辻田由喜（成長発達臨床医学専攻）

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PTEN 遺伝子変異による原発性免疫不全症 Activated PI3K-delta like syndrome の発見

つじたゆき

辻田由喜

（成長発達臨床医学専攻）

防衛医科大学校

平成２８年度

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第1章緒言 1頁

第2章 PI3KCD^{遺伝子変異をもつ}APDS患者の同定とその臨床的特徴 3頁

第3章 PTEN^{遺伝子変異をもつ}APDS様免疫不全症患者の同定 8頁第4章 PTEN^{変異患者細胞における}PTEN発現の解析 11頁

第5章 PTEN^{変異および}PIK3CD変異患者リンパ球におけるAKT/mTOR/S6 シグナル伝達経路のリン酸化解析 14頁

第6章 PTEN^{変異患者と}PIK3CD変異患者の免疫学的検討 18頁

第7章総括 22頁

第8章結論 24頁

謝辞 25頁

単語・略語説明 26頁

引用文献 31頁

図表 34頁

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第１章緒言

Activated PI3 kinase (PI3K) delta syndrome (APDS)は、2012年に初めて発見された原発性免疫不全症候群であり、反復性下気道感染症、肝脾腫、多発性リンパ節腫脹、CD4 陽性リンパ球の減少、クラススイッチしたメモリーB 細胞の減少などを特

徴とする ^{1), 2)}。PI3K-delta を構成するサブユニットの一つ、p110δをコードする

PIK3CD 遺伝子の、常染色体優性遺伝形式をとる機能獲得変異（単語・略語説明 28

ページ参照）がAPDS の原因である。さらにこの遺伝子の変異は高IgM症候群、原発性硬化性胆管炎の原因ともなり³⁾、B細胞性悪性腫瘍とも関連がある^{4), 5)}。PIK3CD 遺伝子変異によるAPDS は APDS1 と分類され、PI3K-deltaを構成する別のサブユニットp85αをコードする遺伝子PIK3R1の機能喪失変異（単語・略語説明28ページ参照）により発症するAPDS^{6), 7)}をAPDS2と分類する。p110δはPI3Kの触媒ドメインであり、p85αがその作用を調整する。APDS1、APDS2双方の患者において、

p110δの機能亢進が認められている。

リンパ球において、PI3K/AKT/mTOR（単語・略語説明26, 29ページ参照）のシグナル伝達経路は、細胞生存、増殖、成長、代謝に不可欠である ⁸⁾。PI3K は、イノシトールリン脂質のリン酸化を行う酵素である。T細胞受容体、B細胞受容体、サイトカインレセプターなどの受容体にリガンドが結合することでPI3Kの活性化が生じ、

3,4-イノシトール２リン酸(PIP2) （単語・略語説明29ページ参照）を活性型の3,4,5- イノシトール３リン酸(PIP3)（単語・略語説明29ページ参照）に変換し、次いでPIP3 はAKTをリン酸化して活性化させる。PI3Kによって活性化されるPIP3/AKT/mTOR のシグナル伝達経路は、生体内における細胞の生存、周期、糖代謝、あるいはタンパク合成など様々な生理活性に関わる細胞内シグナルを担っている。

一方、phosphatase and tensin homolog (PTEN)によって、AKTは不活化される。

これは、PTENによるPIP3のPIP2への脱リン酸化作用によることが、マウスモデルにおいてもヒトにおいても証明されている ^{9), 10)}。そのため、PTEN の機能喪失は AKT/mTOR 経路を活性化させる方向に働く ¹¹⁾。PIK3CD または PIK3R1 の変異によりPI3Kの機能が亢進しAPDS1またはAPDS2が発症するように、PTENの機能

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たため、我々はPTENの機能喪失変異がAPDS 類似の病態を発症しうるのではないかと考えた。

本研究では、まずわが国における原発性免疫不全症候群患者の中で、PIK3CD遺伝子変異による APDS 患者の特徴を明らかにする検討を実施した。次いで原因不明の原発性免疫不全症候群患者に対しexome解析（単語・略語説明27ページ参照）を行って、ヘテロ接合型（単語・略語説明27ページ参照）PTEN遺伝子変異をもつ患者を2名見出した。 PIK3CD機能獲得変異によるAPDS1患者、またはPIK3R1機能喪失変異によるAPDS2 患者のように、この 2名の PTEN 遺伝子変異患者はAPDS 類似の所見を示した。PTEN の機能喪失変異が、リンパ球において AKT/mTOR/S6 のシグナルの亢進を引きおこすことを示し、APDS 類似の免疫不全症、APDS-like immunodeficiencyの原因となりうることを本研究で提唱する。

なお、本研究はヒト検体を用いるため、防衛医科大学校倫理委員会の承認（受付番号438「先天性免疫不全症の遺伝子解析研究」および、受付番号566「原発性免疫不全症の早期診断法の確立に関する研究」）を得て実施した。検体採取に際しては、対象者もしくはその保護者に研究内容を文書と口頭により説明し署名同意を得た。

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第２章 PIK3CD変異をもつAPDS患者の同定とその臨床的特徴

第１節背景

APDSは、PIK3CDまたはPIK3R1遺伝子の常染色体優性またはde novo（単語・

略語説明27ページ参照）のヘテロ接合型変異で発症する。PI3K-delta を構成する分子p110δのN334K、E525KまたはE1021K という3か所の機能獲得型変異は、さまざまな組織で発現しているPI3K-alphaのがん関連機能獲得型変異と構造的に同じ部位の変異である²⁾。海外からのAPDSの報告では、患者のほとんどがwhole exome 解析で発見された大家系の症例であった^{1), 2)}。

本疾患は2013 年に初めて同定され海外から報告された新しい免疫不全症であり、

国内での患者の発症状況および臨床的特徴は不明であった。一方で、わが国において原発性免疫不全症候群の患者の多数例を対象としたPIK3CDやPIK3R1遺伝子の変異検索は行われていない。そこで、原発性免疫不全症候群患者の中から国内での

APDS1の患者を同定し、その臨床的特徴を明らかにすることとした。

第２節対象および方法

（１）対象

防衛医科大学校小児科と東京医科歯科大学小児科において原発性免疫不全症の免疫学的検討の依頼を受け、末梢血3～5mlをEDTA加血液として入手できた患者のうち、抗体産生不全（低ガンマグロブリン血症を伴っているもの、または罹患済感染症・

ワクチンに対して有効な特異抗体を産生できないもの）を呈し、遺伝子解析の同意を得られている156 例を対象として、保存検体を用いてPIK3CD遺伝子変異を解析した。

本疾患の報告後に、理化学研究所かずさDNA研究所および東京大学医科学研究所にて今まで行われていたexome 解析例の結果を見直し、PIK3CD遺伝子の変異をもつことが判明した孤発性の患者４例においても、保存検体を用いて PIK3CD 遺伝子変異を解析し確証を得た。これら４名の患者では、両親・同胞においても遺伝子解析の承認と検体を得て PIK3CD 遺伝子変異を解析し、家族には変異が無いことも合わせて確認した。

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よび、東京医科歯科大学小児科で PIK3CD 遺伝子変異があらたに同定された孤発性の患者２例について各主治医に問い合わせ、遺伝子変異の詳細と臨床情報について情報提供を得た。

すべての患者情報は匿名化で得た上で、これらの情報をもとに、国内の PIK3CD 変異に伴うAPDS患者の状況を明らかにした。Germ-lineのPIK3CD 変異がみられた患者については、家族の遺伝子検査の実施承認が得られた場合は、両親・同胞についても患者と同一の変異の有無を検索した。

（２） genomic DNAの抽出

末梢血１検体当たり 200μl をサンプル量とし、QIAamp DNA Micro キット (Qiagen，Hilden，Germany）を用いてgenomic DNAを溶出量 100 µl で抽出した。

得られたDNAはすべてQubit フルオロメ－ター (Invitrogen, Carlsbad, California, USA) またはGene Quant pro (GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, England) を用いて濃度を測定した。

（３） PIK3CD遺伝子シークエンス

①PCR法による各遺伝子の増幅

抽出した各患者由来genomic DNA につき、PIK3CD遺伝子の3か所のAPDS原因変異部位を含む部分をpolymerase chain reaction (以下PCR) 法によって増幅した。プライマーは、既報を参照して設計し作製した²⁾。PCR反応物は、High Fidelity PCR Master (Roche, Basel, Schweiz)を用いて調整し、Veriti^® サーマルサイクラー (Applied Biosystems、以下 ABI，Foster，USA)を用いて、PCR 法による増幅反応を行った。PCRの反応条件は、初期変性94℃5分間後、35サイクル（熱変性94℃ 60 秒，アニーリング60℃ 60秒, 伸長反応72℃ 60分）繰り返した後、72℃ 10分間で最終伸長としてPCRを実施した。次いで、反応液を1.5%アガロースゲルにて電気泳動し、PCR産物を確認した。

②ダイターミネーター法によるダイレクトシークエンス

精製したPCR産物をシークエンス反応液 [PCR精製物1μl、BigDye®

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Terminator v1.1 (ABI) 4μl, BigDye^® Terminator Sequencing Buffer (ABI) 2μl , Primer (10μM) 0.5μl、H2O 12.5μl] として調整し、Dye Terminator法により、

Gene Amp^® PCR system 9700 (ABI, Foster，USA )を用いて増幅反応を行った。PCR の反応条件は初期変性96℃1分間を行った後、40サイクル (熱変性96℃10 秒、アニーリング50℃5秒、伸長反応60℃4分) 繰り返した後、60℃4分間で最終伸長とした。

シークエンス反応産物は Millipore Multiscreen (Millipore, Billerica, USA) 、 Sephadex ^TM G-50 Superfine (Sigma-Aldrich, St. Louis, USA) を用いて精製した後、

Hi-Diホルムアミドにより希釈し、3500 Genetic Analyzer (ABI, Foster，USA ) により遺伝子配列を決定した。

第３節結果

（１）遺伝子解析結果

156例の抗体先生不全を伴う免疫不全症患者のうち、8例(5.1％)にPIK3CD遺伝子変異を検出した。うち5名はPIK3CD遺伝子E1021K変異を持ち、家族は変異を持たないことが確認された孤発例であった。他の3例はPIK3CD遺伝子E525A変異を持ち、この3例は同一家系から見出された家族症例であった。E1021K変異は既報と同じ変異であったが、E525A変異は他に報告のない新規変異であった。Exome解析で判明していた4 例の遺伝子変異は、4例とも PIK3CD E1021K変異であり、家族は変異を持たないことが確認された。富山大学小児科および東京医科歯科大学小児科への問い合わせで確認した症例3例は、すべてPIK3CD E1021K変異を持つ孤発例であった。このように、E1021K 変異を持つ患者12 例の家族では、検査実施の同意を得た上で家族解析がなされ、PIK3CD 遺伝子 E1021K 変異は認めないことが確認された。したがってこれら12例については、PIK3CD E1021K変異はde noveで生じたと考えられた。

（２）臨床的特徴

我々が把握した国内のPIK3CD 遺伝子変異をもつAPDS 患者の臨床的特徴を表１に示した。また、今回初めて PIK3CD 変異が見つかり、当院で詳細なリンパ球の機

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のKindred D ~ Kindred Fに、臨床的特徴を表2に示す（患者P5 ~ P9）。発症年齢は0歳4ヶ月から8歳で、平均は2.5歳であった。入院加療を要する下気道感染症などの細菌感染症を93%で、ヘルペス属のウイルス（主にEpstein-Barr (EB)ウイルスおよびサイトメガロウイルス）や真菌に対する日和見感染症を 47%の患者で認めた。

リンパ組織腫脹は80%の患者で伴っておりリンパ節腫脹をその全例で認めたが、さらに肝脾腫を47%の患者で、消化管粘膜下リンパ組織腫脹に伴う血便などの消化管症状を 47%の患者で認めた。血球減少は 40%で認められ、脾腫による脾機能亢進や、自己抗体産生に伴う血小板減少性紫斑病や溶血性貧血などの影響が考えられた。リンパ腫の発症が15例中2例で確認され、それぞれ小腸のMALT型リンパ腫とEBウイルス関連Bリンパ腫が1例ずつであった。低ガンマグロブリン血症を40%で、高IgM 血症を73%で伴っていた。これらの結果は表１に示すように、海外からの報告と同様であった。

第４節考察

今回の検討により、国内の免疫不全症患者における PIK3CD 変異による APDS1 患者の頻度、変異の部位と型が判明した。さらに、国内のPIK3CD変異患者15名の詳細な臨床情報が明らかとなった。国内のPIK3CD 変異APDS 患者は孤発例がほとんどであり、家族例がほとんどである海外の既報告とは異なっていた^{1), 2)}。海外からの報告は、多数の免疫不全症患者が発症している数家系を対象にExome解析を行った結果APDSを見出したという研究内容の報告であるため家族例がほとんどであり、

今回の国内患者の解析は家族歴のない多くの免疫不全症患者を対象に行ったため孤発例が多いという、患者背景の違いが存在した可能性がある。また、E1021K変異をもつ患者が大多数であり、既報にあるE525K変異、N334K変異症例は存在しなかった。一方、E525Aという新規変異を 1家系 3 例に見出した。いずれの変異を持った患者でも、国内患者の臨床症状は海外からの報告と同じく細菌感染症、リンパ組織腫脹、高IgM血症などを特徴としていた^{1), 2)}。

この解析の中で、原因不明の免疫不全症患者で APDS 様の臨床症状を認めながら

もPIK3CD 遺伝子変異をみとめなかった症例も存在したことから、PIK3CD近傍の

シグナル伝達関連遺伝子の変異により、APDS様の免疫不全症を呈する患者が存在することが示唆された。

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第５節結論

国内における PIK3CD 変異による APDS 患者 15 名の詳細な臨床症状を明らかにした。孤発例12名はいずれもE1021K変異を有し、すべてがde novo変異であった。

また、1家系 3 名はE525A 変異を有していた。これらの患者の臨床症状は国外の既

報と同様であった。PIK3CD 変異はみられないが APDS 様の免疫不全症を呈する症例が存在し、PIK3CD近傍のシグナル伝達関連遺伝子の異常が発症に関わっている可能性が推測された。

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第３章 PTEN遺伝子変異をもつAPDS様免疫不全症患者の同定

第１節背景

PIK3CD遺伝子変異による APDS1 は、本邦においても患者の存在が確認された。

さらにPIK3R1遺伝子変異によってもAPDS2を発症することが報告され^{6), 7)}、我々の解析した原因不明の免疫不全症患者の中にも２例のAPDS2患者が見出された（データ示さず）。しかしAPDS類似の臨床症状を示しながらPIK3CD、PIK3R1変異の確認されない患者も多く存在し、これら以外の近傍の遺伝子の変異により APDS と同様の機序で免疫不全症を発症する可能性が考えられた。そこで、原因不明の免疫不全症患者の中から新規遺伝子変異によるAPDS類似免疫不全症を見出すため、exome 解析を行った。

第２節対象および方法

（１）対象と検体採取

防衛医科大学校小児科および東京医科歯科大学小児科に遺伝子変異検索の依頼があった先天性免疫不全症症例 77 名において、両大学倫理委員会の承認を得た上で本人または保護者から文書で同意を得て、末梢血全血3~10mlを採取した。遺伝子解析の同意の得られた患者家族についても同時に末梢血を採取した。血液検体から第２章と同様の方法でgenomic DNAを抽出した。

（２）Exome解析

抽出したgenomic DNAをSureSelectXT Human All Exon V4およびA5 kit、または TruSeq Exome Enrichment kit をもちいてライブラリーを作製し、Illumina HiSeq 2000またはHiSeq 1000を用いてエクソーム解析を行った。得られたリードデータから、dbSNP version 131、in-house SNP データベース、および Human Genetic Variation Database (単語・略語説明27ページ参照) に報告されているものと同じ変異を除いた(図2)。

（３）候補遺伝子シークエンス

第２章２節と同様の方法により、Exome 解析で得られた候補遺伝子の変異を確認

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した。

（４）臨床所見

有意な遺伝子変異が検出された症例の臨床所見について、患者の主治医および診療録から情報を得た。

第３節結果

Exome解析を行った原因不明の免疫不全症患者77 名中 2名(2.6%)で PTEN遺伝子の変異を見出した。

図１の家系Aに示すP1 は、非血縁間の健常な両親から出生した3歳男児であり、

PTEN c.697C>T(R233X)というナンセンスのヘテロ接合型変異を有していた。図１の家系 B に示す P2 は、非血縁間の健常な両親から出生した 14 歳女児で、PTEN c.41-42insGA(R15fsX9)というフレームシフトによるストップコドンへのヘテロ接合型変異が認められた。P1、P2 ともに、変異はサンガー法シークエンスにて再確認された(図3)。また、両家系とも両親に変異はなく、de novo変異であった。また、P1、 P2ともにPIK3CDおよびPIK3R1に変異を認めなかった。

PTEN遺伝子変異をもつ患者P1、P2ともに、繰り返す感染症、リンパ組織の腫脹を認めた。さらにP1 は高IgM 血症を示し、これらの臨床症状は APDS患者と共通するものであった(表3）。

第４節考察

PTEN 遺伝子は腫瘍抑制因子として同定され、PTEN 過誤腫症候群(PTEN hamartoma syndrome)(単語・略語説明28ページ参照)の患者はPTEN遺伝子変異にともなう過誤腫発症をはじめとした様々な症状が認められる ¹²⁾。また、Cowden syndrome (CS:単語・略語説明 26 ページ参照) 患者の 80%、 Bannayan–Riley– Ruvalcada syndrome (BRRS: 単語・略語説明26ページ参照) 患者の60%、 Proteus syndrome (単語・略語説明30ページ参照) 患者の20%、 Proteus-like syndrome (単語・略語説明29ページ参照) 患者の50%にPTEN遺伝子の変異を伴っていることが報告されている¹²⁾。過去に免疫不全症を伴ったCS、BRRS、PS患者の報告例は存在

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最近、PTEN遺伝子変異の確認されたCS の患者で複合免疫不全(単語・略語説明 27 ページ参照)を発症している症例の報告がなされた¹⁸⁾。また、今回見出されたP1の変異は、CSおよびBRRS患者で報告されている変異と同一のものであった^{19), 20)}。

PTENはPIP3を脱リン酸化してPIP2へと変換する酵素作用をもち、全身の細胞で発現している。PTENの機能が喪失するとPIP3の産生が亢進すると考えられ、これはPI3Kの触媒ドメインp110δの機能亢進と同じようなAPDS様の病態を引き起こし、免疫不全症の原因となり得ることが推測された。

今回の PTEN 遺伝子変異を持つ免疫不全症患者の同定と、germ-line での PTEN 遺伝子変異によるPTEN 過誤腫症候群患者における複合免疫不全症合併の報告¹⁸⁾から、PTEN の機能喪失変異が APDS 様の免疫不全症の原因であるという仮説が成り立つ。この仮説の証明のためには、PTEN変異を有する患者のリンパ球を用いた機能解析の実験が必要と考えられた。

第５節結論

APDS類似の免疫不全症状を示す2名のPTEN変異患者を同定した。

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第４章 PTEN変異患者細胞におけるPTEN発現の解析

第１節背景

今回我々が発見した、免疫不全症をともなう PTEN 遺伝子変異患者において、

PTEN の機能低下が APDS 類似の機序で免疫不全症を発症しているとの仮説に基づくならば、患者リンパ球におけるPTEN発現は低下している可能性がある。

これを検証するため、患者のもつPTEN変異がリンパ球におけるPTEN発現にどのように影響を及ぼしているか、正常検体と比較をして評価をすることとした。

第２節対象と方法

（１）対象

前章で同定した PTEN 変異をもつ患者２名(P1, P2)に加え、図１家系 C に示す PTEN変異患者P3、P4を対象とした。P3、P4は、家族性の反復性甲状腺腫瘍と消化管ポリポーシスの発症により、家族性Cowden症候群(CS)と診断されており^{14), 15)}、 PTEN遺伝子の変異(c.13Adel, p.I5fsX)を前章の方法で確認した(図4)。P3およびP4 ともに免疫不全症を示唆する症状は伴っておらず、リンパ球数、リンパ球サブセット、

血清免疫グロブリン値は全て正常であり(表 4)、ウイルス抗体価も正常であった。正常コントロールは、健常人で同意の得られた3名とし、いずれも末梢血3~10mlを採取した。

（２）PTEN蛋白のウエスタンブロッティングによる検出

① 活性化リンパ球の作成

採取した末梢血はLymphoprep^TM (Axis-Shield、Oslo、Norway)を用いた比重遠心法により末梢血単核球 (peripheral blood mononuclear cells; PBMC)に分離した。細胞を 2 回洗浄し、10%ウシ胎児血清含有 RPMI-1640 メディウム(Gibco, Carlsbad, USA)で2×10⁶ cells/mlにPBMCを懸濁し、IL-2含有固層化抗CD3フラスコ(TLY Culture kit25: Lymphotec, Tokyo, Japan)にて48時間培養し、活性化リンパ球を作製した。

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② ウエスタンブロッティング

得られた活性化リンパ球2×10⁶ cellsに対し、プロテアーゼインヒビターカクテル (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)とフォスファターゼインヒビターカクテル(Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)を添加した RIPA バッファーを 100ul加え、細胞を溶解した。得られた細胞溶解液は、4℃で15分間、15000rpmで遠心し、上清を回収した。回収した溶解液は 98℃で 5 分間インキュベートをした。

得られた蛋白抽出液の濃度はすべてQubit フルオロメ－ター (Invitrogen, Carlsbad, USA)で測定し、各サンプル蛋白量25μgを用いてドデシル硫酸ナトリウムーポリアクリルアミドゲル電気泳動(sodium dodecyl sulfate-poly-acrylamide gel electrophoresis、SDS-PAGE)を行った。泳動後、蛋白をゲルからポリフッ化ビニリデン(polyvinylidene fluoride、PVFD)膜に転写し、8%スキムミルクでブロッキングを行い、ラビットポリクローナル抗PTEN抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, USA) とラビットポリクローナル抗GAPDH抗体(Abcam, Cambridge, USA)を１時間室温にて反応させた。その後PVFD 膜を洗浄後、horseradish peroxidase (HRP) 標識抗ラビット二次抗体を室温で１時間反応させた。反応後洗浄し、化学発光法を利用してPTEN蛋白をLAS-4000 mini (FUJI FILM, Tokyo, Japan)で検出した。得られたPTEN蛋白とGAPDH蛋白の発現について、その発光度をMulti-Gauge (FUJI FILM, Tokyo, Japan)を用いて数値化し、PTEN蛋白の発光度を内因性コントロール

蛋白 GAPDH の発光度で除した値をもって各患者および健常コントロールの PTEN

蛋白発現の値とし、それぞれの健常コントロールに対する患者の蛋白発現の割合を評価した。

第３節結果

ウエスタンブロッティングによる、活性化リンパ球由来 PTEN 蛋白の発現解析では、PTEN 変異をもつ患者(P1-P4)では健常人と比較して、明らかに発現が低下していた(図 5)。P1 の PTEN 蛋白バンドのシグナル強度は、健常コントロールのわずか 11.3%であった(図5)。患者P2、P3、P4のPTEN蛋白バンドのシグナル強度は、健常コントロールのそれぞれ74%、64%、75%であった(図5)。

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第４節考察

PTEN R233X変異をもつP1、PTEN R15fsX9変異をもつP2、PTEN I5fsX変異をもつ P3、P4 において、リンパ球における PTEN 蛋白の発現は健常と比較して低下していた。これらの結果から、P1、P2、P3、P4 のもつ PTEN 遺伝子変異は、

PTEN 蛋白の発現を低下させることが判明し、それに伴って患者細胞では PTENの機能が低下していると考えられた。

第５節結論

PTEN R233X 、R15fsX9、I5fsX 変異をもつ患者リンパ球において、PTEN蛋白の発現は低下していた。

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第５章 PTEN 変異および PIK3CD 変異患者リンパ球における AKT/mTOR/S6 シグナル伝達経路のリン酸化解析

第１節背景

PI3K活性の亢進は、AKT/mTOR/S6 経路の異常な活性化を誘導し、APDS1 およびAPDS2発症を引き起こすことが報告されている^{1), 2), 6)}。実際に、これらの患者では、AKT Ser473（pAKT）、リボゾーマル蛋白S6 Ser235およびSer236(pS6)のリン酸化亢進が確認されている^{1), 2)}。

我々は、PTEN遺伝子変異をもち、APDSによく似た臨床症状を示す原発性免疫不全症患者を2例見出した。これらの患者の細胞では、PTENの発現が低下しており、

PTENの機能喪失変異であると予想されることが前章で示唆された。PTEN変異により生じたPI3K活性の異常亢進がPIP3産生を増加させ、APDSと同様の機序で免疫不全症の原因となっているならば、患者リンパ球において AKT/mTOR/S6 経路の異常な活性化が誘導されているものと考えた。

そこで、PTEN 変異患者と PIK3CD変異による APDS 患者のリンパ球における、

AKT Ser473（pAKT）、mTOR Ser2448（pmTOR）、リボゾーマル蛋白S6 Ser235

およびSer236(pS6)のリン酸化を解析し、正常コントロールと比較することとした。

第２節対象と方法

（１）対象

PTEN変異患者は、前々章で同定した２名の免疫不全症患者(P1, P2)に加え、前章で解析した免疫不全の病歴をもたない家系Cに示す患者P3、P4を対象とした。

PIK3CD変異をもつAPDS患者は、第２章で同定されたPIK3CD E1021K変異をもつ2例(P5、P6)と、PIK3CD E525A変異をもつ家族患者3例(P7〜P9)の解析を行った。

健常コントロールは、患者の健常な家族および健常成人とした。検体は末梢血

5~15mlを採取した。全例で文書による同意を得て検体を採取した。

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（２）フローサイトメトリーによるAKT（Ser473）リン酸化解析

採取した末梢血はLymphoprep^TM (Axis-Shield、Oslo、Norway)を用いた比重遠心法により末梢血単核球 (PBMC)に分離した。細胞を２回洗浄し、RPMI-1640メディウム(Gibco, Carlsbad, USA)に2×10⁴cells/mlの濃度でPBMCを懸濁した。細胞懸濁液を等分にわけ、一方にはp110δ阻害薬であるIC87114を10μM添加し、抗CD3 抗体(BD Pharmingen, San Diego, USA)および抗CD19抗体(BioLegend, San Diego, USA)を加え 20 分 37℃ でインキュベートした。その後 Cytofix Buffer(BD Pharmingen)を用いて細胞固定を行った。固定後、PERMⅢ buffer(BD Pharmingen) で懸濁して氷上 30 分間インキュベートして細胞膜透過処理を行い、抗リン酸化 AKT(Ser473)-Alexa Fluor 647色素結合抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)で細胞内染色を行った後、フローサイトメトリーで解析した。

（３）ウエスタンブロッティングによるリン酸化解析

採取した末梢血は、前章と同じ方法で細胞を調整し、活性化リンパ球を作成した。

得られた活性化リンパ球から前章と同じ方法でタンパクを抽出し、一次抗体としてラビットモノクローナル抗リン酸化 AKT 抗体(Cell Signaling Technology, Danvers, USA)、ラビットモノクローナル抗AKT抗体(Cell Signaling Technology)、ラビットポリクローナル抗GAPDH抗体(Abcam, Cambridge, USA)、ラビットモノクローナル抗リン酸化S6抗体(Cell Signaling Technology)を用いてウエスタンブロッティングを行った。

（４）マルチプレックスアッセイによるリン酸化解析

採取した末梢血は、前章と同じ方法で細胞を調整し、活性化リンパ球を作製した。

得られた活性化リンパ球 1×10⁶ cells に対し、MILLIPLEX MAP kit(Millipore, Billerica, USA) 細胞融解バッファーにプロテアーゼインヒビターカクテル(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)とフォスファターゼインヒビターカクテル (Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany)を添加し調整した溶液を100μl加え、細胞を溶解した。得られた細胞溶解液は、4℃で10分間、12,000rpmで遠心し、

フィルターを通して不純物を取り除いたのち回収した。回収した蛋白は、Luminex

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の発現を測定し、各検体内在性コントロール蛋白 GAPDH の発現で標準化した値を比較検討した。

（５）統計解析

すべてのデータは、Studentのt検定、Welchのt検定、またはPeasonのカイ二乗検定による解析を行い、平均値±標準誤差により表示した。

第３節結果

CD19陽性B細胞において、フローサイトメトリーによるAKT（Ser473）リン酸化解析を行ったところ、PTEN変異患者から分離した細胞では、健常コントロールの細胞と比較して、定常状態でpAKTのリン酸化が亢進していた(図6)。PIK3CD遺伝子E1021K変異およびE525A変異をもつ患者から分離したB細胞においても、同様の所見を得た(図６)。この pAKT の上昇は、PTEN変異患者細胞では p110δ阻害薬を加えることで正常化したが、健常コントロール細胞では p110δ阻害薬添加による変化はみとめられなかった（図６）。PIK3CD 変異患者細胞においては、臨床症状の軽いE525A変異患者P8においてはp110δ阻害薬添加による有意な変化は検出されなかったが（データ示さず）、それ以外の患者ではp110δ阻害薬を加えることでリン酸化の亢進が正常化した。

活性化T 細胞を用いたウエスタンブロッティングでは、AKTタンパクの発現は、

健常人および PTEN変異患者、PIK3CD変異患者で同等であった。しかしながら、

pAKT の発現は、全ての PTEN 変異患者(P1～P4)で健常コントロールと比較して著明に亢進していた(図7)。PIK3CD変異患者の活性化T細胞においても、E1021K変

異、E525A変異ともに pAKT 発現は亢進しており、これは既報と同様の結果であっ

た^{1) 2)}。活性化T細胞におけるpS6の発現についても、全PTEN変異患者(P1〜P4)

で亢進していた(図７)。

活性化T細胞を用いたマルチプレックスアッセイでは、全ての PIK3CD変異患者におけるpAKT、pmTOR、pS6の発現は、コントロールと比較して亢進していた（図 8-1、8-2）。PTEN 変異患者においては、免疫不全症をもつ P1 の pAKT、pmTOR、 pS6の発現は、コントロールと比較して有意に亢進していた。同じく免疫不全症をもつP2では、pmTOR、pS6の発現は、コントロールと比較して有意に亢進しており、

(19)

pAKT の発現では有意差は認めないもののコントロールと比較して高い傾向にあった。免疫不全症を認めないP3、P4では、P3におけるpAKTの発現はコントロールと比較して有意に亢進しており、それ以外についても有意差は認めないものの、患者において高い傾向にあった（図8-1、8-2）。

第４節考察

以上の結果から、PIK3CD の機能獲得変異と同じように、PTEN の機能喪失変異患者のリンパ球においても AKT/mTOR/S6 シグナル伝達経路の異常な活性化を生じていることが確認された。このことから、PTEN 変異患者においては、PIK3CD 変異患者と同様の機序で免疫不全症が引き起こされていると推測された。

第５節結論

PTEN 変異患者リンパ球では、PIK3CD 変異患者リンパ球と同様に、 AKT/mTOR/S6経路の異常活性化をみとめた。

(20)

第６章 PTEN変異患者とPIK3CD変異患者の免疫学的検討

第１節背景

前章で PTEN 変異患者では PIK3CD 変異患者と同様にリンパ球における

AKT/mTOR/S6 シグナルの異常な活性化を見出した。これが APDS と同様の機序で

免疫不全症を引き起こしていると考えられたが、PTEN変異患者における免疫学的解析の詳細な報告は存在せず、APDSとの免疫学的所見の異同の詳細は不明である。

そこで、免疫不全症をもつ PTEN 変異患者の臨床症状および免疫学的評価を行い PTEN変異患者とPIK3CD変異患者の異同点を明らかにすることとした。

それぞれの患者の主治医および診療録から臨床情報の入手を試みた。

また、患者末梢血リンパ球の表面マーカー染色によりリンパ球分画を詳細に検討し、

比較検討することとした。

さらに、正常な T 細胞新生能、B 細胞新生能を評価するために、T-cell receptor excision circles (以下 TREC) (単語・略語説明 30 ページ参照) 、signal joint kappa-deleting recombination excision circles (以下sjKREC) (単語・略語説明28ページ参照)について、我々が以前開発した T 細胞、B 細胞の新性能測定法を用いて解析をすることとした^{21), 22)}。TRECはT細胞新生能を、sjKRECはB細胞新生能をそれぞれ反映するため、この測定値を用いて患者のリンパ球新生能を評価することができる。

得られた結果を比較することで、PTEN機能不全による免疫不全症と PIK3CD 機能獲得変異によるAPDSの類似点、相違点を明らかにすることとした。

第２節方法

（１）対象

PTEN 遺伝子変異患者 4 名(P1～P4)および PIK3CD 変異患者 5 名(P5～P9)より EDTA加末梢血3～5mlを入手した。健常コントロールは、健常な家族または健常成人で同意を得られた７名とした。全例文書による同意を得て検体を採取した。

(21)

（２）臨床情報

患者の主治医および診療録から、後方視的に臨床情報を得た。

（３）細胞の調整

得られた末梢血検体を1×Lysis Buffer (BD, Franklin Lakes, USA) と混合し、室温で15分間静置することで赤血球を溶解した。溶解後、室温で1700 rpm、5分間遠心し、細胞上清を廃棄することを2回繰り返し、末梢血由来顆粒球および単核球を得た。

（４）フローサイトメトリーによるリンパ球サブセット解析

（３）で得られた細胞を氷上でRound Bottom Tubes (BD, Franklin Lakes, USA) に加え、フローサイトメトリー用の抗体を用いて20～25分間反応させて染色した。

抗体は、FITC、PE、 PC5、 Per-CP、またはAPCでラベルされたanti-CD3 (clone:

SK7, BD)、 anti-CD4 (clone: LeuTM-3a+3b, BD) 、anti-CD8 (clone: Leu-2a, BD,)、 anti-CD16 (clone: Leu-11c, BD)、 anti-CD19 (clone: J4.119, Beckman Coulter, Inc.

Brea, USA)、 anti-CD21 (clone: BL13, Beckman Coulter, Inc.)、 anti-CD24 (clone: ALB9, Beckman Coulter, Inc.)、 anti-CD25 (clone: 2A3, BD)、 anti-CD27 (clone: 1A4CD27, Beckman Coulter, Inc.)、 anti-CD38 (clone: HB7, BD)、 antiCD56 (clone: N901, Beckman Coulter, Inc.) 、 anti-CD127 (clone:

HIL-7R-M21, BD)、 anti-CD45RA (clone: L48, BD)、 anti-CD45RO (clone: UCHL1, BD)、 anti-TCR V alpha24 (clone: C15, Beckman Coulter, Inc.)、 anti-TCR V beta 11 (clone: 56C5.2, Beckman Coulter, Inc.)、 anti-IgD (clone: BD)、 anti-IgM (clone: IA6-2, G20-127, BD)を用いた。細胞を染色後、フローサイトメトリー (FACS caliber および FACS verse, BD) を用いて解析した。

（５）リアルタイムPCRによるTREC、sjKRECの測定第２章の方法に従い、genomic DNAを抽出した。

我々の既報に基づきプライマーと蛍光標識プローブを作製し、リアルタイム PCR (単語・略語説明 30 ページ参照) による TREC、KREC および内在性コントロール

(22)

タンダードサンプルの段階希釈系列の増幅曲線から作製される検量線をもとに算出した。PCRは、Light Cycler 480 II(Roche, Basel, Schweiz)を用いて、50℃ 2分、

95℃ 10分の初期ステップの後、40サイクル (95℃ 15秒、60℃ 1分）で実施した。

リアルタイム PCR で得られた TREC、sjKREC および RNaseP の測定値は、1

µgDNA あたりに換算して最終的な定量値とし、定量値 1.0x10²未満を陰性とみなし

た。

第３節結果

本研究第２章にて見出されたPIK3CD変異による5名のAPDS患者の臨床所見の特徴は表２に示した。また、PTEN変異をもつ免疫不全症患者2名および免疫不全症のない家族性CS患者2名の臨床的特徴は表３に示した。さらにこれらの患者における免疫学的所見を表４に示し、免疫不全症を伴う患者に共通する所見を表５にまとめた。

反復感染をPTEN変異患者では全例、PIK3CD変異患者では80%に認めた。リンパ組織腫脹はどちらの患者も全例で伴っていたが、リンパ腫を合併した患者は今回解析した中には存在しなかった。高IgM血症を伴っていた患者はPTEN変異では2例中1例、PIK3CD変異では5例中2例であり、低IgG血症を伴っていた患者はPTEN 変異患者・PIK3CD 変異患者とも１例（それぞれ 50%、20%）であった。末梢血リンパ球の解析では、リンパ球数の減少が PTEN 変異患者、PIK3CD 変異患者とも 1 例で認められ、T細胞のCD4陽性細胞、CD8陽性細胞の比率の逆転がそれぞれPTEN 変異患者の１例、PIK3CD変異患者の2例で認められた。

PET (単語・略語説明28ページ)はAPDS患者においてグルコース取り込みの増加を見出しリンパ組織増殖の検出に有用であることが報告されており ²⁾、P1(PTEN 変異患者)およびP6(PIK3CD E1021K変異患者)にて評価を行いその所見を比較した。

図9に示したように、全身性のリンパ組織腫脹を反映するグルコース取り込みの増加が、両患者とも頸部、腋窩、および腹腔内リンパ節と脾臓で検出され、同様のリンパ組織の腫脹を反映しているものと考えられた。

PTEN 変異患者では、全患者において、TREC および sjKRECは正常であった。

PIK3CD変異患者では、sjKRECは全患者正常であったが、TREC低値を示す患者が存在した。P5、P6、P8はTREC陰性sjKREC陽性であった(図10a、表6)。さらに、

(23)

P5は5歳時にはTREC正常であったが、8歳時には陰性になっていた(図10c)。P7、 P8、P9は同じPIK3CD E525A変異を持つ家族患者であるが、最年長のP8のみTREC が陰性であった(図10b、表6)。

第４節考察

PTEN変異患者の臨床症状は、APDS患者と臨床症状、リンパ球サブセットとも類似点が多いことが判明した。

また、PIK3CD変異によるAPDS患者は年齢を経るとTRECが低下していくことが予想されたことから、PTEN 変異にともなう免疫不全症患者の TREC 値についても同様の経過をとる可能性があると思われた。PTEN 変異患者の TREC 値については、さらに経過を追い評価すべきであると考えられた。

第５節結論

PTEN変異に伴う免疫不全症の臨床症状は、PIK3CD変異に伴うAPDS に類似点が多いことが判明した。

(24)

第７章総括

今回、PTEN 変異をもつ 2 名の免疫不全症患者(P1、P2)を見出した。これら 2 名の患者の臨床症状は APDS 患者の表現型に酷似していた。両変異患者とも、繰り返す感染症と全身性のリンパ組織腫脹を認め、P1はリンパ球減少、CD4/CD8比の逆転、

高IgM血症を伴い、P2は低IgG血症のため当初CVID（単語・略語説明27ページ参照）と診断されていた（表3）。

APDSはPIK3CD変異またはPIK3R1変異によるPI3Kの機能亢進により発症す

る^{1), 2)}。PTENはPIP3をPIP2に変換する^{9), 10)}。対照的に、PI3KはPIP2をPIP3

に変換する¹⁾。このように、PTENもPI3K もPIP3 を介したシグナル伝達に関わるため、PTEN 機能喪失変異が APDS 類似の免疫不全症を発症させる可能性は十分に考えられた(図 11)。そのため、リンパ球の AKT/mTOR/S6 シグナル伝達経路の評価をこれら4名のPTEN機能喪失変異患者で行い、P1、P2の2名のPTEN変異患者ではAPDS患者と同様にAKT、mTOR、S6のリン酸化が亢進していることが確認された。すなわち AKT/mTOR/S6 経路の異常な活性化を示していると考えられた。さらにP1およびP2は、exome解析でPIK3CD、PIK3R１、その他免疫関連遺伝子に病的変異のないことが確認されていた。以上から P1 と P2 の免疫不全症の原因は PTEN変異であり、PTENの機能喪失変異が APDS 類似の機序で免疫不全症を引き起こしたと考えられた。

PTEN 遺伝子変異によりその機能が損なわれると、巨頭症や多発性の過誤腫を引き

起こし、甲状腺、子宮、乳腺等に良性・悪性の腫瘍を発症するリスクが高くなることが知られており、このような病態を PTEN 過誤種症候群 (単語・略語説明 28 ページ)とよぶ ¹²⁾。しかし、PTEN 変異患者が APDS 様の免疫不全症、APDS-like immunodeficiency (APDS-L)をも発症するということは、今回我々が初めて見出した

（図12）。

免疫不全症のないPTEN変異患者(P3、P4)においても、免疫不全症のある PTEN 変異患者(P1、P2)と同様にリンパ球における異常な AKT/mTOR/S6 経路の活性化が認められた。それにも関わらず、一部の PTEN 変異患者で免疫不全症を伴っていない理由は不明であるが、以下の２つの可能性を推測している。まず第1に、PTEN変異に伴って発症する免疫不全症は、不完全浸透である可能性がある。第2に、同家系

(25)

である P3、P4 のもつ PTEN 変異が免疫不全症に関連しない変異であるという可能性である。これらを解明するためには、PTENの機能喪失変異に伴う免疫不全症患者のさらなる解析と臨床情報の蓄積が必要である。

(26)

第８章結論

PTEN変異による原発性免疫不全症APDS-Lを発見した。

APDS-L 患者の免疫学的所見は APDS 患者に類似しており、患者リンパ球では

APDSと同様にAKT/mTOR/S6の異常なリン酸化亢進が認められた。

(27)

謝辞

本研究を行うにあたり、全般にわたりご指導を賜りました防衛医科大学校小児科学講座野々山恵章教授に謹んで感謝申し上げます。また、ご指導賜りました先生方、

貴重な症例をご紹介くださった先生方、そして検体採取にご同意くださいました患者様およびその保護者の方々に心より感謝いたします。

防衛医科大学校小児科学講座関中佳奈子先生

加藤環先生関中悠仁先生座波清誉先生賀佐希美子様冨田香織様

東京医科歯科大学小児・周産期地域医療学講座今井耕輔先生

東京医科歯科大学小児科学講座森尾友宏先生葉姿汶先生満生紀子先生岡野翼先生高島健浩先生金兼弘和先生高木正稔先生広島大学小児科学講座

小林正夫先生岡田賢先生浅野孝基先生隈病院外科

小林薫先生かずさDNA研究所

岐阜大学小児科学講座

加藤善一郎先生大西秀典先生静岡こども病院免疫アレルギー科

木村光明先生滋賀医科大学小児科学講座

丸尾良浩先生國津智彬先生京都大学腫瘍生物学講座

小川誠司先生吉田健一先生

名古屋大学小児科学講座小島勢二先生

奥野友介先生村松秀城先生東京大学医科学研究所ヒトゲノム解析センター宮野悟先生

白石友一先生千葉健一先生

田中洋子先生 Division of Allergy and Immunology,

Boston Children’s Hospital

Ms. Nicole Luche 昭和大学藤が丘病院小児科

(28)

単語・略語説明 AKT:

セリン/スレオニンキナーゼでありProtein Kinase B(PKB)の別称。細胞外刺激により、PI3Kなどのキナーゼを介して活性化されリン酸化AKTとなり、細胞死、細胞増速などのシグナルを伝達するシグナル伝達物質である。過剰活性化はさまざまな悪性腫瘍の病因となる。

APDS: Activated PI3 kinase delta syndrome

2012 年に初めて発見された原発性免疫不全症候群。原因遺伝子は PIK3CD、 PIK3R1。PI3Kを構成するサブユニットの一つ、p110δの機能獲得変異により発症する。反復性下気道感染症、肝脾腫、多発性リンパ節腫脹、CD4 陽性リンパ球の減少、クラススイッチしたメモリーB細胞の減少などを特徴とする。

BRRS: Bannayan–Riley–Ruvalcaba syndrome (Bannayan–Riley–Ruvalcaba 症候群)

まれな過誤腫疾患で、多発性皮下脂肪腫、大頭、血管腫を生じる。常染色体優性遺伝形式をとるが、散発例も報告されている。

CD: cluster of differentiation（クラスター分類）

白血球やその他の細胞が細胞表面に発現している、糖タンパクなどでできたさまざまな分子（表面抗原）。この分子の違いにより、細胞の違いを詳細に識別することができる。

CS: Cowden syndrome（Cowden症候群）

消化管ポリポーシスが発症する常染色体優性遺伝形式をとる疾患。顔面小丘疹、四肢角化性丘疹、口腔粘膜乳頭腫などを併発し、乳腺、甲状腺、泌尿器科腫瘍の合併率が高い。カウデン病、多発性過誤種症候群ともよばれる。

(29)

CVID: common variable immunodeficiency（分類不能型免疫不全症）

抗体産生異常を主体とする先天性免疫不全症。B 細胞数は正常から低値で多彩な臨床症状を呈し、未だに原因が不明という点から暫定的に分類された疾患群である。25,000〜66,000人に１人発症し、原発性免疫不全症の中で最も発症頻度が高い。

de novo変異

親から受け継いだ遺伝子変異ではなく、ある個体において新しく発生した遺伝子変異のこと。生殖細胞(精子または卵子)における突然変異や、胚形成早期の受精卵それ自体に生じた突然変異。

Exome解析

DNA の塩基配列のうち、Exon 部分のみを網羅的に捕捉するプローブを用いて、Exon部分のみに断片化されたDNAを抽出し、このExon部分配列のみを、

次世代シークエンサーにより網羅的に解析する実験技術。

ヘテロ接合型変異

両親から受け継いだ一対の対立遺伝子のうち、片方の対立遺伝子のみで変異を認め、異なる種類の遺伝子を受け継いだ場合のこと。

HGVD: Human Genetic Variation Database （日本人変異データベース）

2013 年 11 月から公開されている、日本人のゲノム情報データベース。既知変異データベースに含まれていない、日本人特異的な変異を多く含む。

複合免疫不全

T細胞の数または機能の異常により、細胞性免疫不全症を呈する疾患。T細胞機能不全があれば、B 細胞による適切な抗体産生も障害されるため、液性免疫不全も合併する。

(30)

機能獲得変異

遺伝子変異の結果、遺伝子産物が構造変化することによって、生理状態ではみられない新しい機能を獲得すること。

機能喪失変異

遺伝子変異の結果、遺伝子産物が構造変化することによって、その機能が失われる変異のこと。

KREC: kappa-deleting recombination excision circle

B 細胞の発生過程において、重鎖の有効な遺伝子再構成ができると、次にκ 鎖の再編成が始まる。その際κ鎖のVJ再構成が無効の場合、そのκ鎖を発現させないためにκ鎖定常領域の Cκを含む領域が染色体から切り出される。この切り出された環状DNAがsignal joint (sj)KREC、染色体内に残存した部分が coding joint (cj)KRECである。

PET: positron emission tomography（陽電子放射断層撮影）

陽電子検出を利用したコンピューター断層撮影技術。糖代謝レベルの上昇を検出することにより、中枢神経系の代謝レベルの観察や、腫瘍の診断などに利用されている。

PTEN hamartoma syndrome (PTEN過誤腫症候群)

PTEN 遺伝子の変異によって発症し、過誤腫の発症を特徴とする。常染色体優性遺伝形式をとる。CS、BRRS、PS、Proteus様症候群のうち、PTEN遺伝子の変異が確認された患者が含まれる。

PID: primary immunodeficiency disease（原発性免疫不全症）

先天的に免疫系のいずれかの部分に欠陥がある疾患の総称。後天的に免疫力が低下するHIV感染症などに伴う後天性免疫不全症症候群とは区別される。

(31)

PIP2: Phosphatidylinositol 3,4-bisphosphate（ホスファチジルイノシトール 3,4-ビスリン酸）

細胞膜に微量に存在する構成成分の一つ。細胞内シグナル伝達に関する分子で、ホスファチジルイノシトールのイノシトールの 3,4 位 OH 基がリン酸エステル化された化合物。

PIP3: Phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate（ホスファチジルイノシトール 3,4,5三リン酸）

PIP2がリン酸化されて生じる細胞膜にある化合物。AKTなどに代表されるさ

まざまなタンパク質を集合させ、下流シグナル伝達経路を活性化させるセカンドメッセンジャーとしての機能をもつ。

PI3K: Phosphatidylinositol 3-kinase（ホスファチジルイノシトール3—キナーゼ）

各種成長因子、サイトカインあるいはインスリンなどに活性化され、細胞質から細胞膜へと移動して、3,4-イノシトール２リン酸(PIP2)を活性型の3,4,5-イノシトール３リン酸(PIP3)に変換する。リンパ球では、p110δと p85αから構成されるPI3Kδが主に発現している。

mTOR: mammalian target of rapamycin

セリン/スレオニンキナーゼの一種。細胞内シグナル伝達に関与する。インスリンや他の成長因子、栄養・エネルギー状態、酸化還元状態など細胞内外の環境情報を統合し、転写、翻訳などを通じて、それらに応じた細胞のサイズ、分裂、生存などの調節に中心的な役割を果たす。

Proteus like symdrome(プロテウス様症候群)

PSの診断基準は満たさないものの、PSの臨床的特徴を顕著に示す患者。

(32)

PS: Proteus syndrome（プロテウス症候群）

手または足の巨大発育、四肢非対称、足底過形成、血管腫、リンパ管腫、表皮母斑、大頭、骨化過剰および長官骨の過度成長によって特徴づけられる過誤腫性症候群。

リアルタイムPCR

ポリメラーゼ連鎖反応 (PCR) 増幅産物をリアルタイムにモニタリングする解析技術。PCRにより1サイクルごとにDNAが2倍になっていく増幅の様子を蛍光により検出し、増幅曲線からDNAの定量を計算する。

S6: ribosomal protein S6 （リボソーマル蛋白S6）

細胞質リボゾームの40Sサブユニットの構成タンパク質。p70S6キナーゼの基質であり、成長因子やマイトジェンなどによるシグナル伝達でp70S6キナーゼの活性化が生じてS6のリン酸化を誘導し、タンパク質合成を制御する。

TREC: T-cell receptor excision circle

T細胞受容体遺伝子再構成の過程でゲノムDNAから切り出される環状DNA。一度生成されると、増殖せず、細胞分裂に伴い希釈されるため、T 細胞新生能を反映する。複合免疫不全症では責任遺伝子ならびに表現型は異なるものの新生T細胞数の低下という共通した特徴を有するため、TRECsの欠損あるいは減少を呈する。

(33)

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(36)

図1 PTEN変異およびPIK3CD変異を持つ患者家系図

黒の四角および丸は、変異が確認または予想される患者を示す。P1-P9 は本文中の各患者を表す。

(37)

図2 患者P1のexome解析データの解析アルゴリズム

全単一塩基変異と挿入欠失変異データの解析を行った。各フィルタリング段階に記載されている数字は、各段階の候補変異の数である。PTEN 以外に

B3GALT2 と PIEZO2 が最終候補遺伝子となったが、両遺伝子とも免疫系に関

係しないため、疾患発症には関与しないと考えられた。

(38)

図3 P1およびP2のPTEN遺伝子のDNAシークエンス波形矢印が各患者のPTEN遺伝子変異部位を示す。

(39)

図4 P3およびP4のPTEN遺伝子のDNAシークエンス波形矢印が患者のPTEN遺伝子変異部位を示す。

(40)

PTEN/GAPDH 0.11 1.0 0.74 1.0 0.64 0.75 1.0

図5 PTEN蛋白の発現

活性化T細胞抽出蛋白を用いて、PTEN変異患者P1～P4および健常コント

ロールのGAPDHとPTENの発現をウエスタンブロッティングで検出した。

数値は、内因性コントロールであるGAPDHの発現度でPTEN蛋白の発現度を除したものであり、同時に行った健常コントロールの値を1.0とし、各患者の相対値を示している。

(41)

図6 フローサイトメトリーによる細胞内AKTリン酸化解析

患者および健常コントロールにおける、定常状態のB細胞のリン酸化AKT（赤線）と、p110δ阻害薬で処理した時のB細胞のリン酸化AKT（黒線）。横軸は

抗p-Akt抗体による染色の強度を示し、縦軸は細胞数を示す。

細胞数

(42)

p-AKT/AKT 1.0 4.9 1.0 1.4 1.0 1.3 1.2 1.0 2.9 1.0 2.8 1.0 2.3 3.4 4.4

p-S6/GAPDH1.0 2.9 1.0 1.4 1.0 1.1 1.2 1.0 1.5 1.0 1.6 1.0 1.2 1.5 4.9

図7 AKTとS6リン酸化

各患者(P1~P9)および健常コントロール(Ctrl 1, Ctrl 2, Ctrl 3/4, Ctrl5, Ctrl6, Ctrl 7-9)活性化 T 細胞から抽出したタンパクの、リン酸化 AKT(Ser473)

〔p-Akt(S473)〕、AKT、リン酸化リボゾーマルプロテインS6〔p-S6(S235,236)〕、

GAPDHの発現をウエスタンブロッティングで示す。

数値は、リン酸化AKTの発現をAKTの発現度で除したものと、内因性コントロール蛋白 GAPDH の発現度でリン酸化リボゾーマルプロテイン S6 蛋白の発現度を除したものであり、同時に行った健常コントロールの値を1.0とし、各患者の相対値を示している。

(43)

図8-1 P1、P5、P9のAKT、mTOR、リボゾーマルプロテインS6のリン酸化免疫不全症をもつ PTEN 変異患者 P1、PIK3CD E1021K 変異患者 P5、 PIK3CD E525A変異患者P9および健常コントロール活性化のT細胞から抽出したタンパクの、リン酸化 AKT(Ser473)〔p-Akt(S473)〕、リン酸化 mTOR

〔p-mTOR(S2448)〕、リン酸化リボゾーマルプロテインS6〔p-S6(S235,236)〕の発現について、それぞれ内因性コントロール蛋白GAPDH の発現で標準化した値を示す。各検体6~15回の実験を行いその平均を示している。各コントロールの値を1.0とし、各患者の値はコントロールに対する相対値を示す。

(44)

図8-2 P2~P4、P6~P8のAKT、mTOR、リボゾーマルプロテイン S6のリン酸化

免疫不全症をもつPTEN変異患者P2およびもたない患者P3、P4、PIK3CD E1021K変異患者 P6、PIK3CD E525A変異患者 P7、P8および健常コントロール活性化の T 細胞から抽出したタンパクの、リン酸化 AKT(Ser473)

〔p-Akt(S473)〕、リン酸化mTOR〔p-mTOR(S2448)〕、リン酸化リボゾーマルプロテインS6〔p-S6(S235,236)〕の発現について、それぞれ内因性コントロー

ル蛋白 GAPDH の発現で標準化した値を示す。各検体 6~15 回の実験を行いそ

の平均を示している。各コントロールの値を1.0とし、各患者の値はコントロールに対する相対値を示す。

(45)

図 9 18F-fludeoxyglucose を投与した後撮影された P1 および P6 の PET 画像。

a. P1において、頸部、腹腔内リンパ節および脾臓組織へのグルコース取り込み亢進が認められる。

b. P6において、頸部、腹腔内、腋窩リンパ節におけるグルコース取り込み亢進が認められる。

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図10 免疫不全症患者のTREC、KRECの値