ジオキサン-水加水分解リグニンの分解におけるラッカーゼの役割について-香川大学学術情報リポジトリ

ジオキサン…水加水分解リグニンの分解における ラッカーゼの役割について

岩 原 章二部，広 瀬 多郁三＊

THE ROIJE OF LACCASEIN THE DEGRADATION OF

DIOXANE−WATER HYDROIJYSIS LIGNINS

ShojiroIwAHARA and Takazo HIROSE＊

Severalmicroorganisms which can grOW On a medium containingFr．A−Ⅰ・−1（ethylacetate

solubleneutraloligOmerS fraction）obtained from dioxane−Water hydrolysis】ignin wereisolated

from soilbyenrichmentculturetechnique”Thesemicroorg■anismspartiallydegradedtheFr・A−Ⅰ−1

Fusarium spいA13was se】ected as best degrader of the fraction amongthese microorganisms・

IJaCCaSeWaS purifiedashomogeneOuS prOteinfromthe mycelium ofFusarium sp・A13・Fr・A」−1

and other fractions of dioxane−Water hydro】ysislignin were partially degraded by the purified

laccaseandin partthesefractionswere polymerizedbythe】accase・

ジオ・キサンー水加水分解リグニン中の酢酸エチル可溶性中性区分，Fr・A−ト1，を唯一の炭素源として生育する微 生物を分離しその分解能について検討した。その結果，2，3の菌株がFI■‖A−ト1を部分的に分解するが完全に分 解する菌株ほ認められなかった。分解能の高い菌株として得た助βαγ宜祝刑SpいA18菌株の菌体からラッカ−・ゼを 分離・精製してその諸佐賀について検討した。その結果，ラッカ−ゼはジオヰサンー水加水分解リグエソから得た各 櫨のリグニソ成分を部分的に分解すると同時にそれらの高分子化をも引き起こすことが明らかとなった。 緒 R 著者らほ前報（1）においてジオヰサンー水加水分解リグエソが凡βαγ宜≠仇属菌により部分的に分解されることにつ いて報告した。また，拘8αγi髄鞘属菌によっては主に低分子畳区分が分解されるが同時に・高分子化も起っているこ とを明らかにした。比較的分子盈の低い成分で酢酸エチル可溶性の中性区分（Fご・・A一ト1）がダ祝βαγ宜％彿属菌によ っては分解されに．くいことも明らかにした。本研究ほFr・A−ト1を唯一・の炭素源として生育する微生物を検索し， 本成分の分解機構を明らかにすることを目的として行ったものである。分離した多くの菌株のうちで助さαγせ≠肋 sp小A13菌株がFr・・A・−ト1をいちじるしく変質させることを見出し，その主原因は本菌の生産するラッカ−ゼに ょるものであると推定するに至ったのでそれらの結果について報告する。 実験材料および方法 1．．培地組成および菌の培養 菌の培養ほ下記の組成の培地を用いてこ行った。試験管（18mmx180mm）に培地2mlを分注し，殺菌後種菌 を斜面培地より1白金耳接種し試験管振とう機上（210r■pm）で280Cに・おいて一定時間培養した。培地組成は，

Fr．A−Ⅰ一11g，NH．NO85g・，K2HPO41g，MgSO4・7H200”5g’，FeSO4・7H2010mg，MnC12・2H205mg，

CaC12・2H2020mg・，CuSO．・5H201mg，脱イオツ水1l，PH6．8である。菌の分離に．は上記培地に．さらに．酵母 ＊現在：野村マイクロ・サイエンス株式会社

香川大学農学部学術報告 第35巻 第1号（1983） 14 エキス5g，ペプトン10g・，グルコ・−ス10gおよび寒天20g／∼を添加した培地を用いた。なお，Fr．A−Ⅰ・−1ほ水に． 不溶であるので培地への添加ほ70％アセトン溶液（10mgノm∼）を調製し，これを培地に添加した。酵素標晶を調 製する目的で菌を培養する場合に．は前報（2）の方法に．従って：行った。 2．菌の分離 本学部周辺の土壌，腐朽木汚水などの試料（14点）約1gを殺菌水10m乙に．懸濁させ，その一滴を培地2mヱに接 種し，8日間280Cに．おいて．振とう培養した。それらのうちで明らかに微生物の生育が認められるものを選びその1 白金耳を新しい培地に按偏し，5日間振とう培養した。この段階で生育サーる微生物はFr・A−ユー・1を堺素源として利 用しているものと考えられるので，平板培養法により菌の分離を行った。その結果，細菌20菌株，かび8菌株を得た。 これらの菌株を実験に．供した。 3．．ジオキサンー水加水分解リグニンの調製 ジオヰサンー水加水分解リグニンは榊原ら（3）の方法に従いブナ材木粉より調製した。本研究においてほジオキサンー・ 水加水分解リグニ∴ンのうち酢酸エチル可溶性の中性区分（Fr．A−ト1）を実験に．供した。本成分の調製法の詳細につ いてはすでに報告し・た（1）。本成分の化学的組成ほ不明であるが，ダイマ・−・およびオ・リゴマ・−・の混合物であると推定さ れる。 4．分離菌によるFr．A−・ト1の分解能の測定 分離した菌株をFr“A・−ト1を含む培地で一発時間培養後，培養液2mZに対↓てジオ・キサン2mZを加え遠心分離 に．より菌体を除去した。得られた上澄液を0、1N塩酸を含む50％ジオヰサソで10倍に凛釈し紫外部における吸収 スペクトルを測定して分解の程度を判定した。 5．イオン化示差スペクトルの測定 培養液ならびに・反応液のイオン化示差スぺクレレは常法に徹って行った。溶媒として50％メチルセロソルブを用 いた。 6り 酵素の抽出ならびに精製 前報（2）で述べたグルコ−スペプトン培地4mZを含む試験管（18mmx180mm）に・斜面培地より1白金耳蔑菌 （Fu8arium sp…A13）を接種し280Cに・おいて24時間振とう培養したものを培地100mlを含む500ml容三角 フラスコへ移植し280Cで回転振とう機上（200rpm）で2日間培養した。菌体をろ過して集め0．1Mリン腰腰衝液 （pH6，．0）で3回洗浄した。得られた菌体約5射こぼば等盈のガラス片を加え乳鉢で磨砕したのら，0．1Mリソ酸緩 衝液（pH6‖0）50mlを加えて遠心分離（12，000rpm，20分）して−無細胞抽出液を得た。この操作をくりかえして 行い無細胞抽出液10り5Zを得て酵素の精妙こ供した。抽出液に60％飽和に達す−るまで固形硫安を加えて24時間放 置後遠心分離により沈殿を除去した。上澄液濫90％飽和に達するまで固形硫安を加えて遠心分離により沈殿を集め 最少最の0．．1Mリソ酸緩衝液（pH6り0）に溶解し，不溶性物質を遠心分離により除去した。上澄液を50倍容の同緩衝 液に対して24時間透析した。得られた酵素液を同感衝液で平衝化したSephadexCト150カラム（4．Oemx74em） に供試した。溶出した酵素活性区分をコロジオソバッグで濃縮し，ひきつづき，同緩衝液で平衝化したSepbadex G−・200カラム（2い6emx60em）およぴSephacryJS−500カラム（2．6emx47em）で順次ゲルろ過を行った。得 られた酵素活性区分をコロジオツバッグで濃縮し0・・01Mリソ酸緩衝液（pH6．0）に対して透析した。透析液を同緩 衝液で平衡化したDEAf：−SephadexA50カラム（1”6cmx6cm）に吸着させ，0．2M食塩を含む0．01Mリン酸 緩衝液（pH6．0）で溶出した。酵素活性区分をコロジオ■ソバッグで約2mlに・濃縮し約200倍容の0。．01Mリソ敢緩 衝液に対して48時間透析して実験檻供した。以上の実験操作は100C以下の低温で行った。 7．SDS−・ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ポリアクリルアミドゲル電気泳動はミツミ科学横幕スラブ・デスク電気泳動装置SJ・−・1060SDH型を用いて行っ た。10％SDSポリアクリルアミドゲル2mmプレ・−ト（10emxlOem）を用い，pH9。5発電流40mAで室温に． おいて2時間泳動を行った。タンパク貿の染色はコマ・岬・ジブ／レーを用いて行った。

8．．酵素活性の測定 ラッカ−・ゼ活性の測定ほ以下のような条件で行った。グワヤコール2／‘mO】，酵素液，リソ酸緩衝液30J‘mOl全 容3．Omolで30分間，300Cで反応させ470nmにおける吸光度を測定してラッカーゼ活性を求めた。酵素活性ほ 470nmにおける吸光度またほunltで示した。1分間に470nmに・おける吸光度を0ル1上昇させるに必要な酵素盈 を1unit とした。 9．タンパク質の定量 タンパク貿の定盈はLowごJy法（4）または280nmに・おける吸光度を測定する方法により行った。 実験結果および考察 1．分雑菌によるFr．A一−ト1の分解 前報（1）においてジオキサソー水加水分解リグニソがダ％きαγ宜％仇属菌に・より分解され，とくに低分子盈区分がよく分 解されるこ．とを報告した。また，酢酸エチル可溶性区分のうち，分子畳の最も高い区分（Fr．A−Ⅰ一−1）が殉βαγ宜％隅 属菌によ、つて：は分解されにくいことを報告した。本研究に・おいては集積培養法に・よりFr．A−・Ⅰ−・1を唯一の炭素源と して生管する微生物を分離して：それらの分解能について検討した。分離菌24菌株ほいずれもFr．A−ト1を唯一の炭 素源とする培地に塵育するが培養液の紫外部に・おける吸光度の減少は微弱であり，Fr．A・−ト・1を完全に分解する菌 株ほ認められず，いずれの菌株においても部分的な分解に・とどまっているものと考えられる。結果の1例をFig・．1に 示した。Fig‖1に示すように，いずれの菌株においても紫外部における吸収スペクトルの変化が微弱ながら認められ るのでFr．A−ト1は部分的に分解されているものと考えられる。これらの菌株のうちでA13菌株（拘βαγ宜％刑属 300 350 400 Wavelength（nm） Fig・．1。Spectr・a】changeS Of culture filtrates ofisolated microor− ganisms

The microorg・anisms were grown on the medium con− taining・Fr．A−・Ⅰ−・1as a sole solユr・ee Of earbon for15days at280C witb shaking．

−：uninnoculated control

−・−： St工ain A−・5

…−−−・ ：Strain A−・23

−一一− ：拘βαγ宜％刑Sp．A18

Fig．2．AEiSpectra ofthe cu】turefi］trates Ofisolated microorgranisms．

Culturalc conditions were the Same aSthosein Fig．．1．

− ：uninnoculated control

−・−：Strain A−・5 ：Strain A−・23

香川大学農学部学術報告 第35巻 第1号（1983）

ひUu再qレOSq可

︵T∈U・工・望一㌫勺

Fig・サ3u UV−SPeC七ralchanges of cuト turefi】trateofFusariumsp．

A13．

Clllturalconditions were the

same as thosein Fig・．．1．

−：uninnoculatedcontrol

：5−days culture −・・−：10−days eulture ＝一一 ：15−days eulture 250 300 350 Wavelength（nm）

Fig」4．，AEiSpectra of the culture fil− trate of Fusarium sp．，A13． Culturalconditions were the Same aS thoseinFig。1。 ＿ ：uninnoculated control ：5・−・days eulture −一一− ：10一・days cu】tuI・e −・−・：15一・days eulture 菌であると考えられる）の培養液の紫外部吸収スペクトルが他の菌株に比較していちじるしく変化していた。また， 培養液の∠￡乞スベクレレを測定したところ椚g．2に示すように・，いずれの菌株においても250nmおよび290nmに おける吸光度の減少が認められる。これはフェノ・−ル性水酸基の減少にもとづくものと考えられる。A13菌株以外の 菌殊に．おいては350nmに．おける吸光度の減少も認められた。A13菌株においては他の菌株と異なり250nmおよび 290nmにおける吸光度の減少がいらじるしく，350nmにおける吸光度の増加が認められた。以後の実験は本菌殊 を用いて行、つた。培養日数にともなう紫外部吸収スペクトルおよび∠e宜スペクトルの変化を測定した結果Fig■・3お よびFig・．4に示すように，培養5日目に．おいては紫外部における吸光度は低下するが培養10日目を過ぎると全波長 域匿おいて吸光度は増加し，とくに810nm付近の吸光度がいちじるしく増大した。∠伍スペクトルは5日培養では 350nmにおける吸光度は減少するがその後いちじるしく増大した。−jiL290nmおよび250nmに・おける吸光度ほ いちじるしく減少した。このことは非共役型のフェノ1−ル性水酸基が減少し，共役型のフェノ−ル性水酸基が増加し

Tablel．，Purification process ofthelaccase Specifie step

v？慧肯enYield（％）

（）

10500 20580 20633 1．0 28 448 10864 25．．4 21 33 4408 133．1 12 19 3410 180．0 6 13 2362 182一．2 3 4 803 200い8 100 Cell−freeXtraCt Ammonlum Sulfate （90％） Sephadex G・−・150 DEAE−Sephadex A−50 SepbaerylS−500 DEAE−Sephadex A−・50 ？U 1 7 1 4 5 2 1 1

ていることを示すものである。本菌株の洗浄菌体および無細胞抽出 液においても同様のスペクトル変化が認められたのでこの反応に．関 与する酵素の精製を試みた。 2．．酵素の分離・精製 A13菌株の無細胞抽出液中に．強いラッカ・−・ゼ活性が認められるこ と，ダ％βαγ宜≠仇Sp∴Ml16・−1菌株から得たラッカーゼの部分精製 標品をF工ノ仙A・−Ⅰ−1に作用させた場合に．もA13菌株の培養液や無細 胞抽出液の場合と同様の∠￡￠スペクトル変化が認められることなど からこの反応に．関与する酵素はラッか−・ゼであると推定される。こ の点を明確に．する目的でラッか−・ゼ活性を指標として酵素の精製を 行った。A13菌株の無細胞抽出液を調製し，硫安塩析，ゲルろ過， イオン交換クロマトグラフイ・−・などに．よりラッか−・ゼを精製した。 精製過程をTablelに示した。Tab】elに示すように，最終精製 酵素の比活性は無細胞抽出液の約200倍に上昇しその回収率は約4 ％であった。本酵素標晶はポリアクリルアミドゲル電気泳動的に．均 一であった。本酵素酵の分子量ほFig小5に示すように．約110，000 と推定された。本酵素の−・般的性質は助βαγト宜眈例Sp．Ml16−1菌 株の部分精製標品（2）のそれらと同様であった。 0 0 654 3 2 21 ︵寸01×︶︶竜虻きL雲コU望○言 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Mobility（cm） Fig■．．5．．Mo］ecularweightdetermination Of thelaccase by SDS−Poly− acrylamide ge】electrophorsis． A，0Va】bumin；B，eatalase；慧 C，albumin；D，Phosphorylase b；E，1acease．でen〝gOf eaeh

proteinwas applied and elec−

trophoresis was carried out at

4mA／cm2atroomtempera七ure for2．5hr． 0 ︵t．∈U・Tて祝︶竜勺 350 400 250 300 350 400 Wavelength（nrn）

Fig・6・A8iSpectralchangeS Ofdioxane−Water hydrolysislignins caused by thelaccase．（a），Fru A一エー1；（b），Fr．B；（c），Fr．C；（d），Fr．E，

−：beforeincubation；−−…−−− ：1−・hrincubation；

香川大学農学部学術報告 第35巻 第1号（1983） 18 3小 甘ー．A・−・ト・1に対する作用 A13菌株を］む・．A−Ⅰ一1を唯一・の炭素源として培養した場合にし、 らじるしいUV一−スペクトル変化が認められ，その変化は主に．ラッ か−ゼの作用によるものであろうと推定した。この点を確認するた め精製酵素をFr．A・−ト1に作用させ作用液の∠g‘スペクトルを測 定した結果，Fig・‖6に示すように禽時間で350nmにおける吸光度 が増加し，その後減少し一定のところで反応は停止する。また，非 供役型■アニノ・−・ル性水酸基に．もとづく800nmおよび250nmにお ける吸光度がいちじるしく減少する。このことはリグニソ分子中 のフェノ・−・ル性水酸基をもった部分がα−カルポニル化合物を経 て分解されることを示すものである。d，∼−・・シリンガレジノールが 助βαγ宜％刑Sp．Ml16・−・1■菌株の部分精製ラッか−ゼ標晶に・よりα− カルポニ・ル化合物を経て分解されることについてはすでに報告く2）し たが，これと同様の変化がFr．A−・Ⅰ−1の場合に．も起っているもの と推定される。つぎK，反応液をSephadexLHl−20を用いて分析し た結果，椚g．．7に示すように一部ほ高分子化していることが明らか となった。低分子愚区分ほ黄色物質でその紫外部吸収スペクトルほ 2，6−ジメトキシ−pベンゾキノンのそれと棋似しており，TLCで 分析した結果2，6一ジメトキシーp−ベンゾキ／ソとRf値が一致する 成分のほか数種の成分が含まれており，それぞれを同定することほ できなかったがこれらはおそらくキノン棋であると推定される。ジ 0 5 0 2 1 1 2uO∞N︶摘むじ已dqhOSq亘 10 20 30 40 50 60 70 Fraction number（5ml／fraction） Fig．7。Gelfiltra七ion ofreaction prod−

ucts produced from Fr．A−11−1 bylaccaseonSephadexLH−20

The rac七ionmixturecontaining 5mgOfFr．．A−・Ⅰ−1andlOO〝g Of laecasein3．．OmlofO小ユMphos−

phate buffer，pH6けO for24h工 at30OCwith shaking

Column size，2．5cmx70cm； flowrate，30mlperhf； elusion，50％ dioxane

”−・” ：incubated without addi− tion oflaeease； M：incubated withlaccase オキサンー・水加水分解リグエソから得た2，3の成分，Fr．．B（低分子 酸性区分），FI・．．C（比較的分子量の高い成分），Fr．E（分子量の最も高い成分）などに対するラッか−ゼの作用につ いて調べた結果Fig．、6に示すように・Fr・．A−・Ⅰ−1に対する作用とほぼ同様の結果が得られた。このようなラッか−ゼ のリグニソに対する作用については木材腐朽菌の菌体外ラッか−・ゼで証明されているが，助8αγL宜髄刑属菌の菌体内 ラッか−⊥ども同様の作用をもっているものと考えられる。リグエソの分解にラッカー‥ゼが重要な役割を果しているこ とについては多くの研究者（卜8〉により指摘されているが，助さαγ宜祝仇属菌においてもラッか−ゼがリグニソの分 解に関与しているものと考えられる。ダ髄βαγ壱％偽属菌に・よるリグニソモデル化合物の分解経路に・おいでアニノ・−ル 酸化酵素が関与していると推定される反応がいくつか知られているが（8￣10〉，おそらくこれらの反応はラッカ−・ゼに・ よるものであると推定される。 引 用 文 献 Vol巾I工，p．195，Boca Raton，Florida，CRC Press，（1981）．． （8）S王王IMADA，M．：Lignin Biodegradation：Mi− Cr・Obio】ogy，Chemistry，and Potential Appli−

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