遺伝子破壊変異イネを用いたサイトゾル型グルタミ
ン合成酸素1;1の機能解析
著者
田渕 真由美
号
856
発行年
2005
URL
http://hdl.handle.net/10097/16167
氏
名(本籍)
学 位 の 種 類
学 位 記 番 号
学位授与年月 日
学位授与 の要件
研 究 科 専 攻
学 位 論 文 題 目
た ぶ ち ま ゆ み田
渕
真
由
美
博
士(農
学)
農
博
第856号
平
成18年3月24日
学 位 規 則 第4条
第1項
該 当
農学 研究 科応 用 生命科 学 専攻
(博士課 程)
遺伝 子 破 壊 変 異イ ネ を用 い たサイ トゾル 型 グル タ ミン合
成酵 素1;1の
機能 解析
論 文 審 査 委 員
(主
査)
(副
査)
行
剛
彦
知
忠
谷
尾
山
西
前
授
授
授
教
教
教
論
文
内
容
要
旨
遺伝子破壊 変異イネを用いたサイ トゾル型 グル ダミン合成酵素1;1の 機能解析
序論
窒 素 は 、最 も不 足 しや す い 必 須 元 素 で あ り、植 物 の 成 育 を 直 接 支 配 す る 重 要 な 因 子 の 一 つ で あ る 。 主 要 穀 物 で あ る イ ネ の穂 を 構 成 して い る窒 素 の 約80%は 、老 化 器 官 か ら節 管 を 介 し て 輸 送 さ れ る窒 素 に 由 来 し て お り.(MaeandOhira,1981)、 節 管 を 流 れ る 転 流 窒 素 の 主 形 態 は グ ル タ ミ ンお よ び ア ス パ ラ ギ ン で あ る(HayashiandChino,1990)。 こ の 窒 素 転 流 に は 、 老 化 葉 身 に お け る サ イ トゾ ル 型 グ ル タ ミ ン合 成 酵 素(GS1;EC6.3.1.2)と 若 い 成 長 中 の 器 官 に お け るNADHグ ル タ ミ ン酸 合 成 酵 素 (NADH-GOGAr;ECl4.1.14)が 重 要 な 機 能 を担 っ て い る こ とが 示 唆 され て き た(Kamachiε ∫砿, 1991;Kamachietal.,1992;Yamayaetal.,1992;Hayakawaeta1.,1993;Hayakawaeta1.,1994;Sakuraiet α乙,1996)。 しか し、GS1が この 機 能 を担 っ て い る とい う 直 接 的 な証 明 は な され て い な い 。 生 理 機瀧 の 直 接 的 な 証 明 に は 、標 的 遺 伝 子 が 欠 損 した 変 異 体 の 利 用 が 必 須 で あ る 。 プ ラ ス チ ド型 のGS2の 主 な 生 理 機 能 は 、光 呼 吸 で 放 出 さ れ た ア ンモ ニ ア め 再 同化 で あ る こ とが 、オ オ ム ギ のGS2 遺 伝 子 欠 損 変 異 体 を用 い た 解 析 か ら明 ら か に され た(Wallsgroveθ ∫砿,1987)。 植 物 に お け る 変 異 体 を用 い た研 究 は 、順 遺 伝 学 的 に表 現 型 の 違 い か ら ス ク リ ー ニ ン グ し、原 因 遺 伝 子 を特 定 す る と方 法 と 、 主 に シ ロ イ ヌ ナ ズ ナで 整 備 され たT・DNAタ グ ラ イ ン を 用 い て 、 標 的 遺 伝 子 が 破 壊 され た ラ イ ン を獲 得 す る 、 い わ ゆ る 逆 遺 伝 学 的 ア プ ロ ー チ が あ る 。 しか し、GS1遺 伝 子 の 欠 損 変 異 体 に 関 す る 報 告 は 、 シ ロ イ ヌ ナ ズ ナ で も な い 。 近 年 、 イ ネ ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク トに よ り内 在 性 レ トロ トラ ン ス ポ ゾ ン1b517を 転 移 させ た 遺 伝 子 破 壊 系 統 群 が 作 出 さ れ 、 目的 遺 伝 子 に1b517が 挿 入 さ れ た 系 統 を選 抜 す る こ とが 可 能 と な っ た 。 本 研 究 で は 、イ ネ に お け るGS1の 生 理 機 能 を 、GS1遺 伝 子 欠 損 変 異 体 を用 い て 明 ら か に す る こ と を 目的 と し た 。 ま ず 、第1章 で は 遺 伝 子 破 壊 変 異 体 の 獲 得 を 行 い 、 第2章 で は 得 ら れ た05G51∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 を 詳 細 に解 析 し た 。さ ら に 、第3章 で は 、05(}∫1∫1遺伝 子 破 壊 変 異 体 を 用 い て 、GS1;1 の 機 能 を探 っ た 。第1章GS1遺
伝子破壊 変異体 の獲得
本 章 で は 、 イ ネ のGS1の 遺 伝 子 破 壊 変 異 体 の 獲 得 を 試 み た 。
イ ネ に お け るGSlcDNAは 、shootGSlとrootGSlの2種 が 単 離 さ れ て い た(Sakamotoθ'鼠,1989)。
ゲ ノ ム 配 列 の 解 読 が 完 了 し た イ ネ ゲ ノ ム デ ー タ ベ ー ス を 検 索 し た と こ ろ 、 新 た に サ イ ト ゾ ル 型GS 遺 伝 子 を 発 見 し た 。 そ こ で 、 従 来 のshootGSI遺 伝 子 を0∫G∫1∫1、rootGS1遺 伝 子 を0∫G∫12と 改 名 し、 新 た に 見 い だ し たGS1遺 伝 子 を0∫(}31∫3と 命 名 し た 。05σ51∫3cDNAを ク ロ ー ニ ン グ し 、 RT-PCRに よ り3種 の0∫G51mRNAの 蓄 積 を 調 べ た 。 そ の 結 果 、0∫G314mRNA、03G51∫2mRNA は 、 供 試 し た 幼 植 物 の 根 、 葉 鞘 、 未 抽 出 葉 身 、 完 全 展 開 葉 身 、 老 化 葉 身 、 開 花 後5日 目 の 穎 果 全 て に 検 出 さ れ た の に 対 し 、05(}∫1∫3mRNAは 、 穎 果 で の み 検:出 さ れ た 。 イ ネ ゲ ノ ム プ ロ ジ ェ ク ト に よ り 、 公 開 さ れ て い る1b∫17の 隣i接 配 列 の デ ー タ ベ ー ス を 検 索 し 、 03G51∫1の 第8exonに1b∫17が 挿 入 さ れ た 系 統(ND8037)を 見 い だ し た 。 ま た 、DNApoolに 対 す
るPCRス ク リ ー ニ ン グ の 結 果 、新 た に03G31ソ 第8exon(ND8901)、 第10exon(NC2373)、 第4inmn
(NFll30)、 第10intron(NCO866)に1b317が 挿 入 さ れ て い る 系 統 を 見 い だ し た(Fig.1A)。 こ の う ち 、exonに1b517が 挿 入 さ れ て い る 系 統 に つ い て 解 析 を 行 っ た 。03G51∫1遺 伝 子 上 に7b∫17が 挿 入 さ れ た 対 立 遺 伝 子 がheterozygoteに な っ た 個 体(+1一)や 、0∫G51∫1遺 伝 子 上 の7b∫17が 脱 落 し た 個 体 (+!+)は 、 野 生 型 と 同 様 に 成 育 し た 。 こ れ に 対 し て 、05G∫1ノ 遺 伝 子 上 に7わ ∫17が 挿 入 さ れ た 対 立 遺 伝 子 がhomozygoteに な っ た05G51∫1破 壊 変 異 体(一!一)は、 成 育 の 遅 延 や 稔 実 率 の 低 下 が 認 め ら れ た (Fig.1B-IE,Table1)0 03G51ゴ 上 に7b317が 挿 入 さ れ た03σ31∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 を 獲 得 し 、 こ の 変 異 体 は 成 育 が 極 端 に 遅 延 す る と い う 表 現 型 を 示 す こ と が 明 ら か に な っ た 。
第2章05G51;1遺
伝子破壊 変異 イネめ特 徴
第f章 で 得 ら れ た03G51ソ 遺 伝 子 破 壊 変 異 イ ネ の 特 徴 を 明 ら か に した 。 05651∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 で は 、葉 身 、葉 鞘 お よ び 根 のGSI含 量 が 減 少 して い た(Fig.2B)。 ま た 、 変 異 体 の 完 全 展 開 葉 身 か ら抽 出 した 可 溶 性 タ ン パ ク 質 を 陰 イ オ ン 交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー に て 分画 し、GStrans色rase活 性 を 測 定 した と こ ろ 、GSI活 性 も野 生 型 と比 較 して 著 し く減 少 して い た(Fig.
05σ51∫1mRNAは 検 出 され な か っ た 。 一 方 、05G51∫2mRNAは 」 供 試 した 全 て の 器 官 で 野 生 型 と同
程 度 検 出 さ れ た(Fig。3)。機 能 相 補 を 目 的 に 、 サ サ ニ シ キ の0∫G51ソpromoter領 域 に0∫G51/cDNA
を連 結 した キ メ ラ遺 伝 子 を 、heterozygote(+1一)に導 入 した 形 質 転 換 イ ネ を作 出 した 。 こ の 自殖 種 子 で あ るT1世 代 を栽 培 した結 果 、03G51JcDNAが 導 入 さ れ た 形 質 転 換 体 は 、 変 異 体 で 認 め ら れ た 成 育 の 遅 延 な ど の 表 現 型 が 回 復 し、 野 生 型 と同 様 に成 育 し た(Fig.4)。 こ の こ と か ら、 変 異 体 で 認 め ら れ た 表 現 型 は 、GS1;1が 欠 損 して い る こ と に 起 因 して い る と結 論 した 。 03G∫1∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 が 正 常 に 成 育 で き な い こ と か ら、GSl;1の 生 理 機 能 の 中 に は 、他 のGS1 や 他 の 代 謝 系 で は補 い きれ な い 機 能 が あ る こ とが 明 ら か に な っ た 。 第3章05G51∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 イ ネ を用 い たGS1;1の 機 能 解 析 第2章 で 示 し た他 のGS1や 他 の 代 謝 系 で は 相 補 で き な いGS1;1の 機 能 は 、 い くつ か 可 能 性 が 考 え ら れ る。 ま ず 、 こ れ までGS1の 機 能 と して示 唆 さ れ て い る 、転 流 窒 素 のGlnを 老 化 葉 身 に お い て 合 成 す る と い う機 能 をGSI;1が 担 っ て お り、変 異 体 で は 、転 流 が 滞 り正 常 に成 育 で き な い 可 能 性 が 予 想 さ れ る 。 ま た 、 根 に お け る窒 素 初 期 同 化 過 程 に お い て 、 ア ンモ ニ ウ ム イ オ ン投 与 後 のmRNA
の 蓄 積 量 の 推 移 や 、mRNAの 蓄 積 部 位 に は 、GSI;1と 、GSI;2で は違 い が あ る こ とが 判 明 し て お り
(lshiyama6如 乙,2004)、 そ れ ぞ れ 、 異 な る役 割 を担 っ て い る 可 能 性 が 考 え られ る 。 こ の 、GS1;1の 機 能 を解 明 す る た め 、0∫G∫1/1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 を よ り詳 細 に解 析 した 。 窒 素 初 期 同 化 過 程 に お け るGS1;1の 機 能 を解 析 す る に あ た り、変 異 体 に与 え る 窒 素 源 を変 化 させ て 栽 培 し た 。 変 異 体 を 、播 種 直 後 か ら 、3種 類 の 窒 素 源 の 水 耕 液 で そ れ ぞ れ 栽 培 す る と、NH4+の 存 在 す る 、 塩 化 ア ンモ ニ ウ ム 条 件 と硝 酸 ア ンモ ニ ウ ム 条 件 で は 、 第4葉 が 短 く な り、葉 身 の 抽 出 に 遅 延 が 認 め ら れ た 。こ れ に対 し、NO∫ の み の 硝 酸 ナ ト リ ウ ム 条 件 で は 、野 生 型 に 近 い 成 育 を 示 した(Fig. 5)。 ま た 、 種 子 栄 養 期 に水 の み で 栽 培 す る と 、 変 異 体 は 野 生 型 と同様 に成 育 し た(Fig.6)。 種 子 栄 養 期 に水 の み で 栽 培 し 、NH4+投 与 後48時 間 の 変 異 体 の 第3葉 身 、 第3葉 鞘 お よ び 、 根 の ア ミ ノ 酸 蓄 積 量 を測 定 し た 。 変 異 体 で は 野 生 型 と比 較 し て 、 グ ル タ ミ ン が 減 少 し て お り、 こ れ に 伴 っ て 、 総 ア ミ ノ酸 含 量 も減 少 して い た 。 また 、 こ の と き 、 ア ンモ ニ ウ ム 蓄 積 量 は 、 野 生 型 に 比 較 し て 、 変 異 体 で 増 加 して い た(血ble2)。 こ れ らの こ と か ら、 変 異 体 で 認 め ら れ た 表 現 型 はNH4+存 在 条 件 下 で 生 じて い るが 明 らか に な っ た 。 播 種 直 後 か ら塩 化 ア ン モ ニ ウ ム を窒 素 源 と し た水 耕 液 を 与 え て播 種 後18日 目 ま で 栽 培 した 、 変
異 体 と野 生 型 の 葉 身 を切 片 化 し、組 織 を観 察 した 。 そ の 結 果 、 変 異 体 は 組 織 が 正 常 に発 達 し て い な か っ た 。 変 異 体 と野 生 型 を 、 播 種 直 後 か ら塩 化 ア ン モ ニ ウ ム を 窒 素 源 と した 水 耕 液 を 与 え て 播 種 後 玉8日 目 ま で 栽 培 した 時 の転 写 産 物 蓄 積 量 の 違 い を 、 マ イ ク ロ ア レ イ を用 い て 解 析 した 。 第3葉 身 、 第3 葉 鞘 、 根 に 分 け て 、 そ れ ぞ れ 、 変 異 体 と野 生 型 の 転 写 産 物 蓄 積 量 を 比 較 した 結 果 、 マ イ ク ロ ァ レ ィ チ ッ プ 上 の 約21500遺 伝 子 の う ちPvI韮ueO.01以 下 の 有 意 な 増 減 が 認 め られ た 遺 伝 子 数 は 、 葉 身 で 627(う ち 増 加299、 減 少328)、 葉 鞘 で411(う ち増 加232、 減 少179)、 根 で1100(う ち 増 加483、 減 少617)で あ っ た(Fig.7)。 ま た 、 こ の う ち 、 発 現 強 度 比3倍 以 上 の 増 減 が 認 め られ た 遺 伝 子 数 は 、 葉 身 で67(う ち 増 加17、 減 少50)、 葉 鞘 で35(う ち 増 加28、 減 少7)、 根 で98(う ち 増 加56、 減 少42)で あ っ た 。 詳 細 は 現 在 解 析 中 で あ る 。 0∫σ51∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 が 、特 にNH4÷ 存 在 条 件 下 で 正 常 に成 育 で きな い こ とか ら 、GSl;1の 生 理 機 能 に は 、 他 の 代 謝 系 で は 完 全 に は 相 補 で き な い 部 分 が あ る こ とが 判 明 し、 イ ネ の 根 にお け る NH4+同 化 に お い てGSI;1は 極 め て 重 要 な 役 割 を担 っ て い る こ とが 明 らか と な っ た 。 結 論 本 研 究 で 、 以 下 の こ とが 明 ら か に な っ た 。 1.こ れ ま で 他 の い か な る植 物 で も報 告 の 無 か っ た 、 サ イ トゾ ル 型 グ ル タ ミ ン合 成 酵 素 の 欠 損 変 異 体 で あ る 、05G51ゴ 遺 伝 子 破 壊 変 異 イ ネ を獲 得 した 。0∫G51∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 は 、 遺 伝 子 破 壊 系 統 群 よ り、05G31/1遺 伝 子 上 に レ トロ トラ ン ス ポ ゾ ン7b∫17が 挿 入 さ れ た5系 統 見 い だ した 。 変 異 体 は 、 成 育 が 遅 延 し、 稔 実 率 が 著 し く低 下 し た 。 2.0∫G∫1∫1遺 伝 子 破 壊 変 異 体 は 、 正 常 な0∫G51∫1mRNAが 蓄 積 し て お らず 、GS1タ ンパ ク質 が
減 少 し、GSI漕1生 が 低 下 し て い た 。 変 異 体 に0∫G31∫1promoter制 御 下 で 、05G∫1∫1cDNAを 導 入 し
た と こ ろ 、 成 育 が 遅 延 す る な どの 表 現 型 は 回 復 し、野 生 型 と 同様 に 成 育 した 。 こ の こ とか ら 、 変 異
体 で 認 め ら れ た 表 現 型 は 、GS1;1が 欠 損 して い る こ と に 起 因 して い る と結 論 し た 。
3.0∫G31」 遺 伝 子 破 壊 変 異 体 が 、 特 にNH4+存 在 条 件 下 で 正 常 に 成 育 で き な い こ と か ら、GS1;1
の 生 理 機 能 に は 、 他 の 代 謝 系 で は 完 全 に は 相 補 で き な い 部 分 が あ る こ とが 判 明 し 、 イ ネ のNH4+同
(a)
ND8037andND8901
NCZ373 120sGS'1;1
(b)
NF1130 NCO8661お173一
へ .乙 ー i 孟 塾 覧 .、 、 、 ・ .、 ︾樋
r.(d)
柵
露 ﹁ .、趨
琢
＼
蔵
﹁
こ ち ヒ熟
(+1+)
グ <N } , 肝 (+み) し . i 1 ['し ゴ 「 ■ ■ ・ ■ ノ(c)
1 ←み) 、/一 ・仁 .H
M
(e)
(一ん) WT (一/一) τ・bl・1R竺 伽 。f剛 曲 醇i内 伽 ・。・GS壌曲 ㏄ 師。・tm幽 ・t㎞ 。・k・櫨lhe内D8037(一A))an酬d呼P・ , Spikeletnumber onamainstemOnespikelet Une(nurnbe巾anicle)Fer創 穐y(%)weight(mg) , .『.一L.「.... ■ WT(+芹)(+ん)L一 一 π 「 一一ノ Fゆre耀.Pheno肺iccharac幽gr団050「05GS7'7・ ㎞06配o脳t mu㎞nお. (a)DiagramofinsertionpositionofretrotransposonTos17in OsGS1;1.Exonsareindicatedasboxedregionswhereaslines representintronsandthe5'一and3'一untranscribedregions. Openboxescorrespondtountranslatedsequences.Arrows indicatelocationsofprimersthatweredesignedforPCR screening. (b)PhenotypeoftheknockoutlineND8037[Tosi7was homorygouslyinsertedintoOsGS1;1(一/一)):fourpotsfromthe right],uw'ldtype(WT'),heterorygote(+1一)),andno-insertionnull planls(+1+)at54daysaftergermina廿on. (c)PhenotypeofanotherknockoutlineNC2373at41days a貴ergermina⑳n.Symbolsfbrgeno尊pes拍r7bsプ7hOsGSプ ノブ arethesameasin(b). (d)Phenotypeatharvest.TheknockoutlineND8037(一/一)}and thewildtypeweregrownfor140and132daysafter germination,respectively. (e)Phenotypeofpanicleandspikeletonamainstemofthe Theredandwhiteareasofthescalebarin(b)一{d)一are10cm, respectively. Wildtype(n=4) Homorygote(n=8) Heterorygote(n=4) null(n=3) 62出10 26t11 67士5 68士12 92士10 2士4 86±10 90.士10 24.4tO.5 17.3tO.5 24.0士0.3 23.7士0.7(a)
■ ユ ユ4
Alllinesweregrowninsoiluntilfullmaturity,Thewild-type Nipponbare,heterorygote,andnoinsertionnulllineswere harvestedat112daysafterplanting,whereasthe homorygotewasallowedtogrowfor140days.Fertilitywas determinedusingspikeletsonamainstemandspikelet weightwasmeasuredusingthesuperiorspikelet.Valuesare meah士SD, F勾u騰2.Ana瞬50fgehep⑩d幡 静 ㎝0εGS加.㎞ ㏄kα 腫 m聞 翻nt5. (a)RT-PCRdetectionofOsGS1;1mRNAfromroofs(lanesland 3)andleafblades(lanes2and4)in26-day-oldseedlingsofthe wildtype(lanesland2) andhomorygotelines(lanes3and4). (b)ImmunodetectionofGSIproteininextractfrommatureleaf blades(lanesland2)andleafsheaths(lanes3and4)of26-day-oldseedlings.Weseparated51gofsolubleproteinincxudeextract preparedfromthewildtype(lanesland3)andhomozygotelines (lane2and4).Affinity-purifiedanti-GS1-peptideIgGwasusedfor immunoblotdng. (c)日u廿o髄pro桐lesofGSi-semisy匹 量he廿cac価vityofextractsf「om theleafbladesof26-day-oldseedlings.Totalactivitiesloadedon theanion-exchangecolumnwere191and123nkatforwildtype (opencircle)andhomorygotelines(filledcircle),respectively.(c)
1 0 0 5 0 V 5 ロ ノ ヨ A ま ) 昏 写 個も 閑 ● ξ 5 。 ﹄ 01<5kbGS1レ
<0.8kb
GSl (b) ユ ユ 』L」(kDa) 97.4 66 GS2 翫act蓋onNOG 45 31 21.5 14.5 350 300 m 200n 官、
。
調
430る ヨ 藏 目 建 魁 § ＼ < 姦 日 毯 &
(a)
wild-type LBLSR ■05G冊'1 國056置1'2 口056置 轟3 LBRSP seedh魅9 皿ature 麓 90 町 O m O h b ( コ ジ コ タ ロ ジ ヱ ヱ ㎝ ㏄ ㏄ α 衡 伽 ■ 圏 □ R 9 m R 認 m る ヨ ユ < 臣 目 鑓 穐 9 壁 .＼ ︿ ン 配 一個 菖 己 s6ed賊ng mature Figure3.AccumulationofOsGS1;1, OsGS1;2,andOsGS1;3mRNAsinwild typeandOsGS?;1-knockoutrice P』nt5.O"an廿 撤iverea同imePCRwas per㎞r㎜ 」"singgene・5P㏄ 面cp藤m鰯 andvalueswerenormalizedrelativeto thevaluesofactinmRINAineach o閃an,asdesc曲edinExpe廟m㎝ ㎞l procedures. (a)AccumulationofOsGS1;1(blackbars), 0sGS1;2(hatchedbars),andOsGS1;3 (openbars)mRNAsinleafblades(LB), leafsheaths(LS},androots(R)of24-day-oldseedlings(seedling)orinthoseatthe eighthpositionoftheninthleafstageof rice(mature)grownhydroponically,and spikelet(SP)at5daysafterflowering. (b)AccumulationofOsGS1;1(blackbars), 0sGS1;2(hatchedbars),andOsGS>;3 (openbars)mRNAsintheOsGS1;9-knockout.Sampleswereofthesameage asin(a).(a)
transgene(一) t・・n・登護襲 丁0 .舳 ・g・n・「
『 マd舳
藷17婁1(σ
駆'1cDNA■1)
homozygote(一/一)heterozygote(+/一)noinsertion(+/+) E≡≡ヨ垂甕 藍 ヨ1-3窪 竃 臣 ≡≡≡ ヨ5transgene(+)
(b)
一一
ロ2.一4
一
一
1
.1=コ■==一= 1 巳 5 .﹂ に 、▼1壱
2 Tosl7inthe( 一/一)(一み) 0雪G拶1'1 transgene(一)(+) (C)12345一 一4一.ψ 一-■ 腫 璽 疇 蓬 建 葺 .' . .⋮ .▼ . (十ん) 6 (一)i
層 7 、一
一
`ρ7
6 7 (十み) ●一 レ ∂ ●[■● ●一(+)
S 寸 (十月 ・) Tos17-GS1;1 一 伽G31'1 置ansgene (一)(d)
コマ . .... ▼←舟)
2 ) 件 、 1 A V 韻 冒 ＼ WT 3 transgene 1り β17・Gl∼ 望'1圏国醒■ヨ α痂
Figure4.ComplementationofknockoutmutantsbyintroductionofOsGS1;1cDNA. (a)Diagrammaticrepresentationofvariousgenotypes.Termsofhomorygote,heterorygoteornoinsertionareusedfortheTos17 insertedintoendogenousOsGS1;1.Transgene(+)indicatesthepresenceofOsGS1;1-promoter::OsGS1;1cDNAinprogeny.Arabic numberscorrespondtothoseinFigure3b,c. (b)Comparisonofphenotypeofself-pollinatedprogenyaftertransformation.OsGS1;1cDNAunderthecontrolofitsownpromoter wasinセoducedintoheterozygotelines.Progenywith【 せansgene(+)】orwithout[transgene(一)1werecomparedin廿1eirphenotypew藍h wildtype(VVT)after26-daygrowth. (c)ConfirmationofthepresenceorabsenceofTos17-containingOsGS1;1structuralgene(upperpanel),thatofnativeOsGS1;1 structuralgene,andthetransgene,OsGS1;1-promoter::OsGS1;1cDNA(lowerpanel)inprogeny.Lane1,homorygoteonTos17 withoutOsGS1;1-cDNAtransgene;lane2,homorygotewithOsGS1;1cDNA;lane3,heterorygotewithoutOsGSI;1cDNA;lane4, heterorygotewithOsGS1;1cDNA;lane5,noinsertionwithoutOsGS1;1cDNA;lane6,noinsertionwithOsGS1;1cDNA;lane7,wild type.(d)Co而ma価onofexpressionof廿ansgenelnhomozygote(叩Perpanel)》 舳RT-PCR、EXPressionof丁bsブ7-ins飢edGSプ ∫プwas alsoconfirmedinhomorygote(middlepanel).ActinmRNAwasdeterminedasapositivecontrol(lowerpanel).Lane1,homorygote
on7bsブ7wi量h◎utOεGSブ デプ6DNA一 セansgeηe;lane2,hoπ めzygotew曲Os(∋Sブ ノブoDNA;Iane3,wild短paPCRwasca而edoutuslng asuitablesetofprimers,asdescribedhExperime耐alprocedures.Theredandwhiteareasofthescalebarin(b)are10cm・
(a)
NH+afib)Ng4+NO3
肇(c)NO3'
) d ( 屡 一N ! .﹂ i ﹂. -﹁ ﹁ ,.r ・ ← . 妻 蚤 一. こ . 箕 , 一7 4 , ー .ー ! WT(一1」) WT(一1ナ 、 ﹁﹂ . ... wr隻 一'一)i
wr(一1一) Figure5.PhenotypeOsGS1;1-knockoutriceplantsat18-day-oldseedlingsgrownwith variousformofnitrogen Wild-typerice(WT)andtheOsGS1;1knockoutmutants(一/一)weregrowninnutrientsolutionfor18 daysaftergermination. (a)1.OmMNH4CI(b)1.OmMNH4NO3(c)1.OmMNaNO3(d)Non桁ogen(a)
NH+4 (b)N】 日:4+NOゴ(c)
NQ3一(d)
一N .' を . 層 7 、 幽 F ^実 日'ツ 騙 実一'ツ 騙 r'ツ 嘔 受一1一♪ Figure6.PhenotypeOsGS1;1-knockoutriceplantsat18-day-OIdseedlingsgrownwithout n薩rogen響br愉efirst雪6days lNld-typerice(WT)andtheOsGS1;1knockoutmutants(一1一)weregrowninwaterforlldaysafter gemina暫onandhnu廿ientsolu価onw翫houtni冒ogenforano軌er5days.Th色n,ni智ogenwas suppliedtothenutrientsolutionandtheseedlingsweregrownforanother48h. {a)1.OmMNH,CI(b)1.OmMNH4NO3(c)1.OmMNaNO3(d)NonitrogenTabh2Compa1㎞o而eeaminoacidsi瞳 縦Dotsandleaveso伽i団 句pew薩h伽5eofOsGS1;¶ ㎞ocko鵬m』r罐5Amhoac旧5
Root Leafblade Leafsheath
Wildtype Homorygote Wildtype Homorygote Wildtype Homorygote
舗
螂
潔
雑
誰
伽
謝
㎞
紫
鵠
瓶
3.99tO.83 0.「匪9士O。06 6.94tO.78 0.52tO.06 0.55tO,07 0.13tO.05 0.75tO.15 α04士0.01 0.05tO.01 0」2」:0.02 0.t2to.02 0.03tO.01 0.「12全0.02 0.07ま0.01 0.07土0.01 1.25fO.16 0.壌4ま:0.02 0.01tO.00 0.03tO.01 t64士O.06 2.54tO.10 0.39tO.25 5.80tO.29 0.58tO,07 0.90tO.09 0.07tO.03 0.81tO.04 0.05tO.01 0.05tO.03 0.07tO.05 0.13tO.03 0.03tO.02 0」3土0.04 0.07tO.05 0.osto.02 1.51.士0.36 0.12tO.08 0.02fo.oo .0 .04士0.01 2.42tO.04 21.7t6.67 2.24tO.41 1rL8土2」4 2.11.士0.14 1.19士0.13 3.05tO.64 4.75tO.63 0.16fO.01 0.10tO.01 0.63tO.09 雪』8士0.15 0.13'fO.02 0.30tO.03 2.34tO.33 0。16±0.02 3.34tO.21 1.22tO.11 0.09tO.01 0.13tO.03 0.78fO.11 8.13t1.22 2.58tO.11 8.62tO.08 t56士O.15 1.45tO.02 3.32tO.24 9.55t2.06 0.で5士0.01 0.07±0。02 0.44tO.06 1.04tO.08 0。12士0.0{、 0.36tO.03 2.18tO.00 0.10tO.01 s.ntozs ossto.oa o.osto.oa O.08土0.01 0.94士O.0霊 202t7.91 0.38tO.18 9.81t3.36 1.20#0.34 1.88tO.62 0.92『 土0.39 t52士0.59 0.09tO.04 0.05tO.02 0」7士0.06 0.59tO.20 0.05tO.02 021土0.07 0.32tO.12 0.10士0.02 1.33tO.37 1.09tO.38 0.01tO.00 0.12圭0.05 0.66tO.13 17.7t3.04 0.72±0,02 14.6t4.36 1.95tO.05 4.01士O.11 1.99tO.41 2.89t1.46 0.15tO.03 0.12tO.03 0.31tO.03 1.07tO.02 0.10tO.01 0.44±0.11 0.23tO.04 0.10tO.01 2.54tO.32 1.60tO.24 0.03tO.00 0.20±0.01 1.61tO.22AminoacidcoMentsarelmolg4FWw謎hSD。'「 而凶ca㎏independentsampleswereused響br廿lee躍 セac睡onoff『eeamihoacids.Wild向pe "ceand伽eOεGSゴ;プ ㎞ockoutm伽 鵬weregro酬minwa㎏r勧r17daysa侃ergemina奮onandinn的 奮entsdu廿 ㎝w龍houtni曾oge面r another5days.Then,1.OmMNM4Gwassuppliedtothenutrientsolutionandtheseedlingsweregrownforanother48h.
(a)
霊 星 9 8 & 童 邑 ■ ●(b)
響 5 ﹁琴 婁(c)
1 憲 翼 冨 -量 ■ 2 騨 1 .,.」 ・.i ほ コド ロさノ ・ ...,● 鍵 野 ・.灘v'・ ., .∴ 、...籔'… 二 ..・6籔 ・∵, ∵9鐡 ・.,・ 孔 ・・濾 獲 ….謬 、・ ∴.・r..1諏 ∵ へ ..'一『・:●曾 ㌔9 ナ のモ 〆 七'"F㎏ 鵬7.Sc置 ㎞r圃5㎡5ゆa璽 ㎞蝕n5誕y㎝amb㎜ 膠穐y
倒9"a置i㎡en謂es㎞mw鳩 悌 ㎝ 血ex溜8wereロ{制 agai騰stm幽nt。n伽ey鋼s・ (a)Plotforleafblade. {b}Plotforleafsheath. (c)Piotforroot. 唯 慣
