サーマルシフトアッセイによるカルレティキュリン-糖鎖相互作用解析

(特 別 研 究 費 に 係 る 論 文)

サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に よ る カ ル レテ ィ キ ュ リ ンー

糖 鎖 相 互 作 用 解 析

平 野

真*1,戸

谷

希 一 郎*2

Interactionanalysisofcalreticulinandglycansusingthermalshiftassay

MakotoHIRANO*1,KiichiroTOTANI*2

ABSTRACT:Calreticulin(CRT)hasbeendescribedasalectin-likechaperonethatrecognizes

GlclMangGlcNAc2(GIM9)-glycoproteinsintheendoplasmicreticulum(ER).HoweverwhetherCRT

directlyrecognizesaglycone(proteinportion)ofglycoproteinremainscontroversial.Ourpreviousstudy

demonstratedthatCRTcompetitivelyinhibitedglucosidaseIIactivityagainstahydrophobicsubstratenot

butthatagainstahydrophilicsubstrate,implyingthatCRTrecognizesnotonlyglycanstnlcturebutalso

aglyconehydrophobicity.HeretoinvestigatethepossibilitywepreparedligandsfbrCRT:GIM9-derivatives

withdifferenthydrophobicityontheaglyconeandgraduallydenaturedimmunoglobulinY(IgY),which

harborsGlMgglycan,andanalyzedtheinteractionofarecombinantCRTwiththeligandsusingthermal

shiftassay.TheseresultsdemonstratethatCRTstronglybindstomorehydrophobicGIM9-derivativeand

moredenatUredIgY,clarifyingthatCRTmorestronglybindsmisfoldedglycoprotein,andreverselyreleases

fbldedglycoproteinbydistinguishingthefbldingstatUsofglycoproteinintheERglycoproteinquality

COntrOlSyStem.

Keywords:calreticulin,lectin,glycoprotein,aglycone,thermalshiftassay

(ReceivedSeptember30,2015)

1は

じめ に

タ ン パ ク 質 の 生 合 成 過 程 に お い て 、 小 胞 体 糖 タ ン パ ク 質 品 質 管 理 機 構 は 必 要 不 可 欠 で あ る 。 特 に 、 Calnexin/Calreticulin(CNX/CRT)サ イ ク ル は 、そ の 中 心 機i 構 と し て 、 タ ン パ ク 質 の 正 常 な 折 り畳 み に 寄 与 して い る (1)。CRTは 、 こ の サ イ ク ル に お い て 、 折 り畳 み セ ン サ ー 酵 素UGGT(UDP-Glucose:glycoproteinglucosyltransferase) と 共 同 し 、 新 生 糖 タ ン パ ク 質 上 のGlclMangGlcNAc2 (GIM9)型 糖 鎖 を 認 識 し 、 タ ン パ ク 質 部 分 の 折 り畳 み を 促 進 す る機 能 が 知 ら れ て い る(2-5)。CRTは 、1つ の 糖 鎖 認 識 ドメ イ ン を 有 し 、 そ こ か ら 長 い ヘ ア ピ ン を 伸 張 し、 プ ロ リ ン リ ッ チ な ドメ イ ン を 形 成 す る 。X線 結 晶 構 造 解 析 か ら 、GIM9型 糖 鎖 上 の グ ル コ ー ス(Glc)残 基 が 糖 鎖 認 識 ドメ イ ン と 糖 鎖 と の 相 互 作 用 に 必 須 で あ る こ と が 示 *1:成 膜 大 学 理 工 学 部 物 質 生 命 理 工 学 科 助 教 *2:成 瞑大学 理工学部 物質生命理 工学科 准教授(ktotani@st_{,seikei,ac,jp)} され て い る(6)。 し か し な が ら 、CRTがGIM9型 糖 タ ン パ ク 質 の 糖 鎖 部 分 と タ ン パ ク 質 部 分(ア グ リ コ ン)の 両 方 を 認 識 す る か 、 あ る い は 、 糖 鎖 部 分 の み を認 識 す る の か 不 明 確 で あ る(7-12)。 以 前 の 我 々 の 研 究 に お い て 、 過 剰 量 のCRT存 在 下 、 ア グ リ コ ン 構 造 に 活 性 が 左 右 され な いglucosidaseII(13)が 疎 水 性 の ア グ リ コ ン を 有 す るGIM9型 基 質 よ り も親 水 性 の ア グ リ コ ン を 有 す るGIM9型 基 質 か らGlc残 基 を 切 断 しや す い こ と を 示 し て い る(14)。 こ れ は 、CRTが 疎 水 性 の 基 質 を 捕 捉 し 、glucosidaseIIの 基 質 へ の ア ク セ ス を 阻 害 し て い る こ と 、 す な わ ち 、CRTは 糖 鎖 だ け で な く 、 ア グ リ コ ン の 疎 水 性 度 を も認 識 し て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 折 り畳 み 過 程 で 、 タ ン パ ク 質 は 成 熟 す る に 従 い 、 疎 水 性 の ア ミ ノ酸 配 列 が 内 包 され 、 そ の 疎 水 性 度 が 低 下 す る 。 し た が っ て 、 こ れ ら の こ と か ら 、CRTは 、 未 成 熟 で 疎 水 性 度 の 高 い 糖 タ ンパ ク 質 と 強 く相 互 作 用 し 、 逆 に 、 成 熟 し親 水 性 度 の 高 い 糖 タ ンパ ク 質 と の 相 互 作 用 は 弱 く な る と推 測 され た 。

本稿 で は 、こ の仮 説 の立 証 を題 材 に 、糖 鎖 一レクチ ン相

互 作 用 解 析 に お け るサ ー マル シ フ トア ッセ イ(15)の

有

用性 に つ い て議 論 す る。

2.サ

ー マ ル シ フ トア ッ セ イ

サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ は 、SYPROOrangeと

い う蛍 光

物 質 と リア ル タイ ムPCRの 装 置 を用 い て 、 タ ー ゲ ッ トタ

ンパ ク質 の 変性 温 度 を 測 定 し、 そ の 相 対 的 な 安 定 性 を評

価 す る こ とが で き る手 法 で あ る。 す な わ ち、 タ ンパ ク質

の熱 変性 の過 程 で 、 天 然 で は タ ンパ ク質 の 立 体 構 造 中 に

内 包 され て い る疎 水 性 領 域 が 露 出 す る 。 こ の と き 、

SYPROOrangeは

、露 出 した 疎 水 性 領 域 に特 異 的 に結 合 し、

蛍 光 を発 す る。 この 蛍 光 強 度 の 変 化 をモ ニ タ リン グす る

こ とで タ ンパ ク質 の 変 性 温 度 を測 定 す る こ とが 可 能 とな

る。 こ こで 、 タ ンパ ク質 とそ の リガ ン ド分 子 が 共 存 す る

と、タ ンパ ク質 一リガ ン ド複 合 体 が形 成 され 、タ ンパ ク質

が 安 定化 され るた め 、 リガ ン ドとの 相 互 作 用 の 親 和 性 に

依 存 して タ ンパ ク質 の 変 性 温 度 は 上 昇 す る。 この 変 性 温

度 の 変 化(△Td)を

指 標 と して 、 タ ンパ ク質 一リガ ン ド相

互 作 用 を 評価 す る こ とが 可 能 とな る。 これ ま で 、 サ ー マ

ル シ フ トア ッセ イ は 、創 薬研 究 に お い て 、 比 較 的 親 和 性

の 強 い タ ンパ ク質 一リガ ン ド相 互 作 用 の ス ク リー ニ ン グ

に 用 い られ て き た が 、 本研 究 で は 、 比 較 的 親 和 性 の 弱 い

レ クチ ンー

糖 鎖 の相 互 作 用 に適 用 可 能 か 検 証 す る。 ま た 、

生 体 分 子 の 相 互 作 用 解 析 には 、 等 温 滴 定熱 量 測 定(ITC)

や 表 面 プ ラズ モ ン共 鳴 法(SPR)な

どが 用 い られ て き た。

サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ で は 、 ミ リグ ラム オ ー ダ ー の タ

ンパ ク 質 が 必 要 なITC(16)と

比 較 し、 マ イ ク ロ グ ラム オ

ー ダ ー の タ ンパ ク 質 で 相 互 作 用 を解 析 で き る

_{。ま た 、SPR}

で は 、 た とえ 生 体 内 で は 可 溶 性 の タ ンパ ク質 と して 存 在

して い る タ ンパ ク質 で も 固 定 化 が 必 須 で あ る(17)が

、

サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ で は 、 固 定 化 の 必 要 は な く、 溶

液 状 態 で 相 互 作 用 を解 析 す る こ とが で き る とい うメ リッ

トが あ る。そ こで 、本研 究 で は 、これ らの 利 点 を活 か し、

生 体 内 で は 可 溶 性 タ ンパ ク質 と して 存 在 す るCRTと

、

様 々 な ア グ リコ ン構 造 を もつ 合 成GIM9リ

ガ ン ド、 も し

くは 、 変性GIM9型

糖 タ ンパ ク質 との 相 互 作 用 をサ ー マ

ル シ フ トア ッセ イ に て評 価 し、 そ の 有 用性 を 検 証 した 。

3.CRTと

合 成 リ ガ ン ドと の 相 互 作 用

A 12000 9000 差 、。。。 3000 0 25303540455055 Tノ 。C B400 0 0 0 4 ト ミ ⊃ ﹄ ぱ マ 一800 ・1200 25303540455055 τノ。C Figure1.Determinationofdenaturationtemperature(Td)of calreticulin(CRT》.TheCRTsolution(20μL)inthepresenceof SYPRO⑪Orangedyewasgraduallyheatedfrom25。Cto55。C inareal-timePCRdevice,andthefluorescenceintensitywas monitoredtoobtainmeltcurves(A).Themeltpeaks(B)revealed thattheTdforCRTrangedfrom45.6。Cto45.8。C.Temperature atthelocalminimumsrepresentsTd. 8,12μM)と60x濃 度 のSYPROOrange(Original:5000x) をTris-bufferedsaline(pH7.4)/10mMCaCl2(TBSCa)中 で 総 溶 液 量20pLで 混 和 し、リ ア ル タ イ ムPCR装 置(CFX96, Bio-Rad)に て 、0.20C/10secで 段 階 的 に 温 度 を 上 昇 させ な が ら 、 励 起 光470㎜ を 照 射 し 、570nmの 蛍 光 強 度 を モ ニ タ リ ン グ し た 。 こ れ に よ り得 られ た 曲 線 をMeltcurveと い い 、 こ の 変 曲 点 が 変 性 温 度 を 示 して い る(Fig.1A)。 さ ら に 、 変 曲 点 を 明 確 に す る た め 、 蛍 光 強 度 を 温 度 で 微 分 し た 曲 線Meltpeakを 描 く と 、 そ の 極 小 値 を 変 性 温 度 と し て 求 め られ る(Fig.IB)。 よ っ て 、 こ れ ら の 結 果 か ら 、CRT の 変 性 温 度 は 、45.6-45.8。Cで あ る こ と が 明 ら か と な り、 4μMのCRTで 変 性 温 度 を 評 価 で き る こ と が 示 唆 さ れ た 。 そ こ で 、 続 い て 、 疎 水 性 度 の 異 な る ア グ リ コ ン構 造 を もつGIM9型 糖 鎖 リガ ン ド(GIM9-oH,-Gly-NH2,-Gly-Glu-tBu;Structures,seeFig.2A;Hydrophobicities,seeFig. 2B)を 合 成 し 、CRTと の 相 互 作 用 を サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 評 価 し た 。 こ こ で は 、CRT(4μM)と 各GIM9糖 鎖 リ ガ ン ド(12μM)をTBSCa中 で 混 和 し 、4QCで1時 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、SYPROOrangeを60x濃 度 で 添 加 し 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 供 し た 。 得 ら れ たMeltpeakか ら 、 そ れ ぞ れ の リ ガ ン ド共 存 下 で のCRTの 変 性 温 度 を 算 出 し た(Fig.2c)。 そ の 結 果 、 リガ ン ド非 存 在 下 に 比 べ 、GIM9-oH,-Gly-NH2,-Gly-Glu-tBuの 変 性 温 度 は そ れ ぞ れ 、0.6,1.0,2.OOC上 昇 し た 。 こ れ ら の 結 果 か ら 、CRTと リガ ン ド と の 相 互 作 用 は ア グ リ コ ン の 疎 水 性 度 に 従 っ て 強 く な る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、 比 較 的 親 和 性 の 弱 い レ ク チ ン 糖 鎖 相 互 作 用 に も 、サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ を 適 用 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 され た 。 CRTと リガ ン ドと の 相 互 作 用 を 評 価 す る た め 、 は じめ に 、CRT単 体 で の 変 性 温 度 を サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 導 き 出 し た 。 こ こ で は 、 リ コ ン ビ ナ ン トの ヒ トCRT(4,

A爺

謬

・

唱

課

盤熱 諜

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  R・1-・ ・ 室/N・rへ 馳NH・ O GIM9・OHGIM9・Gly・NH2 B1、C §12 書 塁108 6 4 2 三 8 = 8 。。 o ﹂ 〇 三 ﹂ ) 価 ρ o 昼 o ﹂ 9 = 0  トモ

改 ざ

曝 汽6蛾8

HO ズ ・N▽ へ ・・/＼/"ピNH2 0HCoofBu GIM9・Gly・Glu/Bu 熱 処 理 し 、変 性 度 の 異 な るlgYの 調 製 を 試 み た 。変 性 度 は SYPROOrangeの 蛍 光 強 度 に よ り測 定 し た(Fig.3C)。 こ の 結 果 か ら 、IgYは70。Cで 中程 度 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ で 算 出 し た 変 性 温 度 を 超 え た75。Cで 完 全 に 変 性 し た も の を 調 製 で き る こ と が 示 さ れ た 。 し た が っ て 次 項 の CRTとIgYの 相 互 作 用 解 析 で は 、 未 処 理 のIgYを 天 然 型 、 70。C,750Cで 熱 処 理 し たlgYを そ れ ぞ れ 部 分 変 性 型 、 完 全 変 性 型 と し て 評 価 す る こ と と し た 。 一〇H-Gly-NH2-Gly-Glu-fBu 200 0 0 0 2 冒 ﹂ ﹂ ︾、 ⊃ ﹂ 匡 η , ・400 ・600 LlgandTd[C} -noIigand _,458 ・GlM9-Ofl _、464 -一 一 ・GIM9-Gly・NH2 _,468

一'邑

饗 鵬 野

lll

_.11

3540455055 Tノ 。C Figure2.lnteractionofCRTwithGIM9・derivatives.(A) AglyconestructuresofthesynthesizedGIM9-derivatives.(B) TheaglyconehydrophobicitiesofGIM9-derivatives.The hydrophobicitywasevaluatedbymeasuringthefluorescence intensityofthederivativesinthepresenceofSYPRO(R)Orange. Dataareexpressedasthemean±standarddeviation(nニ3). (C)InteractionofCRTwithGIM9-derivatives.Afteranhour preincubation,themixturesofCRT(4μM)andGIM9-derivatives(121」M)weresubjectedtoTSA(35。Cto55。C). Curvesrepresenttypicalmeltpeaks. A

4.変

性GIM9型

糖 タ ン パ ク 質 の 作 製

次 に 、 実 際 の 糖 タ ン パ ク 質 とCRTと の 相 互 作 用 を サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 検 証 す る た め 、 変 性 状 態 の 異 な るGIM9型 糖 タ ン パ ク 質 の 調 製 を 試 み た 。 モ デ ル と な る GIM9型 糖 タ ン パ ク 質 に は 、 ニ ワ ト リ 由 来 の ImmunoglobulinY(lgY)を 用 い た 。 本 研 究 で 用 い たlgY上 にGIM9型 糖 鎖 が 存 在 す る こ と は 、Fluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis(FACE)シ ス テ ム(18)を 用 い て 確 認 した(Fig.3A)。 ま た 、IgYを 種 々 の 濃 度 で サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 供 し 、IgYの 変 性 温 度 が71.0-71.4QC の 範 囲 に あ る こ と が 示 さ れ た(Fig.3B)。 こ の 結 果 か ら 、 IgYとCRTの 変 性 温 度 は 大 き く 異 な っ て お り、サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 、 こ れ ら の タ ン パ ク 質 が 共 存 して い て もCRTの 変 性 温 度 の 変 化 を 測 定 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、IgYの 変 性 度 が65。C付 近 か ら 大 き く 上 昇 し て い る こ と か ら 、IgYを70、 も し く は 、75。Cで2分 間 C tNPG[ycans tromrgYGUddes PNG。,JF 20 00 80 60 40 20 (會 ω = 2 ε 8 5 器 2 0 ⊇ ﹂ ︺ 盆 〇 三 〇 言 o も 盈 8 薯 3 ω 0 GIM9 ← ← B 4000 2000 0 乞謹 ・2。00 等・4000 ・6000 ・8000   1長 一・ 憩 こ1づ _1協 思[ぜ、惣 21JM.714、1 -一 一・4μM _,714、, 一 一8μM ,712t --16pM ,710 D400 200 0 ミ 卍'2。o琴 一、。。 ・600 ・800 2J「3545556J「758595 了1。C 47075 τ「eatedtemperatureTノ 。C 、 一 〉 ＼ ,な ご 、=.認

》

三縣灘 乱、

、1

_-lgY`!{)C)、462 35 40

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50 55 Figure3.lnteractionofCRTwithaGIM9・glycoprotein, immunoglobulinY(lgY》.(A)Analysisof〈1-glycansonIgY.〈1-GlycancontentoflgYwasanalyzedusingfluorophore-assisted carbohydrateelectrophoresis.TheN-glycansreleasedfromlgY werelabeledwithANDSthroughareductiveaminationand SDS-PAGEd.Bandswereanalyzedusinganimageanalyzer. Theguides,GlM9andM9glycans.(B)DeterminationofTdof lgYTbmonitorthechangesinthefoldingstatusoflgYduring heatdenaturation,lgYwassubjectedtoTSA(25。Cto95。C). ThecurvesrepresenttypicalmeltpeaksoflgY(C)Heat regulationofthedenaturationstateoflgY.Tbpreparedif「erent foldingformsoflgY,lgY(4μM)washeatedattheindicated temperaturesfor2min.SYPRO⑪Orangewasaddedtothe solutionandthesurfacehydrophobicitywasevaluatedby measuringthefluorescenceintensity.Dataareexpressedasthe mean±standarddeviation(n=3).Forsubsequentanalysesof theinteractionofCRTwithlgY,lgYsunheatedandheatedto 70。Cand75。Cwereusedasnative,partiallydenatured,and completelydenaturedforms,respectively.(D)lnteractionofCRT withlgY.Aftera12-hpreincubationofCRT(4μM)andlgY(8 μM)withorwithoutheatdenaturation,themixturewassubjected toTSA(35。Cto80。C).Curvesrepresenttypicalmeltpeaks rangingfrom35。Cto55。C.

5.CRTと

変 性lgYと の 相 互 作 用

参考文献

最 後 に 、CRTとGIM9型 糖 タ ン パ ク 質 モ デ ル と して 、 天 然 型 、部 分 変 性 型 、完 全 変 性 型lgYと の 相 互 作 用 を サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 解 析 し た 。こ こ で は 、CRT(4μM) と そ れ ぞ れ のIgY(8μM)をTBSCa中 に て 混 和 し 、12時 間 プ レ イ ン キ ュ ベ ー シ ョ ン し た 後 、SYPROOrangeを 添 加 し、 サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ に 供 し た(Fig.3D)。 そ の 結 果 、 天 然 型lgY共 存 下 で は 、CRTの 変 性 温 度 に 変 化 が 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、CRTは 天 然 型lgYと は ほ と ん ど 相 互 作 用 し な い こ と が 示 さ れ た 。一 方 で 、部 分 変 性 型 で は0.2。C 上 昇 し 、完 全 変 性 型 で は0.40Cの 上 昇 が 認 め られ た 。 よ っ て 、 タ ン パ ク 質 部 分 の 変 性 度 が 上 昇 す る に 従 っ て 、CRT とlgYと の 親 和 性 が 高 ま る こ と が 示 さ れ た 。 ま た 、タ ン パ ク 質 同 士 の 相 互 作 用 に つ い て も 、 各 々 の 変 性 温 度 が 異 な れ ば 、 サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に て 評 価 す る こ と が 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 し か しな が ら、CRTと 合 成 リ ガ ン ド と の サ ー マ ル シ フ トア ッ セ イ に 比 べ て 、 変 性 温 度 の 変 化 は 小 さ か っ た 。 こ れ に は 、IgYの 濃 度 、GIM9型 糖 鎖 の 含 有 量 、 ま た そ れ ら の バ ラ ン ス の 問 題 が 挙 げ ら れ る 。 す な わ ち 、 本 研 究 で 用 い たlgYに はGIM9型 糖 鎖 は12%程 度 しか 含 ま れ て い な い 。 そ の た め 、CRTの リ ガ ン ド と な り得 るGIM9型IgYの 含 有 量 が 極 め て 低 い と い う問 題 点 が あ る 。 こ れ を 解 決 す る た め 、サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ に お い て 、IgYの モ ル 数 を 増 加 し た が 、CRTのMeltpeakがlgYのMeltpeakに 埋 没 し て し ま い 、CRTの 変 性 温 度 を 測 定 す る こ と が で き な か っ た(datanotshown)。 そ の た め 、 よ り明 確 にCRTの リガ ン ド認 識 に つ い て 、 天 然 型 と 変 性 型GIM9型 糖 タ ン パ ク 質 と の 差 を 検 証 す る た め に は 、 よ りGIM9型 糖 鎖 を 有 す る タ ン パ ク 質 の 含 有 量 を 高 め る 必 要 が あ る と 考 え ら れ る 。 6.結 論

以 上 の こ とか ら、タ ンパ ク質 を リガ ン ドとす る 際 に は 、

タ ー ゲ ッ トとな る糖 鎖 を もつ タ ンパ ク質 の 含 有 量 な ど を

考 慮 す る必 要 は あ るが 、比 較 的 親 和 性 の 弱 い レ クチ ンー

糖

鎖 相 互 作 用 の解 析 に サ ー マ ル シ フ トア ッセ イ を適 用 す る

こ とが 可 能 で あ り、 本研 究 を通 じて 、CRTはGIM9型

糖

タ ンパ ク 質 との 相 互 作 用 に お い て 、 糖 鎖 部 分 だ けで は な

く、 ア グ リコ ン部 分 の 疎 水 性 度 を識 別 す る こ とが 示 され

た。

本研 究 に よ り、CRTとGIM9型

糖 タ ンパ ク質 との 相 互

作 用 に お け るア グ リコ ン認 識 に つ い て 新 た な 知 見 を加 え

る こ とが で き た。

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