Title 強心配糖体ジゴキシンの腎排泄機構に関する研究 ( Dissertation_ 全文 ) Author(s) 岡村, 昇 Citation Kyoto University ( 京都大学 ) Issue Date URL

Title

強心配糖体ジゴキシンの腎排泄機構に関する研究(

_{Dissertation_全文 )}

Author(s)

岡村, 昇

Citation

Kyoto University (京都大学)

Issue Date

1993-03-23

URL

https://doi.org/10.11501/3066223

Right

Type

Thesis or Dissertation

Textversion

author

強 心 配 糖 体 ジ ゴ キ シ ン の

腎 排 池 機 構 に 関 す る 研 究

1

993

目

次

総論の部 緒J 第 lI;'i: 摘出j苗流特によるジゴキシン腎排世機構の解析 . . . 2 第 lffii 摘出潮流刊におけるジゴキシン特訓7t1t学助 . . . 3 第2節 抗不繋脈舟jキニジン、ベラ八ミルとの相五作JH . . • . . . .. . . 11 第3節 P一組1

M

'r1 ft関連薬剤との相互作JlI . . .ー・・ーー・・・・・・・・・・・・・・・・・ 18 第2J~l 経細胞輸送作価系の確立とジゴキシン輸送機構の前lリ

1

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

.

21 第 l節 MDRl cDNAの培養

H

.

l.皮細胞LLC.PKIへの導入 ・・・・・・・・・・・・・ お 第2節 P一緒蛍"1ftを介するステロイドホノレモンの輸送 . . . 31 第3節 経細胞輸送汗価系によるジゴキシン輸送 . . . 36 第4節 細胞からのジゴキシン排1

1

¥ .

.

.

.

.

.

.

.

.

.

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.

.

.

.

.

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.

.

.

.

.

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.

.

.

.

.

.

.

39 郊5節 ジゴキシン体内動態におけるPー梢蛍1'1質の関与 ・・・・ーーー・・・・・・ 42 第3

;

J

'

'L ジゴキシン粁緋池における相互作用子制JIシステムのGif立 ... -.... 制 第1節 ジゴキシンースヒロノラクトン相li作川機構 ... 45 第 2節 ジゴキシンーシクロスポリンA相lii1川機構 ー・・・・・・・・ー・ー・・・・・ 55 結 論 ・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・ 62 謝 砕 ...__..._.._---_..._.._---_.._---・・ 65 実験の部 _...__....__.._-_._---_.._-..._---_._----_..--・ー 66 引用文献 . . . 78

総論の部

給三

強心配的体ジゴキシンは、うつlI(l性心不全や心);}制

1

1

!1Y

r

'

，l[の治的指とし て、占くから臨床的に繁川されている。その

f

1

川機怖は、心筋の

~a + .K+ -A TPase を ISfl?j し、自IIJJ包 IÁJNぶ iC~J_主の 1: 持、ひいてはCJU の流入を 促進し、心筋力をt科大させることにある(1)。しかしその治州峨は0_8・2.0 ng/mlと放く、

'

1

'

，

1

よ域で、は);}本

1

1

1

1

伝導抑;ji!Jに比づく不燃脈で

r

r

の，

r

d

立な:.fljf十 川を引き起こすこと、また体内動態の11~体内、 11~ 体1m 変動が人きいこと から薬物lfi

ぃ

'

l

ìJ!~度モニタリングに J，~づく投，;".没什の必要な代点的薬物で ある(l・3)。その

i

うたる消火紳路は

i

'

V

f

f

J

I

:

討Itで、糸球{本i慮過、以制

1

1

竹分泌、 I呼吸収の寄与が知られているが(2，4・6)、そのJ

T

市"な機構は今く不￨リlであ った。また、キニジン、ベラパミル、スピロノラクトンケ)イ

J

t-川

H

年にジゴ キシンの行制l:illそが低下し、 1(ll'I'

i

創立が

1

:

げ-することが卸(与されており、 臨床上問題となっているが、その相

1

1

:

作)

I

J

機

H

/

i.も全く不1リ

l

であった(7，8)。 これらの機桃解明はジゴキシンの11~ 体内、 fl~1 休日\1 変動を f'

i

W

I

し、イ

i

効か っ安全な投与，没.iI-を行なう 1: で、重要な~地.といえる そてで符1.'は、 ジゴキシンの!??排担任機椛1)((ひ、に相

'

1

:

作川機梢について生物必庁1'やが)f:法、 分子生物乍的 í:11 を応川し、それらの解 I~I をぷみた結果、州細胞の多剤 耐性に関わる輸送系P

一

私I

f

蛍

1

-

'

1'(1を介した機椛をlり!らかにすることができ た。以下、これらについて 3伐にわたり論述する。 -1

-第

1

:

章

摘 出 潜 流

f

f

に よ る ジ ゴ キ シ ン 腎 排 池 機 構

の解析

ジゴキシン(Fig.1)の1-たる消火経路は腎排縦であることは、占くから 以 "".... 本変化体で

7

0

・

8

0

'

*

，封

I

:

j

j

l

t

されることから明らかであった

(

2

)

。 StC InCSSが 1974{Fに初めて、ジゴキシンがbt<紺J1~~分泌、 1 呼吸収を受けるこ とをlリ!らかにして以米(4)、その機構解明を

I

i

的として、多くの研究がな されてきた。分泌については、何らかの輸送システムがイfイヒしているこ とかノJ~II愛されているが、これまでその実体は切らかにされていなかった

(

7

)

。そこで符右はその機椛解明をけ的として、摘/1

H

t

l

i

流行を用いジゴキ シン分泌を検討した。本文験法はさ

i

研究室で開発され、他臓器の影響を 除去し行にのみ焦点を、liてて薬物の腎排前挙動を検討できる、 i謹流i皮革

I

l

1戊を，'，

i

J

lに，没iiiできる、脱出レベルで、の薬物

1

F

t>作動をふ制￨に解析するこ とができる、さらに jポ制II~守分泌における J(Il 被から制脳内への移行過れ!と 細胞内から作舵への移行過料を分離して評価できる守の利点を有してお り、すでにイ

i

機カチオン、有機アニオン性薬物の

I

i

T

F

動を解析する

1

:

で イf川であることがぶされている(9・12)。本立では、摘

l

l

!

i

挫流腎を用い、臓

;

f

R

レベルにおけるジゴキシン作付

:

1

討tI挙動、薬物村

l

'

:

J

什)fJ機構の解明を1試 みた。 O-co Fig. 1. Structure 01 Digoxin，

-2

-at12

↑

j

摘

l

1

1

i

d

i

流行におけるジゴキシン行排刑不動

脱却に従い (9-12) 、 Wistar系b:{~1t ラットイ i 作動 111~，

N

1

t

J

11氏、以竹にカニニ，. レーションを施し、 16・19勾1'・亦IUl球、

S

r;(

BSA

を合むKrebs-Henselclt blcarbonate buffer(KHBB)で、1{ILJf'血統を -liiに維持して地流した (Fig.2)。血管内特有iマーカーとしてエバンスブルー絞殺アルブミン、制l

l

陶外法及び糸球体ihit過マーカーとしてr

'

4

c

l

t

'

，ム殺したイヌリンを川い、 131・I1 似品したジゴキシンと

J

L

に作動脈内から急速投りしれ，1，'(-(1向にl怜脈

i

l

r

W

I

減、

l

ポを採取した。何られた希釈山線を比般することによりジゴキシン 1iT排討It>~動を解析した。 Table Jには本実験における行機能の指杭;として、 1[ll抜ifrt1lt、

J

Jj(

M

、糸 球体ih~過速度及びNa" 、グルコースの l呼吸収ギをノjミした。 ウアベイン共 イ{-ドで

1

A

<

llK の明))11 、、~Íl.びに Na+ ，グルコースの|呼吸収の低下が観然され

た。ウアベインは、 Na+.Kt -ATPase を r~'l ~I;.する(1)ことにより、 Na' 勾配

の{氏ドによるi呼吸収の低ド、 Na+勾配により駆動されるクソレコースの￨呼 吸収の低下、また竹

J

t

!

1

rjlNa +

i

l

!

V

支別加による水の!呼吸収低下、それによ る以 iA の増加を引き起こしたものと~-えられた。 また、テトラエチルア ンモニウム(TEA)イバ

:

f

ドでNa+、グ、ルコース!呼吸収低ドが観然され、-('，:1: のI:j.

1

"t:が

1

1

1

たものと思われる。他の￨但;

i

消リイIイ1.1

'

-

では、これらの仙に変 化がなく、正常な肝機能を紺持していると

J

5

-

えられる。

Fig.3 には摘出if/i 流行からねられる典烈的な希 fJ.! llh*良をぷした。 前JUR~[IJ では、アルブミン、イヌリン、ジゴキシンのそれぞれの行組織移行性に 応じた特徴的なパターンが観然できた。日J[ち、 I(JlW外には分布しないア ノレブミンは、速く

，

.

;

s

いピークを、細胞外被まで、分イ11するイヌリンは、 Jや

-TabJe 1

ExperimentaJ Conditions of the Isolated Perfused Rat Kidney.

Values are means ~ S.O. Numbers in parentheses represent the number of experiments. PFRa UFRh GFRC

FR:-;a+d FRGl♂ (mVmin) (mVmin) (mVmin) (%) (%)

Control (7) 5.18~ 0.63 0.093~ 0.039 0.409 ~ 0.084 94.8~ 3.2 96.9 ~ 1.0 Steady-state condition Quinidine 0.8μM(3) 5.13~ 0.25 0.138~ 0.138 0.498 ~ 0.324 84.5主13.3 97.4土 0.5 Quinidine 8.μM(3) 4.93 ~ 0.62 0.115之0.071 0.379~ 0.133 91.3 ~ 4.7 96.1 ~ 0.6 ..，.. Verapamil 0.8μM(3) 5.15 ~ 0.23 0.094~ 0.029 0.380~ 0.066 92.6~ 6.3 95.7 ~ 3.9 Verapamil8μ，M(3) 5.10~ 0.27 0.082~ 0.050 0.378~ 0.133 95.6~ 1.2 95.4~ 2.3 1EA300μM(3) 5.25 ~ 0.52 0.095~ 0.025 0.322 ~ 0.167 87.2~ 5.5キ 93.3主1.6

“

PAH300μM(3) 5.42 ~ 0.22 0.083 ~ 0.025 0.339 ~ 0.136 90.3之 2.9 97.4主 0.4 Ouabain 300μM (3) 5.24主0.62 0.209 ~ 0.068本 本 0.461~ 0.104 61.3主 7.6*村 93.3 ~ 0.5*** Oigitoxose 30

.

0

μM(3) 4.90主0.36 0.104~ 0.012 0.411~ 0.100 95.2~ 2.4 97.7~ 3.1 ONP 1mM (3) 5.42 ~ 0.48 0.072 ~ 0.029 0.366~ 0.049 95.9~ 2.3 98.5 ~ 0.4 Vinblastine 8μM(3) 5.25 ~ 0.31 0.165~ 0.141 0.431 ~ 0.258 86.2~ 13.2 96.5 ~ 2.3 Vinblastine 20μM(3) 4.86 ~ 0.02 0.1 06 ~ 0.048 0.490 ~ 0.234 93.7~ 2.6 97.1 ~ 4.1 Oaunorubicin 20μM (4) 5.41 ~ 0.76 0.108~ 0.030 0.537~ 0.125 96.4 ~ 1.4 98.3~ 0.8 Reserpine

.

8

μM(3) 5.96~ 0.50 0.103~ 0.032 0.516~ 0.216 95.8~ 1.6 97.3 ~ 2.6 TabJe 1 Continued. PFRa UFRb GFRC FRNa+d FRGl

♂

(mνmin) (mVmin) (mνmin) (%) (%)

Bolus

∞

ndition Quinidinc 80μM(3) 4.78 ~ 0.39 0.112~ 0.035 0.461主0.066 91.7 ~ 5.0 98.4~ 0.4 Verapamil80μ，M(3) 5.11 ~ 0.14 0.110 ~ 0.022 0.501 ~ 0.100 93.4~ 1.0 96.6~ 1.5 Vinblastine 200μM(3) 4.72玄0.35 0.079 ~ 0.008 0.381 ~ 0.104 95.7 ~ 1.5 96.8:t:1.1 v

、

l Plasma'f1ow rate. b Urine f10w ratc. C Glomerular filtration ratc， d Fractional reabsorption of Na+. e Fractional reabsorption of glucosc. *Significantly dift'erent from control司Pく0，05;** Pく0.01;村 本P<O，OO1.

(A) 4.0 3.0 2 0 1.0 ( 一

ε

c o

二 υ 酬 と こ ZO 一 ト ︿ ぽ ト Z 凶 υ Z 0 0 ︿三 ω

_ベ

E

( [3H]Oゅoxin InjectionJ S~lu~t;~~~" [14C]lnulin I Evans-blue Albumin 0.0 0 20 30 TIME (sec) (B) UJ ト

歪

z-:::、 C 0.=

E

豆

江 c u 0

益

三

〉 偲 0.010 包 ζ

<

-之 江

コ

0.020 Fig.2.

Scheme of the Isolated Perfused Rat Kidney System.

l

ポ細管上皮細胞内にまで分イ1;するジゴキ

f

l

¥

:

いピークをぶした やJlt.く、 その分布が大きいことをぷ11変 {氏いピークを示し、 さらに近く、 シンは、 a致す ジゴキシンの分布容秘が非常に大きいことと この車I

f

l

M

4

は、 した。 ジゴ イヌリンのfJI:?1I1:

1

，

~より、 J;j(かられiられるパターンでは、 る(5，6，]3)

。

15 Fig.3.

Typical Venous (A) and Urinary (8) Outflow Curves of Albumin (ム)，Inulin (0) and Digoxin (・) in the Isolated Perfused Rat Kidney.

D

Venous Outflow

D

Urinary Outflow 10 TIME (min) 5 0.000 0 JA<刑

I

I

W

分泌の'I.

f

'j・がぶされた。 ラットを川いた摘1.1

1

1_{庁地流法はジゴキシン分泌機械を桝析する} 稀々の化合物のジゴキシ その分泌機榊をlリ

l

らかにする目的で、 ヒトと

1

4

1:菜、 1:でイ

i

Jl]であると

J

S

えられた。 次に、 キシンのり1・?111'11~が 1'[11[ り、 従って、 ー7~ '}Ë波 13r添加した ?~/i 流 減をジゴキシン投与~níjから地流させておく定常状態 (Steady-state ~ 6-化合物を ン分泌に対する

i

必仰を検川した。即ち、

Na + .K+-ATPaseが~Il~，!;'されていると号えられ ウアベイン0.3m M共有.ド、 イヌリンの排前 condillonrた験で、その彫物を調べた。 Fig.4の縦和

h

は、 ジゴキシン分泌に彰響がないことが観'然できたことより、 る条件で、

1

1

1

とシ斗キシンの蛍(J払介本(20%:)から見積ったジゴキシンの糸球体協 Na + ，K+ -ATPaseはジゴキシン分泌に関与していないことが腕部レベルで j品事(Filtrationfraction;FF)に対する尿中排地本(FractlonalExcretion; FE) 明らかとなった。 全 Q Q.

q

.

弘

、

傾注 九

三 号 、 丸

三 ol 川 、 宅F

Z

も

コ

と

三 五

Fig.4.

Effect 01 Several Compounds on Renal Tubular Secretion 01 Digoxin in the Isolated Per1used Rat Kidney.

Values are means :!:S.O.*女， p<0.01， significantly different fro m co ntrol. n u h U 内 J n ζ c o z υ 剛 山 ﹄ uhC03 何 ﹄ 戸 一 一 L c o z ω ﹄ υ x 凶一 m w c o z ω 伺﹄比 この比が lを越えると分泌が￨呼吸 の比(EF/FF)で、分泌 iiiの指紋とした。 イ

i

機カチ 似を

I1

"

1

ることをぷ味する。肝臓における薬物輸送系として、 ¥Ji研究室並びに他の研究;;. オン、イi機アニオン輸送系が知lられており、 j主か数多く側(lfしている (9・12，14-18)。そこでこれらの輸送系がジゴキシ ン分泌に

I

Y

J

りしているかについて、それぞれの輸送系の典明的なぷ'l'l:で あるテトッエチノレアンモニウム (TEA)、パラアミノ

H

a

l

ポ般(P八11)を過剰 ドIg.4に/1ミすようにジゴキシン分泌には変化がなか

i

A

イfイ

:

1

ド検討したが、 1.0 "')た。従って、

J

I

イオン

1

"1:指物であるジゴキシンの分泌はイl機カチオン、 イl機アニオン輸送系とは

n

なる輸送機構であることがぶされ、以 ljiiの知 -放した。 ~:I;.( 19，20)と

ミ

ユ

。

_。

つ_{、/ ，} f_:

、

_;.- -0.0

I

lF

臓ては強心配納体特イlの輸送系が示唆されているが(21、)

i

I

守腕では 強心配私

i

t

体ウアベインによる開1古が認められず肝臓とは見なるメカニズ ジゴキシンの作川部作であ ン るNa+.K+-ATPaseはジゴキシンの分泌に関与しないことをぷl山する。 この結果は、 ムと

f

f

f

;

努ざされる (Fig.4)。また、 スピロノラクトンカt ゴキシン作排討lトを低下させるキニジン、

Na... ，1く "'-ATPase を 1~1l'， 1;. しうることから O'Brian らはNU ，K\ATPaseへの付

しかし、 ltoら 作がジゴキシン分泌に￨則与していると推察している (22)。 Na+Jく+-ATPaseのジゴキシン分 はt

;

?

必

l汗I-.J司itillll包LLC-PK1細胞をJI]い、 ジゴキシンの細胞への制作をウア 泌における!日1Ijについて検;、

f

し(23)、 さらにジゴキシンの構成新で、あるジギトキソースでも I~IL'，りしなかっ1たこ ベインはドIL川するが、統制111出輸送には影響がないことから、分泌に . )j、代t謝￨司

1

1

1

f

斉JI である2.4・ジニトロフェノール(DNP)では有志な阻符が

d

められ、分泌に

-9

-とから、配担It体部分の関与もないことが示唆された。 Na'".K+-ATPaseが!!J;~IJ.していないと結論付けている。嫡

I

I

l

i

軌流行により、 -8

-はATP加水分解のエネノレギーが必要であることが推察された。 以

J

の結-*をまとめると、摘出腎

i

笹流法はジゴキシンl斤恭助解析に適 していること、シコキシンの分泌は、有機カチオン、イ

i

機アニオン輸送 系とは見なるエネルギー依イ{的な機械によるものであることが/Jミl唆され た。 気~2 釘j HL不快Jl尿剤キニジン、ベラハミルとの ，j:ll/ ，~ 作川 ジゴキシンは、抗不樫脈剤キニジ、ン(Fig.5)と併川されるが、これがジ ゴキシンのIflL

'

1

'

i~

J

Jrを

t

げ、副作用が惹起されることが偽休

II

¥IJ凶とな っている (24・26)。その相 14作川は、分布容積の低ド(27・29) 、'f.'f tJI:~1十の低 下(27，28，30)、jJr

t

汁排討Itの低下(31，32)によるとの科

H

りがある。また、ベラ パミル(Fig.5)もl

'

i

J

織の羽111:作用が認められている (33・35)。ジゴキシンの 主たる消火臓部はl門であることから、 l汗における相1，:作川は

1

t

i

も沢民で CH₃0 HO，，，，， Quinidine CH₃

0

内 ‘ d H N 1l C 内 4 、_{‘ ，} ノ 今 J H C 〆 ' z

_、

H C OCII

，

CH₃0 OCJI₃ Verapamil Fig.5.

Structure 01 Ouinidine and Verapamil.

-ベラハミルのジゴキシン キニジン、 その機構を解明する11的で、 分泌に及ぼす影科を検汁した。 あり、 あるい

-

l

i

i

濃度-のキニジン、 地流液

r

l

1

に 摘山地

m

t

'

f

Vfを川い、 )J法は、

i

r

t

l

Fig.M立、 その剣

u

*

を検討した。 はベラパミルを添加することにより、 Fig. Fig.7'1_'央 n u n u n u n u 内 J n 4 4 l n u c o z o 句 ﹄ 比 C O 一 日 伺 ﹄ 戸 一 一 比 ¥ c o z ω ﹂ υ K 凶 一 ω c o z o m ﹄ 比 4

z

o

一 ト 3 ( 一 FC ¥ ﹁ ﹄ O 二 υ ︿ 匡 ト

Z

ω

o

z

o

流 H:友 '11_{にキニジン 8μMイfイ1: ドで得られた典 J~-I.J的な:希釈 1111 線で、ある} 3と比較するとジゴキシンのJ)j(

'

1

'

排池泣の低下が認められた。 2 何 ﹄ 半 ) U ︿ 三

ω

︿ J a TIME (sec)

ち

な

J L γ c 自 ら A v f 多 J_{﹄@片‘，} A V O J V -F A_肌/つ d

。 〆

V_J l

'

_O

3

l

弘

0

₂

毛

多

L O M

・

O

-a

内 つ 干 o o q 多 /_{﹄@♂、，}

o t v

ふ / つ c 多 ' t i / ン A V J V

。

c

'

0

・ 1 J /つ f

。 ら っ ‘

z n v

o o

_つ f (8) 0.02 0.01 ( C 一 凶 ↑ ︿広 ZO E ¥ C O 一 日 o m w ﹄ 半 ) E U 広 O × 凶 ﹀江︿ Z 一 江 コ 0.00 0 Steady-state Bolus Fig.7・ condition condition

Effect of Ouinidine and Verapamil on Renal Tubular

Secretion in the Isolated. Perfused Kidney.

Values are means:t:S

.

D

.

*;p<O.05

，

**; p<O.01

，

significantly different from control.

-13

-15

Fig. 6，

Typical Venous (A) and Urinary (8) Outflow Curves

of Albumin (.d.，) Inulin (0) and Digoxin(・)in the

Presence of 8 μ M Ouinidine inthe Isolated Perfused

Rat Kidney.

10

TIME (min)

-12 -5

Glomerulus Steady-state condition

F

i

g

.

8

.

Glomerulus Bolus condition Blood

C

e

l

l

Urine

Scheme of Two Modes of Inhibitor Administration.

のカラムのように

F

E

I

F

I

マ点すと、キニジン、ベラパミノレはジゴキシン分 泌を濃度依存的にド

1

t

汗した。臨床においては、ジゴキシンーベラパミノレ

f

l

1

/

i

作川はジゴキシンーキニジン相互作川よりも顕持ではなく、ベラパ ミルの影響が認められなかった報告もある (27)。これはキニジンのイ

i

効 I(IL 111濃度は数 μ Mであるのに対し、ベラパミノレは数百nMと低く、両.(;'の 1(1い|ゆ~~J企.の迷いによるとJ5・えられる。!!f1ち、 Fig.7のように両薬剤ともI，;j れ皮のジゴキシン分泌

m

刀間性はあるものの、臨床使

J

T

J

される濃度の逃 いのため、ジゴキシンーキニジン相互作用が￨晶体的にはより顕著に現わ れると推察された。 さらに、ジゴキシン血 111濃度は、キニジンの投与は(27)、あるいは1fn. 1ド政広(29)に依存して

1

:

げすることが報告されており、摘出j麓流腎にお ける濃度依存的な1_{汗クリアランスの低下とよく} e致する。 -14 -腎臓における分泌は、 r(IL~政側から細胞内への移行過料と、細胞内から 符

J

t

告

r

l

l

への移行過

t

'

a

という:開の性質の見なるIJ英、1!I

1

ち側!点目英、村

J

I

(-紋 服を透過する過料がイバ

:

1

する。そこで、キニジン、ベラパミルがジゴキ シンの側底朕透過過析を制作するのか、刷子総IJ英透過過程を目

lW

するの かを明らかにする

I

J

的で、li1l刀剤の共存状態を変えた尖験を行なった

(Fig.8)0 -定濃度の Im~';. 剤を添加した i秩流液をジゴキシン投与!日Jから iili

流させておく定常状態(Steady-statecondltion)尖験では、将来

I

I

織全体に 定濃度分布した状態でのジゴキシン分泌を検川することができ、 Fig.71₁1 火のカラムのように8μMのキニジン、ベラパミルにより阻??されること が認められた。.)j、1)lt~，!f，剤を瀧流液にはJ)1lえず、投与液にのみ力11えて、 ジゴキシンと共に瞬時に投与する同時投与(Boluscondltlon)実験では、

l

i

l

l

'~'}斉11が充分に細胞内、作j陀[

₁

1に分布してないことから、血管内から細 胞内への移行過粍は

I

{

H

咋しうるが、細胞内から竹j陀への移行過れを

l

Ji

U

，

_'

_f

するには有効な条件ではないとJ号えられる。車内*は、 Fig.7イfのカラムの ように定常状態実験に比べ

1

0

伯濃度でも顕持な

I

S

I

l!.'i'は必められなかった" 従って、キニジン、ベラハミルはジゴキシンの制

i

胞内から符j_作への移

_h

過胞を阻害することが推努きされた。 Korenらは、イヌを川いたクリアランス火.験、

n

英ベシクノレをJljいた取 り込み実験、 multipleindicator dilution実験等で、ジゴキシンにあjする斗 ニジンの影響について検討した結果、クリアランス実験以外では、キニ ジンの効果は観然されず、キニジンによる

_f

_'

V

f

r(IL流

j

A

低下によって肘排押

t

の低下が引き起こされると結論している(J

9

)

。しかし、

J

存右の摘

I

1

1

椴流 行では、血流、血圧を・

;

i

i

に維持しており、キニジンイバEド、

J

ドイバEド でこれらの値が変化しないにもかかわらず、ジゴキシン分泌に対するキ -15

-Effect of Probenecid on PAH Transport 0; Control

・

;

Probenecid0.1 m M 企 Probenecid1 m M

・

Probenecid2 m M

•

2 ジゴキシンーキニジン相互作 ニジンの r~ll~lf効-*が観察された。従って、 川は、血流の変化によるものでなく、刷千縁肢にイ子イ正するジゴキシン輸 ( 工 ︿ aO¥C 送機構に対するキニジンのu'{接作

J

B

に起[}qすると身えられた。

。

•

一 一 コ E O ) C ﹂ ジゴキシンの側底JJ英透過過程の機構をIリ!らかにする円的で、 次に、 Fig.9に示すように摘出地流腎から Ratioplotとは、 ratio plotを行った。 ねられる静脈流出液中薬物濃度(CpAH，Cd刷制)に対するイヌりン濃度 (C lIluhn)の比の内然対数を時間に対してプロットしたもので、血管側から

•

•

•

細胞内へ特殊輸送系を介して濃縮的に取り込まれる場合、初期に右上が

。

この直線の傾きが見かけの細胞内取り込み速

•

りの山総計IS分が観察され、 30 20 TIME (sec) 10

。

_。

Fig.9上限

l

には側底)J英で有機 !反応数を/jミすことが知られている(11，12，36)。

Effect of Quinidine on Digoxin Transport

アニオン愉送系により細胞内に能動的に取り込まれるPAHのratioplotを 0; Control

・

;

Quinidine8f.1M 有機アニオン輸送 ぶした。初期にゆjらかなれ 1:がりの直線が観察され、

。

ー

。

1.0 ( E H O O -3 0 系ド

1

1

'，

1;'剤プロベネシド共存下、濃度依存的に傾きが小さくなり、取り込 0

•

•

一方、下に示したジゴキシンは初期の右 み速度定数の低下が示された。

。

。

•

•

0

•

。

•

•

¥ C ニ コ E O ) C J 0.5 キニジン8μM存在下でも変化は認められな 1-.がりの

u

'I線が観察されず、 ジゴキシンの側底朕透過過程は特殊輸送系を介する波 かった。従って、 縮的な取り込みではなく、受動拡散によるものと推察された。 10 Fig.9.

Ratio Plot of p-Aminohippurate (PAH) and Digoxin in

the Isolated Perfused Rat Kidney.

-17

-。

8 4 6 TIME (sec) 」 2 0.0 0 ー

1

6

-第

3D

↑

j

p

一

紙

'f

丘

.

t

I

:

J

'

質問

k

i

l

柴剤とのネ

I

I

l

i

作川

第 l、2節からジゴキシンはエネルギー依存的であり、その過れ!をキ ニジン、ベラ八ミルが~Jl Wするという結決が得られた この性質は焔細 胞の多方IJM

.

t

:

I

にかかわる輸送系P一粕蛍(1rJ:の性質に矧似している。また P一私

'

f

i

l

i

I l'

i

'1は、 l行において近作

)

A

<

納符刷(-紘IJ英に肋イ1:していることが知 られている(37)0P-i'j蛋 l~l 質 lílL'，';活性をイfするキニジン、ベラバミノレ (38，39)がジゴキシンの細胞内から作腔への移行過ねをlSIl"与するという前 節での知見を

J

5

・え介わせると、ジゴキシン分泌にP一粕蛍

f

J

質が関りして いる

I

I

f

能性が高い。そこでP一新蛋白質の品質、あるいはその阻芹剤とし て矢11られている柴物のジゴキシン分泌に及ぼす彫轡を定常状態尖験で検 討した。ビンプラスチン、ダウノルビシン、レゼノレピン(Fig.10)はFig.11 にぷすようにジゴキシンの分泌を顕著に

l

i

l

l

計した。またピンプラスチン 何時投 IJ'lathでは 10的濃度にもかかわらず、顕著な ~Il 内効果が認められ なかったことから、キニジン、ベラパミルと

I

I

I

J

様、細胞内から符j陀への 移行

I

i

l

l

'，1;'であると批察された。 ビンプラスチンはビンカアルカロイド、ダウノルビシンはアントラサ イクリン系薬剤の千-.Jiで、構造的に関連十

t

はないが、

P-

梢蛋白質を発現 した州制

I

J

I

包はこれらの抗出剤に対して耐

1

"1:を/Jミし、

p-

紡蛍白質により輸 送される本質であることが明らかにされている

(

4

0

-

4

2

)

。またラウオルフ イアアルカロイドのレゼルピンは

p-

糖蛍1'1質により輸送されるかどうか はlり

l

らかとなってはいないが、その輸送を強く阻害し、耐性を克服する 作

J

H

をイ

i

していることが知られている

(

4

3

)

。このように構造も薬用作用 も児なる予選の化作物によりジゴキシン分泌が顕著に

1

m

押されたことか -18 -ら、 p-~.'f蛋(/fi:がジゴキシン分泌を tft っていることが始くノ示唆された。 s

CH]

，

，

，

，

OH

o

011 / へ ¥ _COCH~ Daunorubicin 11

HO

CH

3

0CO'

H

らCOOO~H3

Vinblastine CH)O Fig. 10. Reserpme

Structure of Vinblastine

，

Daunorubicin and

Reserpine.

19-経 細 胞 輸 送 評 価 系 の 確 立 と ジ ゴ キ シ ン

輸 送 機 構 の 解 明

第

2

章

ジゴキシンの以細管上皮細胞内から竹!陀への移行過

-

N

を 第 1，

'

;

i

:

では、 ベラパミルが

m

許し、その過料は、イf機カチオン、イf機アニ キニジン、 またp一札fI

l

l

i

1'1 オン愉送系とは兇なるエネルギー依存性輸送で、あること、 レゼ‘ 1'íの )1~f1あるいはド]l'， I;.剤であるビンプラスチン、ダウノルビシン、 ノレピンによりその分泌が大きく低下することが￨り

i

らかとなった。

p-

羽1，Iff

丘

1'1f1は多剤￨耐性を獲得した焔細胞において過剰に先制している ことが発凡され、その遺伝

f

であるMDRlcDNAから}f("i.iiされる挑むは !日j午、"~分と後、"~、"~分の 1280アミノ般残広からなる糖蛍 (11'iで、 (Fig. 12)、 また2ケ所のATP結合部位と 12[nlのIJ英J.'(泊部位をイiしてお 村Jf'i

J

1

11:が向い。 ATP)JJI水分解のエネルギーで構造的に関述性のない各純抗州市JIを能 り、 ム 〆_つ d / ~-_ラヨ. ー っ @ ~ 0 0

H

-ç:.~1

Bolus condition * ム . ム

o

~

丸

1 1

丸

ゆ~__{Il'_ ' I l ' 同}0_ ゐ v ~. V~. C-L つl {つ!っ ~・ 0 。 ol '(). cj) cj)官。ラ-ç:.~ べニー O 心 色 多 丸 、 ( : ) ， タ くL 多 内 J 司 ζ c o 一_- υ 伺 ﹄ h L C O Z 酬 と 日 一 一 比 c o z ω ﹄ ω x ω 一_ω c o 二 ω 伺 ﹄ Hh

。

。

_。

つ_{f 、，} ο _/ また、将臓の近位以制11竹;I:J~創1111包A(lIJ (. 動的に細胞外へ排

1

1

1

する (41，42)。 Steady-state condition 綜11英、J1

F

臓の

J

J

f

!

竹側IJ英、小腸の管腔側膜、 bfリi庁、

!

J

同の1(11WI勾j主制

1

I

包?;;の Fig. 11.

E11ect 01 Agents That Bind to P-Glycoprotein on

Renal Tubular Secretion 01 Digoxin in the Isolated 正常組織にも発現していることが報告され、その

I

'

-

.

f

l

l

'

的役

;

I

;

l

l

にも興味か

持たれている (37，44・46) 。その役割のーっとして、生体 y~物を体外に州首u

するのではないかと

J

5

・えられているが、薬物の体内動態における'市:，)を

Per1used Kidney.

Values are means :rS

.

D

.

*; p<0.05， **; p<0.01， ***; Pく0.001，

significantly different from control.

解明した例はない。 \l~びに P ー粕蛋千l 質が肝臓ではA(lIJ (-紋I1央にイ{.イ1.する 第 1'1

1

;

でねた結果、 ベラパミルが

P

ー糖蛍向質を問L"りすること守を

J

f

え介わ せると、生体にとっての見物であるジゴキシンはP-

l

1

l_f蛍

(

I

i

l

_によりJ

_A

_<

_，" に排刑されていると子怨される。そこで本丘では、 キニジン、 こと、 ジゴキシンかP一新蛍 f'l質によって輸送される広質であることの証明をぷみた。日1Iち、近似

}

A

<

ー 21--20

-制作 i皮細胞としての特徴を布するブタ行白米の細胞株LLC-PK.に、 p

-

私

'Wfl'lT1をコードする MDRlcDNAを導入し、 P一新

i

l

l

(1 f1:を過剰に発 現させた細胞でのジゴキシン輸送を検けした。 Out Membrane In COOH NH2 ATP ATP Fig. 12.

Scheme 01 the Putative Structure 01 P-Glycoprotein.

-22-m l窓

口

MDRl

cDNAの杭義行

1

:

皮到I

I

J

J

包

L

L

C

-

P

J

くへの導入

ヒト正常凶作から単離したP一階蛍1'1質をコードするMDRlcDNA (47) を合む発現ベクタ-pSKGAをリン般カルシウム沈殿法(48)によりt庁長lfT 上皮細胞LLC-PK1に導入した(Fig.13)。ホストとして

J

T

J

いたLLC-PK，調11 胞は近位以細管1.皮細胞の性質をぷし、

f

i

J

J

M

m

j

をすると細胞

I

I

I

J

隙に信行 結 合(tightjunction)を形成し、側j

底服

(basalmembrane; I(Il竹側側!点)1英に 相吋)を的必血に

J

長居させ、微紙色(rnJcrovilli)をイ

i

する山側JI英 (aPlcal membrane， 1"i腔側A(tIJイ二紋1I英に相吋)を

I

;

?

養液側に向けるという性質をイf する。また、薬物や栄

d

毒物質を)i

IÎ'Jili択的に愉送することがj~11 られてい

る(49・52)。従って、透過十1:フィルター

1

:

に市

J

r

"

I

m

1

をすることにより、 I(rl 管側から符j陀側、あるいは令燃側から血管側という経細胞輸送を検けす るのに過した細胞株である。 用いたプラスミド、pSKGAはアデ、ノシンデアミナーゼ(ADA)泣仏 fを仰 せ持つことから、この酵ぷを発現マーカーとした。 1111ち、 ADAにより無

ぷ化される9・s-D句キシロフラノシルアデニン (Xyl-A)を4μM及び八DA

の阻;lf剤である2'・デオキシコフオノレマイシンをlO nMで最初jの選日'1を~i

なった(53)。さらにSouthernblottingによりプラスミド rlVKDNAか染色

体中に姉入されていることが隊，訟できたLLC-GA5について(f.'ig.14A)、

コルヒチン濃度を段階的(20，40， 80， 150， 300 ng/mL)に上昇させ、 P一期jj蛍

白質が過剰に発現している株を継代した 樹立した近伝子導入株

LLC-GA5・COL150、LLC-GA5・COL300はそれぞれコルヒチン波}.!f・150、

300 ng/mLに対して耐性をぷす細胞株である。さらに RNaseprotectJon

assay、Westernblottingにより mRNA、 I)þ びに P 一義~ili1'1質か過剰に先刻

-DNA transcription

"

①

していることを確認した(Fig.l -lB.C)。またこれらの遺伝子導入株は ~Iel~ 株のLLC-PK₁に比較して、 Table2のように何々の抗梢剤に対して多剤耐 性を獲得していた。 Fig.15の'ザ点はP一戦

f

I

蛍1.'111のモノクロナール抗体 MRK16により頂側"英側を染色したものであるが、野

1

'

:

-

株が染まらないの に対して、遺伝子導入株は細胞表面が赤く染色され、的側JI英

1

:

にP一社

I

f

i

l

i

1'1質が発現していることが隊認、できた。 Flg.16はimmunogoldと以応させ た細胞を電千顕微鏡'//点で断面凶を写したものである。'び点からゆjらか なように、 Pー紡蛍(1ftは側j剖!英にはイバEせず、

m

側)岐にのみ)，，';イ

1

:

してい ることが確認できた。 次に野生株並びに遺伝子導入株を用い、税制Jt包輸送含ji11lfi系を肱 \'/~ した。

問l ち、細胞を多孔性ポリカーボネート膜(TRANSWELLT\I)上に Iìi ll'~im必 し、 m側膜側あるいは、側Ji~J1英側に i3HlK213E した)，~質を合む出d宅地を添 加lし、反対側の府イ毒液を続11，

1

的に採取することにより経細胞輸送!止を?JIIJ CaP04 Precipitation (・ )

白

A 『

⑪

cOHA prOb

・

6A

①

StableTransformant I い 刊 )mRNA 占

:

〆

①

Table 2

Relative Resistance to Anti-Cancer Agents Compared with

内""‘ ν句，、 LLC-PK1 Cells.

↓

…

election CellDeath

山

①

Colchicine Vinblastine Adriamycin 内 個 内 -a厳J・ nunu p

、

d n u 噌_E A 弓 4 J

L

L

O

0

c

c

民 必 必 刊

O

G

e

e

c

L

L

L

L

L

L

- a ベ d A ﹃ 司 L C J Expression of P-GP 81 150 88 167 Fig. 13.

Method for Transfection of MDR1 cDNA to LLC-PK1

Cells.

-Soulh.

，

n Bloulng RN

・

・

.

P

，

oleetlon

・

A

・

・

v w

・

・

I.，nBloulng 11.

・

-

_ー

•

民

/

。

2 1 2 3 4 2 23，1 -20ー。

J

6.6-

.

4

・

・

-

肘 4

-.

3

.

.

凶

-

・

.

，

3. b

.

-811ー ，. 2.:'- ‘・ー ‘姐・ ，/， 2.0

--

.

・

.

. ‘a

・

J a

?

S

qい，~ JY グ (J" V-V ? ‘ F h u 匂 、 心丹市川 J 4 0 V 句 h y ι y v h u f d F b ' d f

、

LV 46-

.

.

Fig. 14. 。守、，~ CJ- .Cγ 、"、，_句 (:)'t' O 、 ， 、d

A; Southern Blotting for Host (Iane 1) and

Transfectant (Iane 2) Cells. B; RNase Protection Assay for mRNA from HepG2 (Iane 1，) Host (Iane 2)

and Transfectant (Iane 3) Cells and tRNA (Iane 4). C; W estern Blotting for Host (Iane 1) and

Transfectant (Iane 2) Cells.

..Ii1

.

，

-

.

側. 4 .'1(.' 同 房・副 ，~; ，-17~.r' ""'，.. -.、 -~圃，ー

.

• ."... I .-I

"

"

"

"

"

'

-~-"

.

.

~ • j ，"'W

一

"

"

.

-

圃

-.

，

.

・

'1 ~

B

t ミ'000 ‘個以，。 Fig. 16.

Cytochemical Localization of P-Glycoprotein Using Electron Microscopy. Arrows represent gold grains.

Fig. 15.

Immunostaining for Host (A) and Transfectant (B) Cells Using Monoclonal Antibody MRK16.

-Apical Side Basal Side Apical HOST Basal Apical

t

TRANSFECTANT Basal Fig. 17.

Measurement of Transepithelial Transport across

the Cell.

-28-しかし、国側JI史上 側から側底膜側への輸送は阿樫度になるはずである。 定した(Fig.17)。なお、細胞間隙の漏れによる彰響を

e

4_C] 標識イヌリンを に排出ポンプとしてPー糖蛋白質が存在する場合、 P一新蛍

n

質により輸

l

，

t

J

I

時に添加することによりモニターしたが、

1

時間あたり 1.5%以下と大き 送される基質ならば、側底11英側から受動拡散で細胞内に取り込まれた )I~ なものではなく、飢宵剤添加11与も変化がなかったことから、特に補正は

n

はPー糖蛋白質により頂側膜側の培養液へ容易に排出される。逆に

m

側 この)j法を用い、 Pー精蛋白質の典型的な広質であるビ 行なわなかった。 朕側から取り込まれた基質は、 p-糖蛍白質により再び

J

J

J

側)1英側のI庁長液 ンプラスチンの経細胞輸送誌を測定したところ、野生株に比ベ遺伝千将 へ排出される。従って、経細胞輸送号ーとして観測した場介、 P一説tf蛍1'

1

1

1

人株では、側底膜側から頂側JI.英側への輸送は充進し、頂側JI英側から側底 の発現阜の充進に伴って、側蕗膜側から頂側膜側への輸送

i

A

が

W

l

)J11し、 J I英側への輸送は低下した(F也18)0

p-

精蛋白質により輸送される基質は、 逆に頂側股側から側底膜側への輸送量は低下することが子怨される (Fig. -般に)J行総'↑

1

1

:

が高く、細胞肢を受動拡散で透過すると考えられる。経制11 HorioらによるビンプラスチンをJlJいた紡 この

J

号え βの妥当性は、 17)。 !出輸送が受動拡散のみの場合、側底11英側から頂側膜側への輸送と瓜側版 MDRlcDNA遺伝千導入により 頂側JI英上に発現させた

p-

糖蛋白質は、薬物排11Iポンプとして機能してい ることが確認できた。 果によっても支持される(54)。従って、 8 6 4 2 ( C

一

_{ω H} O ﹄ a o ε ご 。 ε a ) て o a 凶 C 何 ﹂ ト ω 三 百 2 2 5 ﹀ -30 -3 Fig. 18.

Transepithelial Transport of Vinblastine in Host (0

，

.6) and Transfectant

(・，..)

Cells.

Basal toApical Transport;

o

，

e

Apical to Basal Transport;ム，企

29

-2

!

n

2釘

i

P-a!?蛍 f

~

l f1を介するステロイドホルモンの愉送

11:治組織にも P一転

i

'

蛍1.'1質は存在することが見いだされ、その

1

'

二月!的意 義について興味がもたれている。いくつかのステロイドホルモンがPー紡 蛍 I~J質に対して問

1m

活性を持つことから内因性基質である

1

1

1

能性が論じ られているが(55・57)、実際に輸送された証拠は得られていない。そこで、

!

日

j卸

i

で引i:

u

.

した純細胞輸送評価系の有用性を検討する

r

1

的で、純々のス テロイド‘ホルモンについて、 p-糖蛋白質の基質であるか何かを検討し、 Fig.19に払11.*をぶした。コノレチゾール、アノレドステロン、デキサメサゾ

ンは野生株に比べ遺伝子導入株では、側底朕側から f~~lUJJ~lllUへの輸送が

jじ進し、逆1Iljきの輸送が低ドするという輸送される J

J

;

riに特徴的なパタ ーンをぶした。さらに

p-

粕蛍

(

1

質の阻害剤であるベラパミノレイ

i

{

E

ドでこ

の )jIÎIJ~ 択がj な輸送は11(1 ~'i-された (Fig.20)。従って、 /;i'J作成質ホルモンの

コノレチゾ ル、アノレドステロン並び、に合成副腎ホノレモンのデ‘キサメサゾ ンはP一新蛍I'lriによって輸送される基質であることがlリ!らかとなった。 -)j晶体ホルモンのプロゲステロン、男性ホルモンのテストステロン、 卵胞ホルモンのエストラジオール、副腎皮質ホノレモンのコノレチコステロ ン、デオ年シコルチコステロンはどちらの細胞でも輸送に渋はなく、 P 一説't蛍 l'I Tîにより愉送される基質でも輸送に差はなく、 P-~，'f蛍 1'11îによ り輸送される )I~n ではないことが明らかとなった (Fig.21)。 -.般にP一札If蛍!'I'fiの基質と認められているものは州市消性化合物であ り、懸測網11胞や

J

J

民小胞を用いた取り込み実験では、細胞

J

J

英への非特異的 対;作が大きく、輸送

i

A

と結合量の分離評価が困難であることから、輸送 を検，付するには適したものとはいえない。それに対して本経細胞輸送評 -31 -(A) 40 30ト Fig. 19. /

三

〆

/げグ

-

-

-

-

-

-2 3 TIME(HR) 40 ~ 30

*

E 0 ~ 20 u. 10 (C) {

*

} E (8) 40 30 ~ 20 、s 咽』 u. 10 2 TIME(HR) 1 2 TIME(HR) 3

Transepithelial Transport of Cortisol (A)

，

3

Aldosterone (8) and Dexamethasone (C) in Host (0

，

ム)and Transfectant (・，企) Cells.

Basal toApical Transport;

o

，

e

Apical toBasal Transport; D..，企

-(8) 50 40 20 ~ 30 c o u 帽 LL 10 (A) 40 30 20 10 { J F } E O -u g 比 (8) 40 20 10 30 { J E c o -u 帽 ﹄ 比 (A) 40 30 20 10 ( J C c o z u 帽 ﹄ 比 3 2 3 2 3 2 3 2 TIME (HR) TIME(HR) TIME(HR) (D) 50 40 泊費 30 c o u 冊 tι 20 10 (C) 40 30 20 10 ( ポ } E O Z U 帽 ﹄ 比 TIME(HR) (c) 40 20 10 30 -J こ c o -u g L 3 (0) 2 TIME (HR) Fig. 21.

Transepithelial Transport 01 Progesterone (A，)

Testosterone (8)

，

Estradiol (C)

，

Corticosterone

and Oeoxycorticosterone (E) in Host (0，6.)

Trans1ectant (・，企)Cells.

Basal to Apical Transport;

o

，

e

Apical to Basal Transport;

ム

，

A

-34 -and 3 2 TIME(HR) 3 Fig.20.

Effect 01 20μM Verapamil on Transepithelial

Transport 01 Cortisol (A)

，

Aldosterone (8) and

Oexamethasone (C) in Trans1ectant Cells.

without Inhibitor Basal to Apical Transport;

0

Apical toBasal Transport; 6.

with Inhibitor Basal to Apical Transport;

・

Apical to Basal Transport;企

-33

-2

50 40 ポ 30 c o ιJ ~ 20 tム 10 Fig. 21. Continued. (E) 1 2 3 TIME (HR) 1 1国系は、実際に輸送されてきたものを測定するため、輸送量を直接評価 することが可能である。従来、プロゲステロン、テストステロン等は抗 焔剤のP一新蛍(-11

1

への結合に対する阻害が強いという結果等から内因性 基質と考えられてきたが

(

5

5

-

5

7

)

、実際にそれら自身が輸送されたデータ は得られていない。著有は、 このような脂溶性ホルモンで、も輸送を検討 できる系を雌立し、阻持活性の強いものが必ずしも輸送されるとは限ら ないという興味ある知昆を得ることができた。以上、本経細胞輸送評価 系は、 Pー糖蛍白質による輸送の検討に有用であることが明らかとなった。 さらに本法に、 pointmutation等の手法を応用することにより、 p-糖蛋 臼質の輸送活性調節機構等の解析にも発展が期待できるものと考えられ る。

-

3

5

-第

3

節

経細胞輸送評価系によるジゴキシン輸送

本節では、経細胞輸送評価系を用いてジゴキシンが

p-

糖蛋(j質により 輸送されるか否かを検討した。方法は 1、

2

節に準じ、

TRANSWELL

TM 上に野生株、遺伝子導入株を単層培養し、 [3H]標識したジゴキシンを合 む培養液を側底膜側あるいは頂側膜側に添加し、経時的に反対側の防長 液を採取することにより経細胞輸送量を測定した。結果は、{剛志JJ英側か ら頂側IJ英側への輸送、即ち分泌方向の輸送は充進し、 TOJ側IJ英側から側j底 j際側からの輸送、即ち再吸収点

r

n

J

の輸送は低下するという輸送されるぷ 質に特徴的なパターンが得られた(Fig.22)。 Fig.22. ( C 也 ち 60 ‘' a. 01

ε

、 、 、

。

E 40 a. ・』4 O a. (/) c 伺 』 ト・ C M 0 01 0 20 1 2 TIME (HR) 3

Transepithelial Transport of Digoxin in Host (0

，

ム)and Transfectant (・，.A)Gells.

Basal toApical Transport;

o

，

e

Apical to Basal Transport;ム，.A

-次に、 p- 糖蛍 (I 'ñ:の).~賀、 あるいは阻主剤として知られているピンブ ラスチン、 キニジン、 ベヲパミノレのジ、ゴキシン税制HJ泡輸送に対する拶科 を検討した。 これら111l'.';.剤共作ドでは、 側j底)民側から国側膜側への愉送 はfl¥;ドし、 国側IJ英側から側j点11英側への輸送は

!

:

!

t

/

.

し、 輸送の }j向性が火 われた(Fig.23)

。

これは、

p-

糖蛋白質を阻二与することにより受動拡散の '1.;"I iが耳~}JJlしたためと解釈できる。従って、 ジゴキシンは

p-

粕蛋白質に より輸送されることが明らかとなった。 -37・ 言 60 0 0 』 a. ol E 三 40 0 E a. o a (1) c:20 帽 ト-E M o ol

。

(A) 1 2 TIME (HR) 言 60 e

-

0 』 a ol E ご 40 0 E a o a

3

2

0

』 ト C H O 目

。

0 3 (C) 言 60 申

-

o a ol E ご 40 0 ε a 』 O a.

2

2

0

ト C M O ol 0 (8) 0 1 2 Fig.23. TIME(HR) 1 2 3 TIME(HR) 3

Effect of 20μM Vinblastine (A)

，

Ouinidine (8) and Verapamil (C) on Transepithelial Transport of Digoxin in Transfectant Cells.

without Inhibitor， 8asal to Apical Transport;

0

Apical toBasal Transport; D.

with Inhibitor

，

Basal to Apical Transport;

・

Apical toBasal Transport; A

-第

4

節細胞からのジゴキシン排出

Pー糖蛋白質は薬物を細胞内から細胞外へ能動的に排出することから、 ジゴキシンの細胞からの排出を直接測定することにより、頂側!摸側への 輸送をより明確に証明することができる。経細胞輸送実験と同様に、

TRANSWELL

TMに野生株並びに遺伝子導入株を単層培養し、 [3

H]

標 識 し たジゴキシンを24時間細胞内に取り込ませた後、経時的に頂側朕側、側 成11英側の防長液を採取することにより両側への排出量を測定した(Fig.24)。 また、 31時間排出させた後の細胞内残存量も測定した。 P一糖蛋白質の基 質の場介、

m

側j限上に選択的に発現したPー糖蛋白質により頂側膜側培養 液

'

1

'

へ能動的に排出されるため、受動拡散のみと考えられる側底膜側へ の排出

J

d

より多いと考えられる。またp-糖蛋白質阻害剤の影響も頂側朕 側への排

l

U

に対してのみ認められると考えられる。 Fig.25に結果を示す。遺伝子導入株では野生株に比較すると、頂側j院 側への排山足が噌加した。また、遺伝子導入株では、頂側Jl英側への排出

i

A

が側底j民側への排出量を大きく上回った。さらに、側底膜側への排出 足はキニジンの影響を受けないのに対し、

I

貢側朕側への排出量は大きく 低下し、頂側

I

J

英側への排出阻害に応じて細胞内残存電も増加した。 以

k

の結果より、頂側膜上に発現した

p-

糖蛋白質は、ジゴキシンを細 胞内から国側膜側へ排出し、その過程をキニジンが阻害することがさら に明確となった。 Apical Side Basal Side Apical Basal Apical Basal

A

-1

1

1

1

1

1

'

T

A

-E

E

E

HOST TRANSFECTANT Fig.24.

Measurement of Digoxin Efflux from the Cell.

40-30 (A)To Aplcal Side 30 )( ~ I _.IW_ / ~ ~ :; I I ../..l/" ~ ー ー :: I / _L/"，:，...---，. ::::

1LA

w

_，

I /"，，:/ .1 W 0 ~ / /t1 10

。

Fig.25. TIME(HR) 70 '# C 65 コ O E 〈 帽 コ ヨ 60 ' "

。

匡

。

(C)In Cell (B)To Basal Side

~

2 TIME(HR) 3

Digoxin Efflux 1rom Host (ー

-0

・ー)and Trans1ectant

Cells in the Absence (ー-0ー) or Presence 01 50μM

(--ー)or 100μMト 合 一 )01 Ouinidine to the Apical

Side (A) and Basal Side (B) and Residual Amount in

the Cells (C) after a 3・hr Efflux.

41

-第

5

針

i

ジゴキシン体内動態における

P

一

事

s

i

f

t

i

t

!

'

￨質の

I

，Q"

J

'

;

"

-以上本 f;tでは、ヒト p-~ff蛍 f~l 質を発現させた細胞株での統制It包輸送、 並びに細胞からの却￨山を検討した結果、ジゴキシンはP 札If

l

l

i

1

'

1

'l'iにより 輸送される

J

P

l

1

であることを明らかにできた。また、第)ì;í の j~{1 流行で の結果と

J

S

.

え介わせると、ジゴキシンは尿細管上皮細胞Ar(J'

r

-

U

J

I

民のp-

t

:

w

蛍1'111により 1:皮細胞から管腔へ分泌されることが解明された。さらに、 臨床

:

1

ジゴキシンJ(llllJ濃度をと昇させるとして、相1，:作川が!日Jl岨となっ ているキニジン、ベラパミルは

p-

精蛋白質を目

l

;

l

f

することによりジゴキ シン1汗排地を低ドさせ、ひいては血中濃度を上舛させる機椛がlリ

l

らかと なった。 数多くの研究にもかかわらず未だに明らかとされなかったジゴキシン 分泌機椛について、 t持者は、抗婚期jに対する多剤耐性の

l

J

i

t

l

刈である輸送 系、 P一新蛍)，'1質におI:jし、細胞レベル、臓器レベルでジ、ゴキシンが輸送 されることをゆjらかにした。 p-糖蛋向質は肝臓以外のf

E

~:í:; ffll*ia-3こも光現 しており、ジゴキシン体内動態に及ぼす影符は

i

f

T

臓以外にも

x

えられる。 特にキニジン、ベラパミルの相互作用は l汗排討Itだけでなく、分イ11~~fÚ の 低ドという制作もあり、今凶の結果はそれらの機構解明にも， r( 決な JI~礎 的的報を与えるものと

J

える。ジゴキシンは、以

1

'

Iにぷ変化体で

7

0

_・

8

0

_切 羽

n

l

l

t

されることからl汗排池が

k

たる消失経路とされているが、 JJIJ竹カニ ユレーションを施し、

J

J

r

t

汁クリアランスを測定するとその人きさは行ク リアランスに似敵する(19，32)。この事実から即日

-'

1

1

'

に封

:

1

討Itされたものが、 腸符でII}吸収され、脇肝循環が起こっていると雑然される .)j、川

v

i

v

o

実験で、の分イII特有

i

の

n

l

l

l

では、肝臓に取り込まれ、

J

I

H

汁

1

'

1_'こ

f

J

l

:

i

l

l

t

_され

-42-てから I呼吸収を受ける過

.

N

にイ

l

花する薬物

j

i

l

は、分イfi容積の中に合まれ てしまう。肝臓のP一鮎蛍l'If1がジゴキシンJJltYl-fJ附Itを担っているとすれ ば、キニジン、ベラパミルによるジゴキシン分布作秘の減少は、肝臓の

P

-:Il.'i蛍1'1質問

1

1

1

3

による!財

J

I

I

'

循環の寄与の減少に起附する可能性がある。 従って、これら薬物相11:{1:J1Jは腎臓で

P

ー糖蛋1(

1

1'1を介するだけでなく、 肝臓てのPー粕蛍['1質を介した機構も考えられ、将来検討されるべき課題 と，:える。 また、 Satoらはそルモットでキニジンによりジゴキシンの脳分布が附 人するというが

i

J

4

3

を料、 1(ll縦一脳関門においてジゴキシンをlUl中に排

1

1

¥

する機構がイヂイ

:

f

しており、キニジンがこれを

l

Ji

l

討すると身察している (58) P -t~.'f.tli

'

r

I質は I(ll

i

夜一JI同開門にもイバEしており、脳内に入ってきた II~体にとっての兇物を t(ll 液中に排出していると身えられている (46)。 従 って、ジゴキシンがP-:I1

h

蛍ド

1

1

1

により輸送されることを考えると、ジゴ キシンを IUL液

r

l

'

に排

1

1

1

している機構がp-粕蛍

1

'

1

f1であり、キニジンはこ れを m 刀していることが~・えられ、脳移行に|到しても p- 縮蛋白質が大き く関与していることが抑察される。 43

-第

3

章

ジゴキシン腎排

j

世 に お け る 相 互 作 用 予 測j

システムの確立

ジゴキシンは、治療械が狭く中毒域では

i

l

U

誌な凶作JjJを引き起こすこ とから薬物血中濃度モニタリングに基づく投与

i

没，

i

十の必裂な柴物である また臨床上併用される柴物が多く、併用薬により体内動態が変動するこ とが少なくない。ジゴキシンは主として未変化体でJ

A

<

1

'

1に排前されるこ とから、『

f

T

排討Itに対する相11:作j日を予測することが/.fJI竹寸1)

I

的

1

1

"

のために は

i

f

(

裂な課題となってくる。ljij2

J

"

:

!

を通じて明らかにしてきたジゴキシ ン分泌における Pー納蛍

'

1

1質の関与から、これまで、均体

1

:

報告されている 相I

:

z

wm

が、

p-

在

l

i

i

l

i

I

'

l

f1をI$IL得することに起附すること、あるいはP 一新蛍

n

質を阻??する爪性をむする薬剤をジゴキシンと併用する場介、 その1汗排計Itを低ドさせる

I

I

J

能性があることが子似される。本市ではその ような観点からジゴキシンl行排向性について、 糾制仰制

1

1

リ!胞抱

i

包凶市愉命送

J

、

1

判

l

相 lハκd川f竹作f乍f川子測システムの附.fι1: を lはj 指し、ジゴキシンの~物拘 I If:作JIJ につ いて論述する。 -

44-第

1

節

ジゴキシンースピロノラクトンネ

11

J

i

:

作川機桃

スピロノラクトン(Fig.26)は、カリウム保持性利以柴として臨床

1

:

繁 川されている その作川機序は、遠位尿細管および集作併において抗手

J

I

1

A

<

ホノレモンアノレドステロンのミネラノレコノレチコイドレセプターへの結作 をドIL'，'~し利 jポを芯起する (59，60) 。また、ジゴキシン投，).出t;. (うっ Ifl1性

心

、

ィ

J令)に対して頻繁に併灯lされるが、ジゴキシンの粁排慨を低ドさせ、 1(1い

'

l

政伎を

1

:

ケ

.

t

させることが知られており(61・63)、。

:

f

川にあたっては住 芯

L

が必叫である。その相

'

d

1

'

川の分子機構については全く小￨リ

l

であった。 スピロノヲクトンはステロイド

'

1

，'格をイ

I

しており、!日jr'

;

i

:

~'\

2

t

m

でIJミす ようにステロイドホノレモンが

P-

糖蛋白質と相I計十川をイ

i

することからス ピロノヲクトンかPー納蛍 (1質と何らかの相圧作

m

を持つ

I

I

J

能性が

.

x

えら れる また、ジゴキシンは粁尿細管でPー糖蛍(]質により分泌されること から、ジゴキシンースピロノラクトン相互作用は、スビロノラクトンに

。

、SCOCH_J Fig.26. Structure of Spironolactone. -45 -よるPー梢蛍(J

'

f

i

$11l，'，;.に起凶するというメカニズムがJ>;-えられ、川

'

d

1

:

:

川 機構の解

I

V

I

を，式みた。 まず、スピロノラクトンによる Pー糖蛋白質の品質結

f

T

のInl;，;'を制べる ため、アジドピン結合に対するスピロノラクトンの彩科を検討した。ア ジドピンは

P

一幕

H

f

長打質に特異的に結合し、光アフイニティラベリングに 月

i

いられている柴物である(64，65)。方法は、野生株、遺伝子i‘ヰ人株から 細胞l肢を分取し、ベラパミルあるいはスピロノラクトン Jl イf 卜~，

J

I

.

J

l{

r

ドで[l.

H

I

机

J

t

したアジドピンと一定時間反応させ、紫外線を照射後、 SDS-PAGEで蛍1'1f(を分離した。スピロノラクトンはベラパミルと

I

l

l

j

娘、 濃度依存的にアジドピンのPー糖蛋肉質に対する結介を1$11'1 ' ;した(Fig.27)。 従って、スピロノラクトンはP- 粕蛋肉質に対する )1~n*l'i 介を1I'H>r

l

f

I

L

~，_' ~す ることがiリ!らかとなった。 次に、 jjij市で併i・屯した遺伝子導入株を月jいた経細胞輸送付

f

d

l

i

系で、ジ ゴキシン並びにビンプラスチンの経細胞輸送に対するスヒロノノクトン の影特を検討した。ジゴキシンの五

r

n

J

選択的輸送をスピロノノクトンは 濃度依存的に問l;1;した(Fig.28A，B)。またP ー糖蛍 ['1 質のリ処刑("'))I~n であ るビンプラスチンの輸送をも阻書した(Fig.28C)。 さらにジゴキシンの細胞からの排出に対するスピロノラクトンの彬仰 を検討したところ、 Fig.29に示すように、国側JI英制JIへの-t

J

I

'

/

11 はiJ:~1似衣イ{. 的にスピロノラクトンにより阻害され、それに応じて仰

I

J

I

包内伐イ{.I，

t

も附 加した。側j点目見側への排出

1

1

1

は細胞内薬物

h

t

f

¥

'f/)JIlに1'rぃf¥Y1))11した。これ は、細胞内濃度の

i

ニ叫に伴い、受動拡散の寄与がf!Yl)111したためと解釈で きる。従って、スピロノラクトンはジゴキシンのPー納

i

l

i

(

J

n

による輸送 を阻;!?することが明らかとなった。

-46-(8) TIME(HR) 3 2 50 C 0 ~ 40 a. c> ε 、 、 O 30 ε a O 20 a. 柿 E 帽 』 ト c: 10 K O 目

。

(A) 6 { C 一 申 ︼ O ﹄色白

ε

二 O E a } 乞 o a 的 戸 ﹄ 国 ﹄ L F 申 EZ 的 S a c -﹀ 3 (c) TIME(HR) 2 8 50 E 申 ~ 40 a c> E 、 、 石 30 ε a. O 20 a 帥 C 帽 ト c: 10 K o c> o 4

←

170 kDa

8

，

，t

7

6

5

4

2 3

1

(kDa)

97.4

・

69

46

200

4 ~- ~­ O く'ー

な

J

l

多

Verapamil Spironolactone ノ..::> o '0 o 0

3

な

」

ノ 0 0 4 多 ..A ~_ ' ‘ u ~-弘

之~

_.φ

[

。

_/ て シ_o o _f 2 3 01 20μM(A)or50μM (B

，

C) Spironolactone on Transepithelial Transport 01 Digoxin (A

，

B) and Vinblastine (C) inTrans1ectant Cells.

without Spironolactone

，

Basal to Apical Transport;

0

Apical to.Basal Transport; ~

with Spironolactone

，

Basal to Apical Transport;

・

Apical to Basal Transport;企

-48 -2 TIME(HR) Fig.28. Effect Fig. 27.

E11ect 01 Verapamil and Spironolactone on CH]Azidopine Binding to P-Glycoprotein.

Host; lane 1

，

transfectant; lane 2・8

，

withverapamil;lane

3・5

，

withspironolactone; lane 6・8.

-細胞レベルで予測した相川作用が臓器レベルでも起こり得る現象であ 摘出潜流行を川いてこの相在作川を検II，

t

るかどうかを確かめる

I

j的で、 スピロノラクトンの彫科は山北状態実験で }j法は第 1j'

J

に市じ、 した。 (6)To 6asal Side 40 30 糸球体泌)i!i J

A

<

}止、 Table 3には摘

1

1

1

潮流腎における血披流

i

d

、 検討した。 スビロノラクトンにより、 グルコースの l呼吸収率を示した。 Na+、 速度、 この作用についての機 糸球体il.l~過速度に低下が観察された。 jflL衆流位、 潮流j夜中にアルドステロンがイパ正していないこ 椛は I~J らかではないが、 20 { 4 C M コ 一 ﹄ ﹄ 凶 10 (A) To Apical Side 40 30 20 { a y ) H コ 一 こ ω 10 スピ Fig.30には;、 抗アノレドステロン作川ではないと思われる。 とから、 3 2

。

3 2

。

1怜JURmE J

A

<

の希釈

u

h

総から、

J

I

'

イバ

:

1

ドにおけるジゴキシン急速投与後、

1

1¥波及び尿から得られる典則的な希釈曲線をぷした。 ロノラクトン存在ド、 TIME(HR) Table 3

Experimental Conditions of the Isolated Perfused Kidney. Valucsaremeans土S.D.Numbcrs in parenthcscs rcprcscnt thc numbcr of

cxpcnmcnts. "Ri(t (%) I Rぃ +d

"

'

.

(りも) GI'RC

u

r

'

R

"

PFR' (C)In Cell TIME(HR) 60 55 { J C H C コ O E ︿ -帽 コ 望 的 申 広 (mLmln) n H m ， ， ， m (ml/min) 50 UI UI ~ -~

。

玉 虫 ，，_ 可与三 宅-:: ^ Y "o_ /_~~ 可_{~_~"ð>} フ弓 マ_{~_}ヨ弓_.~ 多 多

。

_。

う % H P

，

.

98.5主0.4 b Urinef10w rale. 97.9:1:2.1 98.3:1:1.4 91.9主 6.2 0.355:1:0.078"

・

94.4主3.8 0.347:!: 0.038"

・

95.8主2.6 0.552:1:0.07J 0.139主 0.025 5.77:1:0.63

・

"

O.JJ2:1:0.046 0.114:1:0.011 4.51主 0.15 5.28:!: 0.63 • Plasma flow rale. Control (4) Spi ronolaclone 20μM (4) 50μM (3) Fig.29.

Digoxin Efflux from Transfectant Cells in the Absence (0) or Presence of 50μM(

・

)or100μM

(.A.)of Spironolactone to the Apical Side (A) and 8asal Side (8) and Residual Amount in the Cells (C)

after a 3・hr Efflux. C Glomerular fualralion ratc. dドractionalreabsorption ofNぶ. • Fractional rcabsorptionof glu

∞

!'c. **Siginificantly diffcrcnt frolll control， P<O.01. -50 -_ 49 _

(C) 5 3 4 2 { 一

ε

E

2

2

2

F

)

z o

一 ト ︿ ぽ ト Z 凶 υ Z 0 0 ︿三

ω

︿ J 仏 (A) 6 5 2 4 3 { 一 E C O 一 包 何 と ) 2 0 一足

E

・5 2 0 0 ︿三

ω

︿ ﹂ 仏 30 20 TIME (sec) 10 TIME (sec) 10

(

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0.030 は』 トー

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0.020 a:c::

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三

_c:: u 0

百

三

0.010 〉 何 広 ζ <( -之 江

コ

0.000 0 0.000 0 15 Fig.30.

Typical Venous (C) and Urinary (0) Outflow Curves of Albumin (ム，) Inulin (0) and Oigoxin (・)in the Presence of 50μM Spironolactone in the Isolated Perfused Rat Kidney.

-52 -10 TIME (min) 5 15 Fig.30.

Typical Venous (A) and Urinary (8) Outflow

of Albumin (ム)，Inulin (0) and Oigoxin (・)in the Absence of Spironolactone in the Isolated Perfused

Rat Kidney. Curves 10 TIME (min) -51 -5