL，E. faecalis ATCC29212
は 1～4 μg/mL である3)．本検討で得られた QC 株の
MIC値を評価するため，添付文書に従い，通常の 2
倍希釈系列に換算すると，S. aureus ATCC29213 に対 する MIC 値は，BD-MHA が 0.25 μg/mL，栄研-MHA が 0.12 μg/mL，極東-MHA が 0.12 μg/mL，E. faecalis
ATCC29212 に 対 す る MIC 値 は ， BD-MHA が 2
μg/mL，栄研-MHA が 1 μg/mL，極東-MHA が 0.5 μg/
mLとなり，BD-MHA では S. aureus ATCC29213，E.
faecalis ATCC29212共に QC レンジ内であった．し
か し ， 栄 研 -MHA で は S. aureus ATCC29213 が
QCレ ン ジ よ り 低 く ， 極 東 -MHA で は S. aureus
ATCC29213，E. faecalis ATCC29212 共に QC レンジ より低かった． 3．対象菌株の MIC 測定結果 対象菌株の MIC 測定結果を Table 2 に示す．S. aureus 13株の MIC 値は，BMD 法で 0.25～3 μg/mL と測定され，その内訳は 0.25 μg/mL が 1 株，0.5 μg/ mLが 2 株，1 μg/mL が 1 株，1.5 μg/mL が 5 株，2 μg/mLが 3 株，3 μg/mL が 1 株であった．各ブラン
ドの MHA を用いた Etest 法による MIC
れ，BMD 法で 1 μg/mL であった株が ME となった． 一方，栄研-MHA は BMD 法と比較し，同じ値もし くは 0.5～1.5 管低く測定され，BMD 法で 1.5 μg/mL であった 5 株のうち，各ロット 2 もしくは 3 株が VMEとなった．また，極東-MHA は BMD 法と比較 し 0.5～2 管低く測定され，BMD 法で 1.5 μg/mL で あった 5 株全てが 3 ロット全て VME となり，BMD 法で 2 μg/mL であった 3 株のうち 1 株が 2 ロットで VMEとなった． III 考 察 感染症診療の現場において，薬剤感受性検査で得 られた MIC 値とその MIC 値をもとに解釈された判 定カテゴリーは，抗菌薬選択の指標の一つとなって いるため，MIC 値の正確な測定は重要である．S. aureusに対する DAP のブレイクポイントは，現在，
CLSIでは MIC ≦ 1 μg/mL が感性，MIC > 1 μg/mL が
非 感 性 ， European Committee on Antimicrobial
Susceptibility Testing（EUCAST）では MIC ≦ 1 μg/mL
が感性，MIC > 1 μg/mL が耐性と設定されており， 両ガイドラインともに中間のカテゴリーは存在し
ない1),6)．従って，DAP の MIC 測定は測定の際に生
じる僅かな誤差が，VME あるいは ME に繋がりやす い状況といえる．
Etest法の添付文書には，DAP の MIC 測定では，
精度管理株に対する微量液体希釈法および 3 ブランド各々 3 ロットの Mueller-Hinton Agar を用いた Etest 法による
Daptomycinの MIC 値
精度管理株 BMD-MIC (μg/mL)
Etest-MIC (μg/mL)
BD-MHA 栄研-MHA 極東-MHA 2095349*1 (27.2)*2 2103030*1 (27.0)*2 2110020*1 (27.0)*2 24010*1 (48.8)*2 24011*1 (48.6)*2 24012*1 (48.0)*2 COAD3601*1 (42.8)*2 COAD4D01*1 (42.8)*2 COAD5S01*1 (42.2)*2 S. aureus ATCC 29213 0.25 0.25 0.25 0.25 0.12 0.12 0.12 0.12 0.09 0.09 S. aureus ATCC 29213 0.25 0.25 0.25 0.25 0.12 0.12 0.12 0.09 0.09 0.09 S. aureus ATCC 29213 0.25 0.25 0.25 0.25 0.12 0.12 0.12 0.09 0.09 0.09 E. faecalis ATCC29212 1 2 2 2 1 1 1 0.38 0.38 0.38 E. faecalis ATCC29212 1 2 2 1.5 0.75 0.75 1 0.38 0.38 0.38 E. faecalis ATCC29212 1 1.5 1.5 1.5 0.75 0.75 0.75 0.38 0.38 0.38 BD：ベクトン・ディッキンソン，栄研：栄研化学，極東：極東製薬工業，*1：MHA のロット番号，*2：MHA 中の Ca2+濃度（mg/L） Table 1
被検菌S. aureus 13株に対する微量液体希釈法および 3 ブランド各々 3 ロットの Mueller-Hinton Agar を用いた Etest 法
による Daptomycin の MIC 値
菌株 No. BMD-MIC (μg/mL)
Etest-MIC (μg/mL)
BD-MHA 栄研-MHA 極東-MHA 2095349*1 (27.2)*2 2103030*1 (27.0)*2 2110020*1 (27.0)*2 24010*1 (48.8)*2 24011*1 (48.6)*2 24012*1 (48.0)*2 COAD3601*1 (42.8)*2 COAD4D01*1 (42.8)*2 COAD5S01*1 (42.2)*2 C2 0.25 0.38 0.38 0.38 0.12 0.12 0.12 0.09 0.06 0.09 C3 0.5 0.75 0.75 0.75 0.19 0.25 0.19 0.19 0.12 0.25 C1 0.5 0.75 0.75 0.75 0.38 0.38 0.38 0.19 0.19 0.25 C4 1 2* 2* 1.5* 1 0.75 0.75 0.38 0.38 0.38 C7 1.5 2 3 3 1** 1** 0.75** 0.75** 0.5** 0.5** C8 1.5 2 3 3 1** 1** 1.5 0.75** 0.75** 0.75** C6 1.5 3 3 3 1.5 1** 1** 0.75** 0.75** 0.75** C5 1.5 3 3 3 1.5 1.5 1.5 0.75** 0.75** 0.75** C12 1.5 3 3 3 1.5 1.5 1.5 1** 1** 1** C11 2 4 4 4 2 2 1.5 1.5 1** 1** C9 2 6 4 6 2 2 1.5 1.5 1.5 1.5 C10 2 4 4 4 2 1.5 1.5 1.5 1.5 1.5 C13 3 6 6 8 3 3 3 2 2 2 BD：ベクトン・ディッキンソン，栄研：栄研化学，極東：極東製薬工業，*1：MHA のロット番号，*2：MHA 中の Ca2+濃度（mg/L） * 偽非感性，** 偽感性 Table 2
適切な Ca2+濃度を含む MHA のみを使用するよう記
載されているが，市販の MHA に Ca2+濃度の記載は
無い．本検討において，ブランド間で MHA の Ca2+濃
度は異なり，また先の検討においても臨床分離株の
MIC50/MIC90は，BMD 法が 0.25/0.38 μg/mL に対し，
Etest法は BD-MHA が 0.5/0.75 μg/mL，栄研-MHA が
0.12/0.19 μg/mL，極東-MHA が 0.09/0.09 μg/mL と測 定 さ れ ， MHA の Ca2+濃 度 は ， BD-MHA が 20.4 mg/L，栄研-MHA が 45.2 mg/L，極東-MHA が 52.0 mg/Lで，3 ブランド全てが Etest 法の添付文書に記 載の濃度の範囲外であった4)．しかし，日常検査の 中で MIC 測定の度に MHA 中の Ca2+濃度を測定する ことは，時間と手間とコストの面から困難である． 従って，QC 株の MIC 測定を行うことで，使用する MHAの適否を判断するのが現実的である． VMEは，臨床でその抗菌薬が使用される可能性が あるため，最も避けるべきエラーとされている．本 検討では，栄研-MHA および極東-MHA を用いた際 に VME が発生した．この 2 ブランドの MHA 中の Ca2+濃度は，Etest 法の添付文書に記載の濃度より高 く，QC 株の MIC 値は，Etest 法の QC レンジより低 かった．従って，QC を予め実施すれば，VME を防 ぐことは可能であると考える．得られた QC 株の
MIC値の評価にあたっては，S. aureus ATCC29213 に
対する DAP の QC レンジは，CLSI の BMD 法が 0.12 ～1 μg/mL に対し，Etest 法は 0.25～1 μg/mL であり， 下限値が異なることに注意しなければならない．ま た，極東-MHA の Ca2+濃度は添付文書に記載の濃度 と 2.2～2.8 mg/L の差であったが，BMD 法との MIC 値のずれが大きく，VME が多く発生した．極東-MHA を用いた Etest 法による MIC 測定では，MHA 中の
Ca2+濃度以外の要因も MIC 値に影響を及ぼしている
可能性が懸念される．
一方，BD-MHA を用いた Etest 法による MIC 測定 では，QC 株の MIC 値は，S. aureus ATCC29213 およ び E. faecalis ATCC29212 ともに QC レンジ内で，
MHAの Ca2+濃度も添付文書に記載の濃度の範囲内
であった．S. aureus ATCC29213 に対する DAP の
MIC値に関して，Etest 法の添付文書には，QC 結果 範囲は 0.25～1 μg/mL と定義されるが，0.25 μg/mL 前後の結果となる傾向があるとの記載があり，本検 討でも BD-MHA による MIC 値は，0.25 μg/mL と測 定されていた．しかし，BMD 法で MIC 値が 1 μg/mL であった株（C4）が，BD-MHA では 1.5 もしくは 2 μg/mL と測定され，ME が発生した．S. aureus
ATCC29213に対する MIC 値は，S. aureus に対する
DAPのブレイクポイント値（1 μg/mL）と比較し，
低い値である．S. aureus の DAP のブレイクポイント 値とかけ離れた MIC 値を示す S. aureus ATCC29213 で，ブレイクポイント付近の MIC 値の測定精度を検 証することに，限界があると思われた．S. aureus に 対する DAP の MIC 測定では，特に，ブレイクポイ ント付近の MIC 値の正確な測定のためには，今後， S. aureusで，かつ，ブレイクポイントの MIC 値（1 μg/mL）を示す株も QC 株として設定していく必要 があると考える． IV 結 語 日本で生培地として市販されている 3 ブランドの MHA（BD-MHA，栄研-MHA，極東-MHA）を用い た Etest 法による S. aureus に対する DAP の MIC 測 定では，ME，VME が発生する可能性がある．VME は，QC を行うことで，防ぐことが可能であると考 えられた．しかし，ME を回避するためには，今後， ブレイクポイントとかけ離れた MIC 値を示す S.
aureus ATCC29213だけでなく，DAP のブレイクポイ
ントである MIC 値が 1 μg/mL を示す S. aureus 株も
QC株として設定していく必要がある．
謝辞
本検討を行うにあたり，菌株を提供して下さいました Cubist Pharmaceuticals Inc.に，ご助言をいただきました Bradley Katz 氏 （Cubist Pharmaceuticals Inc.），黒川利徳氏（MSD 株式会社）に深
謝申し上げます． ■文献
1) Koeth LM, Thorne GM : Daptomycin in vitro susceptibility methodology: a review of methods, including determination of calcium in testing media, Clin Microbiol News 2010 ; 32 : 161– 169.
2) Clinical and Laboratory Standards Institute ： Performance standards for antimicrobial susceptibility testing ; twenty-third informational supplement, Document M100-S23. Wayne, PA, 2013.
3) bioMerieux Inc ： Etest® Customer Information Sheet-1 REF.
535000/535008 Etest ダ プ ト マ イ シ ン DPC, http:// products.sysmex-biomerieux.net/product/pdf/DPC2AG027 4) Nakashima H et al.: Daptomycin Etest MICs for
Infect Chemother 2012 ; 18 : 970–972.
5) Hanberger H et al.: Pharmacodynamics of daptomycin and vancomycin on Enterococcus faecalis and Staphylococcus aureus demonstrated by studies of initial killing and postantibiotic effect and influence of Ca2+ and albumin on these drugs, Antimicrob
Agents Chemother 1991 ; 35 : 1710–1716.
6) European Committee on Antimicrobial Susceptibility Testing： Breakpoint tables for interpretation of MICs and zone diameters. Version 3.1. Munich and Basel, 2013. http://www.eucast.org/ fileadmin/src/media/PDFs/EUCAST_files/Breakpoint_tables/ Breakpoint_table_v_3.1.pdf
Technical Article
Importance and problems of quality control during daptomycin MIC
testing using Etest methodology
Hanae NAKASHIMA1)
1)Department of Clinical Laboratory, Nagano Municipal Hospital(1333-1, Tomitake, Nagano-shi, Nagano 381-8551, Japan)
Summary
To assess the accuracy of daptomycin (DAP) MIC near the breakpoint against Staphylococcus aureus (i.e., MIC=1 μg/mL) by the Etest, MIC tests were conducted using 13 S. aureus test isolates, including non-daptomycin-susceptible isolates, and 3 brands of MHA plates (BD, Eiken and Kyokuto) commercially available in Japan. The results were compared with those obtained by the CLSI reference BMD. S. aureus ATCC 29213 and Enterococcus faecalis ATCC 29212 were used as the quality control (QC) strains. When the DAP MICs were determined by the Etest on Eiken and Kyokuto MHA plates, the MICs of the QC strains were beyond the Etest QC range, and very major errors occurred for 13 test isolates. When the DAP MICs were determined by the Etest on BD MHA plates, the MICs of the QC strains were within the Etest QC range, but a major error occurred for 13 test isolates. For more objective and accurate measurement of DAP MICs against S. aureus, it is necessary to set, not only S. aureus ATCC29213, which indicates the MIC far from the breakpoint, but also the S. aureus strain, which indicates the MIC of the breakpoint, as the QC strain.
Key words: Daptomycin, Staphylococcus aureus, MIC, Etest, Quality control
