はじめに
アポトーシス（プログラム細胞死）は Fas（CD95）のシグナルや、薬剤や放射線による DNA の損傷、増殖因子の枯渇など さまざまな要因により誘導されます。アポトーシスは DNA の断片化と核および細胞の形態変化に至る以前に、ICE ファミリー プロテアーゼの活性化や、ミトコンドリア膜電位の低下などが認められることも明らかにされています。
アポトーシスをフローサイトメトリーで検出する方法として、各DNA 染色による sub-G1 フラクションの検出や、TUNNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）法による断片化 DNA の検出などが知られています。これらはアポトーシスの分子機構に おける中・後期のイベントを見るものです。今日では、このDNA 断片化よりも以前に起こる細胞膜の構造変化を検出する方法 が行われています。 ここでは、アポトーシスの初期段階を検出する Annexin V Kit の測定原理と使用方法のご紹介をいたします。また、断片化 DNA を測定する TUNEL 法の原理もご紹介します。
原理
【Annexin V 】
細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）と結合する蛍光標識 Annexin V と DNA に結合する PI や 7-AAD （膜透過性がない）を用いてアポトーシス細胞を検出する方法です。 ＊ここではPI を使用した例をお示しします。 1. アポトーシスを誘導していない正常な状態の細胞は、細胞膜の内側に膜リン脂質（フォスファチジルセリン PS）が存在して います。また、細胞膜の損傷もないのでPI は細胞内に取り込まれず核内 DNA とは結合しません（図.1 - ①）。 2. 細胞に Fas 抗体または薬剤などを作用させることにより、アポトーシスを誘導させます。 3. アポトーシスの初期の段階では、通常細胞膜の内側に存在する PS が細胞膜表面に露出してきます。この PS と Annexin V は Ca2+ 存在下で結合します。この段階の細胞膜にはまだ損傷が起こっていないため、PI は細胞内に取り込まれず、核 内DNA とは結合しません（図.1 - ②）。 4. 後期のアポトーシス細胞およびネクローシス細胞は、Annexin V と PI の両方に染まります（図.1 - ③）。
図.1 Annexin V 染色原理
核も PS も染まりません PS が Annexin V と結合 核が PI に染まり、 PS が Annexin V と結合 ：蛍光色素 ：Annexin V ：PI ：フォスファチジルセリン（PS）アポトーシスの検出
9
① アポトーシス誘導前 ② 初期のアポトーシス ③ 後期アポトーシス(二次的ネク ローシス)とネクローシスアポトーシス誘導例
アポトーシスの誘導
①
－Fas抗体によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞 試薬： Fas(CD95)抗体（IM1504）：in vitro で CD95 を発現している細胞株のアポトーシスを誘導します。 注： Fas 抗体(IM1504)の濃度は 500μg/mL です。 RPMI 1640 または DMEM FCS 注： RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。Ⅱ. 方法
Fas(CD95)抗体（IM1504 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞を、5×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
2. この培養細胞に対して Fas(CD95)抗体を 100ng/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。 例：培養細胞 20mL Culture に、上記抗体を 4μL 加えます。 3. 37℃、CO2 5.0%で 4～8 時間インキュベートします。 （この反応時間の場合、20%～50%の細胞にアポトーシスが誘導されます。） ＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。
アポトーシスの誘導
②
－薬剤（Actinomycin D）によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞または HL-60 細胞試薬： Actinomycin D-Mannitol （SIGMA #A 5156 など）
ストック溶液：SIGMA #A5156 を Actinomycin D-Mannitol が 1mg/mL になるように蒸留水（無菌にしたもの）に溶解します。 （溶解したものは、遮光をして4℃に保存します。） RPMI 1640 または DMEM FCS 注：RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。
Ⅱ. 方法
Actinomycin D-Mannitol（SIGMA #A 5156 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞または HL-60 細胞を、5×105cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。
アポトーシスの誘導
③
－薬剤（Mitomycin C）によるアポトーシスの誘導－
Ⅰ. 準備
細胞： Jurkat 細胞 試薬： Mitomycin C (SIGMA #M 4287 など) RPMI 1640 または DMEM FCS 注：RPMI 1640、DMEM および FCS は、弊社では取り扱っておりません。Ⅱ. 方法
Mitomycin C(SIGMA #M 4287 を使用する場合）
1. Jurkat 細胞を、2×106cells/mL の濃度に調整し、10%FCS RPMI 1640 で培養します。 2. この培養細胞に Mitomycin C を 1μg/mL の濃度になるように加え、軽く振とうします。 3. 37℃、CO2 5.0%で 12 時間インキュベートします。
（この反応時間で、40%～50%の細胞にアポトーシスを誘導します。） ＊細胞種や培養条件などにより、アポトーシスを誘導する時間は異なります。
2 カラー染色例
Annexin V Kit
【
AnnexinV-FITC kit (PI)
、
Annexin V-FITC/7-AAD Kit
】の場合
アポトーシスの特徴として、良く知られているDNA の特殊なフラグメント化の前に、細胞膜の構造変化が起こります。
通常、膜の内側に存在する膜リン脂質 フォスファチジルセリン（PS）は、膜の構造は保ったままで膜の外部に露出してきます。 露出したPS と Annexin V は、カルシウムイオンの存在下で結合します。アポトーシスの起こった細胞では、Annexin V-FITC の 蛍光は観察されますが、細胞膜の構造は保たれているため、PI/7-AAD は膜を通過できず、DNA とは結合しません。
一方、アポトーシスの後期やネクローシスの場合には、細胞膜の構造が崩壊しているため、Annexin V-FITC と PI/7-AAD の 両方の蛍光が観察されます。また、正常な細胞はいずれの試薬とも反応せず陰性となります。
Ⅰ. 準備
器具： プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など） 試薬： Annexin V-FITC Kit (PI) （IM2375 20T または IM3546 200T） Annexin V-FITC/7-AAD Kit （IM3614 150T）
Ⅱ. 染色方法の流れ：2 カラー染色
【Annexin V-FITC Kit】 【AnnexinV-FITC/7-AAD Kit】
20T 200T 150T アポトーシスの誘導 2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導 細胞の回収、洗浄 メディウムまたはPBS を加え 500g 4℃ 5 分間遠心分離、上清除去 （注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異なります バインディング バッファ－に懸濁 5x105～5x106cells/mL になるように、氷中で冷却した 1x バインディングバッファ＊で再懸濁します 5x106～1x107cells/mL になるように 氷中で冷却した1x バインディング バッファ＊で再懸濁します サンプルの染色 サンプル100μL Annexin V-FITC 5μL PI 2.5μL を添加 サンプル100μL Annexin V-FITC 1μL PI 5μL を添加 サンプル100μL Annexin V-FITC 10μL ７-AAD 20μL を添加 インキュベーション 暗所、氷上、10 分間 暗所、氷上、15 分間 バインディング バッファ－を加える 400μL の 1x バインディングバファ ＊を加えます FCM で測定 FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行い測定します ＊バインディングバッファの代わりに、メディウムにCaCl2（終濃度1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
Ⅲ. セットアップに必要なサンプル
① ： PI 単染色サンプル
②
： Annexin V-FITC 単染色サンプル
③ ： Annexin V-FITC と PI 染色サンプル(測定サンプル)
解析の流れ
解析例
【
AnnexinV-FITC Kit(PI)
】の場合
1.
プロット図の作成
SS / FS のプロット図と生細胞集団を囲むＡゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定をした FL1 / FL4 のプロット図 とゲートなしのFL1 / FL4 のプロット図の二つを作成します。Ungate A Gate Ungate
2.
ネガティブコントロールサンプル
ネガティブコントロールサンプルはPI で単染色したサンプルを用います。Ungate のプロット図で、PI 陽性細胞の感度設定を 行います。また、このPI 陽性サンプルで、FL1 側のネガティブ領域を決定します。 （注）：PI を加えると PI と細胞の非特異的な結合などによりバックグランドが上がります。PI を添加していないサンプルを 用いて FL4 の感度調整を行た場合、PI を添加したサンプルのネガティブ（生細胞）の集団が FL4 軸側に浮き上がっ た状態になりますので注意してください。 Ungate3.
FL4(PI)から FL1 への蛍光補正
ネガティブコントロールサンプル(PI 単染色)を用いて、FL4 から FL1 への蛍光補正を行います。蛍光補正は、PI 陽性細胞が 確認しやすいUngate の FL1 / FL4 プロット図で行います。 Ungate Ungate PI(FL4 ) Annexin V-FITC（FL1） PI(FL4 ) PI(FL4 ) FS INT LIN SS INT LIN 蛍光補正前 蛍光補正後 PI(FL4 ) PI(FL4 )Annexin V-FITC(FL1) Annexin V-FITC(FL1)
Annexin V-FITC（FL1）
4.
FL1(FITC)から FL4 への蛍光補正
AnnexinV-FITC で単染色されたサンプルで、FL1 から FL4 への蛍光補正を行います。
ネガティブコントロールサンプルと違いPI が添加されていないため、PI の非特異的な反応が大きいサンプルでは FL1 の軸 にへばり付いた状態になることがあります。その場合、正確は蛍光補正が行えない事があります。
その時にはAnnxin V-FITC、PI 共に染色したサンプルを用い、A Gate が設定されたデータで蛍光補正を行ってください。
A Gate A Gate
5.
サンプル測定例
サンプル測定例 ： Jurkat 細胞 5x106 cells/mL に対し、Actinomycin D-Mannitol を終濃度 2μｇ/mL になるように加え、 6 時間インキュベートした後に測定したデータです。
Annexin V-FITC(FL1)
A Gate
PI(FL4)
B2: アポトーシス後期(二次的ネクローシス細胞)、 もしくはネクローシス細胞の領域 B4: 初期のアポートーシスの領域 B3: アポトーシスを起こしていない、生細胞の領域 蛍光補正前 蛍光補正後 PI(FL4 ) PI(FL4 )3 カラー染色例（細胞表面抗原とアポトーシス検出）
Annexin V Kit
【
Annexin V-Biotin Kit
】の場合
Annexin V-Biotin を使用することにより、Annexin V-Biotin と結合する蛍光色素を自由に選択することが出来ます。ここでは表面 抗原を2 つの蛍光色素て染色し、Annexin V-Biotin をストレプトアビジン（SA）が修飾された蛍光色素で染色する 3 カラー染色方 法をご紹介します。
Ⅰ. 準備
器具： プラスチックシャーレまたは培養用フラスコ
FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など） 試薬： Annexin V-Biotin Kit （IM2585 20T または IM2586 200T）
蛍光標識ストレプトアビジン 蛍光標識抗体
Ⅱ. 染色方法の流れ：3 カラー染色
【Annexin V-Biotin Kit】
20T/200T アポトーシスの誘導 2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導 細胞の回収、洗浄 メディウムまたはPBS を加え 500g 4℃ 5 分間遠心分離、上清除去 （注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異なります バインディング バッファ－に懸濁 10 5～106cells/mL になるように、氷中で冷却した 1x バインディングバッファ＊で再懸濁します サンプルの染色 サンプル500μL Annexin V-Biotin 5μL を添加 インキュベーション 氷上、5 分間 遠心、洗浄 1x バインディングバッファ＊を500μL 加えて遠心分離、上清除去を 2 回行います 再懸濁 1x バインディングバッファ 100μL で再懸濁します 蛍光標識二次試薬 蛍光標識抗体の添加 蛍光標識ストレプトアビジン（PC7 標識-ストレプトアビジンなど）を規定量添加 細胞表面抗原を同時染色する場合は、蛍光標識抗体を規定量添加 インキュベーション 暗所、室温で30 分間 遠心、洗浄 1x バインディングバッファ＊を500μL 加えて遠心分離、上清除去 再懸濁 1x バインディングバッファ＊500μL で再懸濁します FCM で測定 FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行い測定します ＊バインディングバッファの代わりに、メディウムにCaCl2（終濃度1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
3 カラー（細胞表面とアポトーシス）解析の流れ
3
カラー染色解析例
今回使用した3 カラー染色サンプルは CD5-FITC、CD1a-PE、Annexin V-Biotin/SA-PC7 を用いて測定しました。1.
プロット図の作成
SS / FS のプロット図の感度調整を行い、Ａゲートリージョンを作成します。Ａゲート設定がされた各パラメータのプロット図を 作成し感度調整を行います。Ungate A Gate A Gate
2.
FL1(FITC)から FL2(PE)、FL1(FITC)から FL5(PC7)への蛍光補正
FL1(FITC)から FL2(PE)、FL1(FITC)から FL5(PC7)への蛍光補正を FITC 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate A Gate A Gate A Gate
蛍光補正前 蛍光補正後 蛍光補正前 蛍光補正後
3.
FL2(PE)から FL1(FITC)、FL2(PE)から FL5(PC7)への蛍光補正
FL2(PE)から FL1(FITC)、FL2(PE)から FL5(PC7)への蛍光補正を PE 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate A Gate A Gate A Gate
蛍光補正前 蛍光補正後 蛍光補正前 蛍光補正後 FITC（FL1） PE(FL2) FITC(FL1 ) FS INT LIN Annexin V-PC7（FL5） SS INT LIN FITC（FL1）
PE (FL2 ) FITC（FL1） PE (FL2 ) FITC（FL1） P C 7 (FL 5 ) FITC（FL1） P C 7 (FL 5 ) PE（FL2） FIT C (FL1 ) PE（FL2） FIT C (FL1 ) P C 7 (FL 5 ) PE（FL2） PE（FL2） P C 7 (FL 5 )
4.
FL5(PC7)から FL1(FITC)、FL5(PC7)から FL2(PE)への蛍光補正
FL5(PC7)から FL1(FITC)、FL5(PC7)から FL2(PE)への蛍光補正を PC7 単染色サンプルを用いて行います。
A Gate A Gate A Gate A Gate
蛍光補正前 蛍光補正後 蛍光補正前 蛍光補正後
5.
サンプル測定例
Ungate A Gate A Gate＆B Gate
OverLay Plot Annexin V-PC7 PC7（FL5） FIT C (FL1 ) PC7（FL5） FIT C (FL1 ) PE(FL2) PC7（FL5） PC7（FL5） PE(FL2) CD11a-PE FS INT LIN Annexin V-PC7
SS INT LIN CD5-FITC
：アポトーシス誘導なしサンプル ：アポトーシスを誘導したサンプル
Jurkat 細胞に対して、Actinomycin D-Mannitol を終濃度 2μｇ/mL になるよに加え、8 時間インキュベーションした後 に測定したデータです。
接着細胞染色例
Annexin V Kit
【
Annexin V-Biotin Kit
】の場合
Annexin V-Biotin を使用することにより、PS と Annexin V の反応を好きな蛍光色素を用いることが出来ます。ここでは接着細胞 の染色方法をご紹介します。
Ⅰ. 準備
器具： 24wel プレート ゴム製のスクレーパー
FCM 用サンプルチューブ （PN :6199306、A26428、2523749 など） 試薬： Annexin V-Biotin Kit （IM2585 20T または IM2586 200T）
蛍光標識ストレプトアビジン
Ⅱ. 接着細胞染色方法の流れ
【Annexin V-Biotin Kit の場合】
20T/200T アポトーシスの誘導 2～3 ページなどの方法でアポトーシスの誘導（24well プレートで培養した場合）
Annexin V-Biotin の添加 細胞を培養している培養液500μL に対し、5μL の Annexin V-Biotin を加えます
（注）培地Ca2+の濃度を保つために終濃度1.5mM になるようにバインディングバッファか CaCl 2を加えます。 インキュベーション 5 分以上反応させます。 ＊Annexin V-Biotin は 42℃以上で不安定になるので注意してください。 細胞の回収 培養液中の細胞 プレートに接着している細胞 プレートから剥がれた細胞を含む溶液を回収 プレートに接着している細胞を 1x バインディングバッファ＊（適量）で2 回リンス 1x バインディングバッファ＊を適量（500μL 位） 加 えて遠心分離、上清除去を2 回 （注）細胞によって遠心分離の条件(時間・遠心力)は異な ります スクレーバで細胞を回収 （注）トリプシンやEDTA を用いたハーベスト方法は細 胞とAnnexin V-Biotin の結合を弱め、PS を細胞表 面に誘導する可能性があります プレートから剥がれた細胞溶液とプレートに接着していた細胞をまとめます 遠心し105～106/mL の濃度になるように、1x バインディングバッファ＊で懸濁 蛍光標識二次試薬と PI の添加 蛍光標識ストレプトアビジン（FITC 標識ストレプトアビジンなど）を規定量添加 PI を終濃度 2.5μg/mL になるように加えます インキュベーション 暗所、氷上で15 分間インキュベート FCM で測定 FCM で測定：機器の感度設定、蛍光補正などを行って測定します ＊バインディングバッファの代わりにメディウムにCaCl2（終濃度1.5mM 以上）を加えたもので代用できます。
【MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit （TUNEL 法）】
原理
MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Dirrect /Ⅱは TUNEL 法により、DNA の断片化を指標として、アポトーシスによる細胞死を 細胞個々に検出する試薬です。細胞内の核における断片化DNA の 3’-OH 末端部分に fluorescein-dUTP を結合させることによ り、断片化DNA に特異的な蛍光を検出できます。
図.2
TUNEL法染色原理
■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct
dUTP が FITC 標識されているため、染色の工程が少なく、簡便に染色できます。
■ MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ
dUTP が Biotin 標識されているため、dUTP の検出をするための蛍光色素を自由に選択することができ、好きな染色 の組み合わせを選択できます。
MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct, MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱは株式会社 医学生物学研究所（MBL）で取り扱ってます。
MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Direct ：MBL code 8445、MEBSTSIN Apoptosis TUNEL Kit Ⅱ：MBL code 8441
■MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct FCM 解析データ
Jurkat 細胞を抗ヒト Fas 抗体(クローン CH-11)でアポトーシスを誘導しました。抗体添加２時間後、及び、４時間後に細胞を回収 し、MEBSTAIN Apoptosis TUNEL Kit Direct で染色し、フローサイトメーターで測定しました。
・抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 2 時間後データ ・抗ヒト Fas 抗体によるアポトーシス誘導 4 時間後データ 抗ヒトFas抗体添加濃度 陽性率(%) Untreated 6.2% 20 ng/mL 8.5% 抗ヒトFas抗体添加濃度 陽性率(%) Untreated 6.2% 20 ng/mL 45.4%
FCM 測定
核の断片化 DNA に接合した Biotin-dUTP とFITC-Avidin が結合 DNA の 3’-OH 末端部に Biotin-dUTP が結合FCM 測定
核の断片化 DNA の 3’-OH 末端部 にFITC-dUTP が結合参考文献
1. Vermes,I.,Haanen,C., Reutelingsperger,C.P.M.,“A novel assay for apoptosis：Flow cytometric detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic ceIls using fluorescein labelled annexin
V”,1995,J.Immunol.Methods,180,39-52.
2. Martin,S,J.,Reutelingsperger,C.P.M.,McGahon,A,J.,Rader,J.,van Schie,R.C.A.A., LaFace, D.M., Green,D.R., “Early redistribution of plasma membrane phosphatidylserine is a general feature of apoptosis regardless of the initiating stimulus. Inhibition by overexpression of Bcl-2 and Abl,”1995,J.Exp.Med.,182,1545-1557.
3. Wyllie,A.H.,Kerr,J.F.R.,Currie,A.R.,“Cell death：the significance of apoptosis”,1980, lnterm.Rev.Cytol., 68,251-306.
4. Kerr,J.F.K.,Wyllie A.H., Currie,A.H., “Apoptosis, a basic biological phenomenon with wider implications in tissue kinetics”,1972,Br.J.Cancer,26,239-245.
5. Wyllie,A.H.Morris,R.G.,Smith, A.L.,Dunlop,D.,”Chromalin cleavage in apoptosis：association with condensed chromatin morphology and dependence on macromolecular synthesis,1984,J.Pathol.,142,67-77.
6. Oberhammer,F.A.,Wilson,J.W.,Dive, C.,Morris,I.D.,Hickman, J.A.,Wakeling, A.E., Walker,P.R.,“Apoptotic death in epithelial cells：cleavage of DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation”, 1993,Embo.J.,12,3679-3684.
7. Savill,J.,“The innate immune system：recognition of apoptotic cells. ln：Apoptosis and the immune response”,1996,Ed.,Gregory, C.D.,Willey-Liss,NewYork,p.341-370.
8. Fadok,VA,Voelker,D.R.,Campbell, P.A.S.,Cohen.J.J.,Bratton,D.L.,Henson,P.M.,“Exposure of phosphatidylserine on the surface of apoptotic lymphocytes triggers specific recognition and removal by macrophages”,1992,J.Immunol.,148,2207-2216.
9. Fadok,V.A.,Savill,J.S.,Haslett, C.,Bratton,D.L.,Doherty,D.E.,Campbell,P.A.,Henson, P.M.,”Different populations of macrophages use either the vitronectin receptor or the phosphatidylserine receptor to recognize and remove apoptotic cells”1992,1992.J.Immunol.,149,4029-4035.
10. Diaz,C.,Schroit, A.J.,“Role of translocases in the generation of phosphatidylserine asymmetry”,1996, Journal of Membrane Biology,151,1-9.
11. Verhoven,B.,Schlegel,R.A.,Williamson,P.,“Mechanism of phosphatidylserine exposure,a phagocyte recognition signal on apoptotic T lymphocytes”,1995,J.EXP.Med.,182,1597-1601.
12. van Heerde,W.L.,Degroot,P.G.,Reutelingsperger,C.P.M.,“The complexiy of the phospholipid binding protein annexin V”,1995,Thromb Haemost.,73,172-179.
13. Tait,J.F.,Gibson, D.,Fujikawa,K.,“Phospholipid binding properties of human placental anticoagulant protein-I,a member of the lipocortin family”,1989,J.Biol.Chem.,264,7944-7949.
14. Andree,H.A.,Reutelingsperger,C.P,M.,Hauptmann, R., Hemker,H.C.,Hermens, W.T., Willems, G.M.,“Binding of vascular anticoagulant alpha（VAC alpha）to planar phospholipid bilayers”,1990,J.Biol.Chem.,265,4923-4928.
15. Thiagarajan,P.,Tait,J.F.,“Collagen-induced exposure of anionic phospholipid in platelets and platelet-derived microparticles”,1991.J.Biol.Chem.,266,24302-24307.
16. Dachary-Prigent,J.,Freyssinet,J.M.,Pasquet,J.M.,Carron,J.C.,Nurden,A.T.,“Annexin V as a probe of aminophospholipid exposure and platelet membrane vesiculation：a flow cytometry study showing a role for free sulfhydryl
groups”,1993,Blood,81,2554-2565.
17. Homburg,C.H.E.,de Haas,M.,von dem Borne,A.E.G.Kr.,Verhoeven,A.J.,Reutelingsperger, C.P.M.,Roos,D.,“Human neutrophils lose their surface FcgRIII and acquire annexin V binding sites during apoptosis in vitro”,1995,Blood,85,532-540. 18. Koopman,G.,Reutelingsperger,C.P.M.,Kuijten,G.A.M.,Keelmen,R.M.J.,Pals,S.T.,van Oers,M.H.J., “Annexin V for flow
cytometric detection of phosphatidylserine expression on B cells undergoing apoptosis”,1994,Blood,84,1415-1420. 19. van Engeland,M.,Ramaekers,F.C.S.,Schutte,B.,Reutelingsperger,C.P.M.,“A novel assay to measure loss of plasma
membrane asymmetry during apoptosis of adherent cells in culture”,1996,Cytometry,24,131-139.
20. Castedo,M.,Hirsch,T.,Susin, S.A.,Zamzami,N.,Marchetti,P.,Macho,A.,Kroemer,G.,“Sequential acquisition of mitochondrial and plasma membrane alterations during early lymphocyte apoptosis”,1996,J Immunol.,157,512-521.
21. Berthou,C.,Michel,L.,Soulie,A.,Jean-Louis,F.,Flageul,B.,Dubertret,L.,Sigaux,F.,Zhang, Y.,Sasportes,M.,"Acquisition of granzyme B and Fas ligand proteins by human keratinocytes contributes to epidermal cell defense”,1997,J
Immunol.,159,5293-5300.
22. Van den Eijnde,Boshart, L.,Reutelingsperger.C.P.M.,De Zeeuw,CI.,Vermeij-Keers,C.,“Phosphatidylserine plasma membrane asymmetry in vivo：a Pancellular phenomenon which alters during apoptosis",1997,Cell Death and Differentiation,4,311-316.
23. Wyllie,A.H.Apoptosis（The 1992 Franck Rose Memorial lecture）.1993.Br.J. Cancer,67,205-208. 24. Steller,H.Mechanisms and genes of cellular suicide.1995.Science,267,1445-1449.
25. Mori,C.,Nakamura.N., Okamoto,Y.,Osawa,M.,Shiota,K.Cytochemical identification of programmed cell death in the fusing fetal mouse palate by specific labeling of DNA fagmentation.1994.Anat.＆Embryol.,190,21-28.
26. Moli,C.,Nakamura,N.,Kimura,S.,Irie,H.,Takigawa,T.,Shiota,K.Programmed cell death in the interdigital tissue of the fetal mouse limb is apoptosis with DNA fragmentation. 1995.Anat.Rec.,242,103-110.
27. Krammer,P.H.,Behrmann,I.,Daniel,P.,Dhein,J.,Debatin,K.-M.Regulation of apoptosis in the Immune system.1994.Curr.Opin.Immunol.6,279-289.
28. Gavrieli, Y.,Sherman,Y.,Ben-Sasson,S.A.ldentification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation.1992.J.Cell Biol.,119,493-501.
29. Carbonari,M.,Cibati,M.,Fiorilli,M.Measurement of apoptotic cells in peripheral blood.1995. Cytometry,22,161-167. 30. 辻本賀英、⼑祢 重信、⼭⽥ 武『新アポトーシス実験法-基本操作と最先端の解析法-』 羊土社 84-105
