LC/MS を用いた食肉中のアミノグリコシド系抗生物質分析法の検討
雅楽川憲子，蒲澤 泰子，丹治敏英Analysis of Aminoglycoside antibiotics in Meat by
Liquid Chromatography/Mass Spectrometry
Noriko Utagawa, Yasuko Gawasawa and Toshihide Tanji
Keywords：アミノグリコシド系抗生物質（aminoglycoside antibiotics），食肉（meat），液体クロマトグラフ/質量分析計 （liquid chromatography/mass spectrometry，LC/MS）
1 はじめに アミノグリコシド系抗生物質（以下，AGs 抗生物質）は動物 用医薬品として幅広く用いられている．その中でもスペクチノ マイシン（以下，SPCM），ストレプトマイシン（以下，SM），ジ ヒドロストレプトマイシン（以下，DSM），ゲンタマイシン（以下， GM）およびネオマイシン（以下，NM）の 5 物質は，牛，豚， 鶏等に細菌性下痢症や呼吸器系疾患等の感染症治療薬とし て汎用1)され，畜産物中への残留が食品衛生上懸念されてい ることから，我が国や Codex 委員会でも残留基準値が設定さ れている． 畜産物中のAGs 抗生物質の分析法は高速液体クロマトグラ フ 3,4)，微生物学的試験 5,8)，液体クロマトグラフ/質量分析計 （以下，LC/MS）2,7)， 液体クロマトグラフ/タンデム質量分析 計 6,9,10,11)による分析等の報告がある．また，厚生労働省の通 知試験法 12)にも GM 試験法と DSM，SM，SPCM および NM 試験法が定められている．その DSM，SM，SPCM およ びNM試験法は，試料を1％メタリン酸溶液で抽出し，ODSミ ニカラムに負荷し，保持されず流出したAGs 抗生物質にイオ ンペア試薬を加えて再コンディショニングした同ミニカラムに 再負荷した後，メタノールで溶出したものを試験溶液とする方 法である．当所でもこれに従い分析したが，十分な回収率を 得ることができなかった．その原因が試験溶液の調製方法に あると考えられたため，分析法の検討を試みた． さらに，その結果から，SPCM，SM，DSM，GM および NM の 5 物質の一斉分析法を検討したので報告する． 2 実験方法 2．1 試料 市販の牛の筋肉および肝臓を用いた． 2．2 試薬等 標準品：SPCM はナカライテスク（株）製，SM，NM および GM は和光純薬工業（株）製の生化学用，DSM は MP Biomedicales, Inc.製の標準品を用いた． 標準原液：標準品をそれぞれ 1,000μg/ml 力価になるよう に，メタノール：水（50：50）混液に溶解して調製し，冷凍保存 した． 標準混合溶液：各標準原液を適当量採り，メタノール：水 （50：50）混液で 100μg/ml 力価の標準混合溶液を調製した． この標準混合溶液から，添加回収試験用は水でさらに希釈し たものを，検量線作成用は0.005mol/l ヘプタフルオロ酪酸溶 液：アセトニトリル（80：20）混液（以下，移動相溶液）でさらに 希釈したものを用いた． 試薬：アセトニトリルおよびメタノールは和光純薬工業（株） 製高速液体クロマトグラフ用，n-ヘキサン，トリクロロ酢酸，リン 酸一カリウムおよび水酸化ナトリウムは同社製試薬特級，塩酸 は同社製有害金属測定用，1-ヘプタンスルホン酸ナトリウム 表1 LC/MS 測定条件 ＜LC部＞ カラム Symmetry C18 3.5μm，2.1mm×150mm（Waters製） 移動相 A液：0.005mol/lHFBA溶液，B液：アセトニトリル（グラジェント） グラジェント条件 A液：90％（0分）→40％（20分）→90％（20.1分）→90％（50分） 流量 0.2ml/分 カラム温度 40℃ 注入量 5μl ＜MS部＞ イオン化モード ESI（＋） キャピラリー電圧 3.50kV コーン電圧 35kV ソースブロック温度 100℃ デゾルベーションガス温度 350℃ デゾルべーションガス流量 窒素ガス，360ｌ/時間 コーンガス流量 窒素ガス，60l/時間 サンプルコーン電圧 SPCM，SM，DSM：60V，NM：40V，GM：30V SIR SPCM：333，351，SM：582，263，DSM：584，263 GM：322，478，NM：161，615
（以下，HSA）は同社製イオンペアクロマトグラフ用，ヘプタフ ルオロ酪酸（以下，HFBA）は同社製アミノ酸配列分析用， 2NA（EDTA・2Na）（以下，EDTA）は同社製試験研究用を用 いた． ミニカラム：ジーエルサイエンス（株）製 GL-Pak PLS2 270mg/6ml を用いた． 2．3 装置 LC/MS：LC 部は Waters（株）製 2695 Separations Module，MS 部はＷａｔｅｒｓ（株）製 ZQ2000 を用いた． pH メーター計：(株)堀場製作所製 pＨ/ＩＯＮMＥＴＥＲ F-24 を用いた． 2．4 LC/MS 測定条件 LC/MS 測定条件を表 1 に示した． 3 結果と考察 3．1 抽出液の検討 3．1．1 抽出液の調製方法の検討 通知試験法12)では1％メタリン酸溶液を用いて抽出すること になっているが，5 物質ともほとんど回収できなかったため， 石井らの報告 4,10,11)により抽出溶媒および抽出液の調製方法 を検討した．抽出溶媒を2％トリクロロ酢酸+10mM リン酸一カ リウム+0.4mMEDTA 溶液に変えたところ，5 物質はある程度 回収されるようになった．そのため，抽出溶媒は 2％トリクロロ 酢酸+10mMリン酸一カリウム+0.4mMEDTA溶液を用いるこ 試料 5g ホモジナイズ（2分間） ホモジナイズ（1分間） 遠心分離（3,000rpm，10分間） 水 層 残留物＋ヘキサン層 ホモジナイズ（2.5分間） 遠心分離（3,000rpm，10分間） 水 層 残留物＋ヘキサン層 50mlに定容 振り混ぜる 遠心分離（3,000rpm，5分間） 水層を回収 ヘキサン 40ml 抽出溶媒※ 合わせる ヘキサン 5ml ←←← ※： 2％トリクロロ酢酸+10mMリン酸一カリウム +0.4mMEDTA溶液 ↓ 抽 出 液 抽出溶媒※ 30ml 抽出溶媒※ 20ml 図1 抽出液の調製方法 とにし，抽出液の調製方法は図1 のとおり行うこととした． 3．1．2 精製ミニカラムの検討 試験溶液を調製するとき，通知試験法12)ではODS ミニカラ ムを用いることになっているが，Bond Elut-C18（500mg）で はほとんど回収できなかったため，他のミニカラムを検討した． Sep-Pak Plus tC18（400mg），OASIS HLB（60mg）， Sep-Pak Plus PS-2（265mg），GL-Pak PLS2（270mg）等を 用いて検討した結果，回収率，クロマトグラム上の妨害ピーク の有無および目詰まりの有無等から総合的にGL-Pak PLS2 （270mg）が適していると判断した．以後，このミニカラムを用 いて抽出液を精製することとした． 3．1．3 抽出液における最適 pH の検討 草野らの報告 5)によると，ミニカラムに負荷する抽出液の pH が回収率に大きく影響することから，抽出液の最適 pH に ついて以下のとおり検討した．牛筋肉を用いて，図1に従って 調製した抽出液にSPCM，SM，DSMおよびNMが0.5ppm， GM が 0.1ppm になるように標準物質を添加した後，１N 又は 0.1N 塩酸溶液および水酸化ナトリウム溶液で pH2.0，3.0， 4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0 にそれぞれ pH を調 整した．ミニカラムはメタノール10ml，精製水 10ml および飽 和EDTA 溶液 5ml でコンディショニングし，それぞれの pH に調整した標準物質を含む抽出液を負荷し，水10ml で洗浄 した後，15％メタノール溶液10mlで溶出させ，この後，さらに メタノール 10ml で溶出させた．15％メタノール溶液およびメ タノール溶出液はそれぞれ，40℃以下で減圧濃縮，乾固した 後，移動相溶液で 2.5ml に定容し，試験溶液とした．これを LC/MSで測定し，それぞれのpHにおける回収率を求めた． その結果を図2 に示した． SPCM では pH8.0 が最も高回収率で，ほぼ 100％であっ た． SM および DSM では pH6.0～pH9.0 が高回収率で，70 ～90％であった．pH10.0 以上になると，15％メタノール溶液 では回収されず，メタノールでのみ回収された． GM では pH2.0 が最も高回収率で，約 80％であった． pH10.0 以上になると，15％メタノール溶液では回収されず， メタノールでのみ回収された． NM では pH2.0 が最も高回収率で，約 90％であった． pH10.0 以上では 15％メタノール溶液でもメタノールでも回収 されなかった． pH の調整により，イオンペア試薬を加えなくてもミニカラム に保持できること，また，15％メタノール溶液でもある程度の 溶出が可能であることがわかった． 以上のことから，AGs 抗生物質 5 物質を効率よく回収するた めに，酸性側およびアルカリ性側の抽出液を同時に調製する こととした．抽出液の酸性側における最適pH は GM および NM の回収結果から pH2.0 とし，抽出液のアルカリ性側にお ける最適pH は SPCM，SM および DSM の回収結果から平 均的に判断してpH8.0 とした．牛筋肉の抽出液の pH を pH メーター計で測定したところ pH2.6 であったことから，酸性側 の抽出液はpH 調整を行わないこと（以下，pH 無調整抽出
SPCM 0 20 40 60 80 100 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 回収率(％) SM 0 20 40 60 80 100 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 回収率(％) DSM 0 20 40 60 80 100 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 回収率(％) GM 0 20 40 60 80 100 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 回収率(％) NM 0 20 40 60 80 100 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 10.0 11.0 pH 回収率(％) 図2 AGs 抗生物質の各 pH における回収率 ：15％メタノール溶液 ：メタノール 液）にし，アルカリ性側の抽出液のみpH8.0 に調整を行うこと （以下，pH8 調整抽出液）とした． なお，溶出液として 15％メタノール溶液を用いた理由は，メ タノールで溶出すると，クロマトグラム上に妨害ピークが認め られ，測定困難であったためである．SPCM の分析法を検討 した大口らの報告 3)によると，ミニカラムから妨害成分が溶出 するのを抑えるために，溶出液としてメタノールよりも15％メタ ノール溶液（肝臓については 6％）を用いた方が良好な結果 が得られたことから，15％メタノール溶液を用いたところ，クロ マトグラム上の妨害ピークが軽減され，測定できるようになっ た． 3．1．4 抽出液の精製方法の検討 pH 無調整抽出液および pH8 調整抽出液の精製方法は， 通知試験法12)に基づいて図3 のように検討した． SPCM，SM，DSM および NM が 0.5ppm，GM が 0.1ppm になるよう標準物質を添加した牛筋肉を用いて，図 1 のとおりに調製した．抽出液を図3に従って精製し，ミニカラム 負荷後，メタノールで溶出した画分（図3 の溶出液Ⅰ）および 流出液にイオンペア試薬を加えて再負荷し，メタノールで溶 出した画分（同溶出液Ⅱ）について，AGs 抗生物質 5 物質の 回収率を求めた．その結果を表2 に示した． pH 無調整抽出液では，ＡＧｓ抗生物質 5 物質とも溶出液Ⅰ から約50％以上回収され，溶出液ⅡからSMおよびDSMが 10～30％回収された． pH8調整抽出液では，NMを除くＡＧｓ抗生物質4物質は溶 出液Ⅰから 50％以上回収され，溶出液Ⅱから DSM のみ回 収され，その回収率は10％未満であった． pH無調整抽出液又はpH8調整抽出液 20ml（2g相当） ミニカラム※注)に負荷 （予め，メタノール10ml，精製水10mlおよび 飽和EDTA溶液5mlでコンディショニング） （予め，メタノール10ml，精製水10mlおよび 飽和EDTA溶液5mlでコンディショニング） 洗 浄 溶出液Ⅱ 注)：※で使用したミニカラムは※※でも再使用 0.1mol/lHSA溶液 3ml 精製水 3mlを2回 メタノール 10ml ミニカラム※※注)に再負荷 溶出液Ⅰ 精製水 3mlを2回 洗 浄 メタノール 10ml ここまでの流出液+洗浄液を回収 図3 抽出液の精製方法の検討 表2 抽出液の精製方法の検討結果（n=3） 単位：％ 測定対象物質 SPCM SM DSM GM NM 添加濃度（ppm） 0.5 0.5 0.5 0.1 0.5 pH無調整 49.8 47.9 76.1 106.4 63.9 抽出液 3.5 6.6 2.7 19.0 8.2 0.0 30.6 13.7 0.0 0.0 0.0 20.7 15.3 0.0 0.0 pH8調整 104.1 78.6 90.4 56.9 0.0 抽出液 2.6 4.1 7.4 15.9 0.0 0.0 0.0 8.0 0.0 0.0 0.0 0.0 3.6 0.0 0.0 上段は平均回収率，下段は変動係数 溶出液Ⅰ 溶出液Ⅱ 溶出液Ⅰ 溶出液Ⅱ
以上のことから，pH 無調整抽出液は，イオンペア試薬を加 えた後のミニカラムで再溶出する操作を行うことにし，pH8 調 整抽出液は，この操作を省略した． pH 無調整抽出液中の SM および DSM 以外の 3 物質につ 20ml（2g相当） ミニカラム※注)に負荷 （予め，メタノール10mlおよび精製水10mlでコンディショニング） （予め，メタノール10mlおよび 精製水10mlで再コンディショニング） 洗 浄 溶 出 40℃以下で減圧濃縮，乾固 筋肉の場合，2.5mlに定容 肝臓の場合，5mlに定容 試験溶液 LC/MS測定 測定可能な物質：SM，DSM，GM,，NM 注)： ※で使用したミニカラムは※※でも再使用 0.1mol/lHSA溶液 3ml 精製水 3mlを2回 メタノール 10ml ミニカラム※※注)に再負荷 精製水 3mlを2回 移動相溶液 ←←← 合わせる 洗 浄 溶 出 15％メタノール 10ml ここまでの流出液+洗浄液を回収 図4 pH 無調整抽出液の試験溶液の調製方法 20ml（2g相当） pH8に調整 ミニカラムに負荷 （予め，メタノール10ml，精製水10mlおよび 飽和EDTA溶液5mlでコンディショニング） 溶 出 40℃以下で減圧濃縮，乾固 筋肉の場合，2.5mlに定容 肝臓の場合，5mlに定容 試験溶液 LC/MS測定 測定可能な物質：SPCM，SM，DSM，GM 移動相溶液 1N又は0.1N水酸化ナトリウム溶液 洗 浄 メタノール 10ml 精製水 3mlを2回 図5 pH8 調整抽出液の試験溶液の調製方法 いてクロマトグラム上の妨害ピークが認められた．特にNM で 妨害が顕著であり測定困難であったため，15％メタノール溶 液で溶出させる操作が必要であった． 当初，ミニカラムのコンディショニングにはメタノールおよび 精製水および飽和ＥＤＴＡ溶液を用いていたが，pH 無調整 抽出液をミニカラムに負荷させると，ＥＤＴＡの析出により，ミニ カラムが目詰まりを起こし，溶出にかなりの時間を要した．そこ で，メタノールおよび精製水でコンディショニングしたミニカラ ムで回収率を確認したところ，大きな違いは認められなかった ため，pH 無調整抽出液から試験溶液を調製する場合，メタノ ールおよび精製水でミニカラムをコンディショニングすること にした． 以上の検討結果から，pH 無調整抽出液および pH8 調整 抽出液の試験溶液の調製方法は，それぞれ図4 および図 5 のとおり行うこととした． ３．２ 添加回収試験 添加濃度は，試料にSPCM，SM，DSM，GM および NM を残留基準値の濃度になるよう設定した．牛筋肉には SPCM， SM，DSM および NM が 0.5ppm，GM が 0.1ppm になるよ う，牛肝臓にはSPCM およびGM が 2ppm，SM，DSM およ びNMが0.5ppmになるようそれぞれ試料に添加した．図1， 図4 および図 5 に従って，n=3 で添加回収試験を行った．そ の結果を表3 および表 4 に示した． SPCM は pH8 調整抽出液から 103～118％回収され，NM はpH 無調整抽出液から 55～67％回収された． SM，DSM および GM の 3 物質は双方の抽出液から 57 ～115％回収され，抽出液の違いによる大きな差はあまり認め られなかった． 表3 牛筋肉の添加回収試験結果（n=3） 単位：％ 測定対象物質 SPCM SM DSM GM NM 添加濃度（ppm） 0.5 0.5 0.5 0.1 0.5 pH無調整 平均回収率 45.2 114.5 94.9 73.0 66.8 抽出液 変動係数 5.2 5.0 3.1 17.3 8.2 pH8調整 平均回収率 117.6 107.8 114.9 77.8 0.0 抽出液 変動係数 1.4 9.4 2.8 17.8 0.0 表4 牛肝臓の添加回収試験結果（n=3） 単位：％ 測定対象物質 SPCM SM DSM GM NM 添加濃度（ppm） 2.0 0.5 0.5 2.0 0.5 pH無調整 平均回収率 28.7 107.7 110.9 56.6 55.2 抽出液 変動係数 3.5 13.6 13.1 11.0 13.1 pH8調整 平均回収率 103.0 94.9 87.8 62.0 0.0 抽出液 変動係数 7.2 3.5 8.4 7.3 0.0 ３．３ 一斉分析法の検討 牛肝臓の抽出液のpH を pH メーター計で測定したところ， 牛筋肉と同様，pH2.6 であった．pH 無調整抽出液は酸性下 でミニカラムに負荷することになる． SPCM は pH 無調整抽出液よりも pH8 調整抽出液の方が
高回収率であり，変動係数も小さいことから，アルカリ性の抽 出液から測定できる． SM，DSM は pH 無調整抽出液でも pH8 調整抽出液でも どちらとも80％以上の回収率であり，酸性およびアルカリ性の 抽出液から測定できる． GM は pH 無調整抽出液でも pH8 調整抽出液でも 56～ 78％の回収率で，酸性およびアルカリ性の抽出液から測定で きる．牛筋肉のGMのばらつきが大きい原因は，LC/MSの検 出感度が低い上に，添加濃度も 0.1ppm と低いためと考えら れた．GM の回収率が低い原因は，ミニカラムが最適でない 可能性や抽出液のpH が最適でない可能性が考えられた． NM は pH8 調整抽出液では回収できず，pH 無調整抽出 液では 55～67％と回収率はやや低いが，酸性の抽出液から 測定できる．NM の回収率が低い原因は，GM と同様，ミニカ ラムが最適でない可能性や抽出液の pH が最適でない可能 性が考えられた．抽出液のpH は pH2.6 であることとアルカリ 性の抽出液では回収できなかったことから，抽出液の pH を pH2以下に調整するとNMの回収率が高くなる可能性がある と考えられた． 以上のことから，抽出液を2つに分けて，酸性の抽出液から NM を測定し，アルカリ性の抽出液から SPCM を測定し，双 方の抽出液からSM，DSMおよびGMを測定し，データの信 頼性を評価する方法が有用な方法と考えられた． 4 まとめ 残留基準値が設定されているAGs 抗生物質 5 物質の一斉 分析法を検討するために，牛の筋肉および肝臓による添加回 収試験を行った．その結果，SPCM は牛の筋肉および肝臓 でもpH8 に調整したアルカリ性の抽出液から 103～118％， NM は pH 無調整の酸性の抽出液から 55～67％，SM， DSM および GM の 3 物質は双方の抽出液から 57～115％ の回収率が得られた．GMおよびNMの低回収率の原因は， ミニカラムが最適でない可能性や抽出液のpH が最適でない 可能性があり，今後，GL-Pak PLS2 以外に他のミニカラムの 検討や抽出液のpH 調整の検討が必要と考えられた． 厚生労働省通知の「試験法の妥当性評価ガイドライン」13)で は真度・精度の評価基準が設定されており，それによると添加 濃度が0.1ppm のとき真度が 70～120％および室内精度が 20％未満，添加濃度が 0.5ppm 以上のとき真度が 70～ 120％および室内精度が 15％未満とされている．この評価基 準を参考にして評価すると，GM および NM の回収率は基準 にやや満たなかったが，変動係数はすべて基準に満たし，比 較的良好な結果が得られた．今回検討した一斉分析法は，通 知試験法12)等の分析方法として有用であると考えられた． 5 引用文献 1) 中澤裕之，堀江正一：動物用医薬品データブック 2006． 2) 堀江正一，吉田栄充，菊池好則，中澤裕之：食衛誌，42， 374（2001）． 3) 大口克志，高原ひろみ，松本真里子，中島千絵，城戸 靖雅：食衛誌，37，319（1996）． 4) 浜本好子他：食衛誌，44，114（2003）． 5) 草野友子，神田真軌，八卷ゆみこ，平井昭彦，鎌田国 広：東京健安研年報，54，142（2003）．
6) Anton Kaufmann，KatHryn Maden：AOAC，88， 1118（2005）． 7) 斉藤ひろみ他：第 86 回日本食品衛生学会学術講演会 講演要旨集，p.87（2003）． 8) 藤田和弘他：第 87 回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集，p.59（2004）． 9) 小園正樹他：第 90 回日本食品衛生学会学術講演会講 演要旨集，p.59（2005）． 10) 梶田弘子，阿久津千寿子，畠山えり子，小向隆志：第 93 回日本食品衛生学会学術講演会講演要旨集，p.63 （2007）． 11) 石井里枝，堀江正一，James D. MacNeil：第 94 回日 本 食 品 衛 生 学 会 学 術 講 演 会 講 演 要 旨 集 ，p.66 （2007）． 12) 厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：食品に残留 する農薬，飼料添加物又は動物用医薬品の成分である 物質の試験法について，平成17 年 1 月 24 日，食安発 第0124001 号． 13) 厚生労働省医薬食品局食品安全部長通知：食品中に残 留する農薬等に関する試験法の妥当性評価ガイドライ ン，平成19 年 11 月 15 日，食安発第 115001 号．
