病原性 Yersinia enterocolitica および Yersinia pseudotuberculosis の迅速検出法の開発

Title

病原性 Yersinia enterocolitica および Yersinia

_{pseudotuberculosis の迅速検出法の開発( 内容の要旨 )}

Author(s)

堀坂, 知子

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第179号

Issue Date

2005-03-14

Type

博士論文

Version

publisher

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/2233

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氏 名(本籍) 学 位 の 種 類 学 位 記 番 号 学位授与年月 日 学位授与の要件 研究科及び専攻 研究指導を受けた大学 学 位 論 文 題 目 審 査 委 員 (18) 堀 坂 知 子(東京都) 博士(獣医) 獣医博甲第179号 平成17年3月14日 学位規則第4条第1項該当 連合獣医学研究科 獣医学専攻 東京農工大学 病原性伽血血eβぬ和地および 旅路血血♪β甜ゐ山方eⅣ血の迅速検出法の開発 主査 東京農工大学 教 授 本 多 英 副査 帯広畜産大学 教 授 藤 崎 幸 副査 岩手大学 教 授 品 川 _弗 副査 東京農工大学 教 授 岩 崎 利 副査 岐阜大学 教 授 源 宣 蔵 汎 郎 之 論 文 の 内 容 の 要 旨 病原性施血由e刀ね〝00必ぬおよび施血血pβelJゐね如〝〟ゐ息由は､人 に主として 胃腸炎を､時には関節炎､結節性紅斑および敗血症などを起こす代表的な人獣共通感染症 原因菌であり､両者による感染症は総称してエルシニア症と呼ばれている｡ 本研究では病原性ア色別魁Ⅳα戒心由およびアpβ紺(ねね如〝〟ゐ且由の自然界における分布

や生態を解明していくための研究の一環として､これら病鹿体を環境中から迅速かつ高感

度に検出するために､近年開零されたIMS(Immunomagneticseparation)法とLAMP (Loop･mediatedi80thermalamplification)法を応用し､最適な検出条件を設定すると ともに､その検出感度や特異性について検討した｡ 1.冷血血β∬血畑地0:8に対する抗体を用いたIMS法によるre∬ぬⅣα肋0:8 の検出 近年､東北地方で患者が散発している-ァe月ね〝血0:8の0抗原に対する抗体を用 いたIMS法を開発し､河川水や食品などからの掩血血の検出に一般的に用いられてい るアルカリ処理法と比較しながら検出感度や特異性について検討した｡供託菌株としてr e月ね∫り〝〟ぬ0:8の4株を用いた｡ye月ね〝の∬ぬ0:8を実験的に河川水に接種し､IMS 法とアルカリ処理法で回収率を比較すると､接種菌に新鮮培養菌を用いた場合にはやや

-240-IMS 法のほうがアルカリ処理法より優れている程度であったが､損傷した y 甜ね〝の〟ぬ0:8を用いた場合に鱒､IMS法では菌量が101∼102CFU/mlの場合まで検 出されたのに対し､アルカリ処理法では10さ∼104CFU/mlの場合までしか検出されず､IMS 法はアルカリ処理法に比べて明らかに高い検出率を示した｡また､損傷した ア 8月ね上り00〟〟由0:8をIMS法で分離する際､VYE培地に抗生物質を含まない培地を重層し た選択培地を用いた場合が最も回収率が高かった｡これらのことから､y e加e∫℃00〟ぬ の0抗原に対する抗体を用いたIMS法は､アルカリ処理法に比べ環境中から損傷した菌 を検出するのに優れており､また､分離選択培地としてVYEの重層培地が適していると 考えられた｡ 2.YidAに対する抗体を用いたIMS法による病原性肋由血の検出 環境中から病原性アeJ】ね∫℃00〟〟由およびア♪β錯(わ加ゎ〝打ゐ由に共通する菌体外膜 抗原であるYadAに対する抗体を用いたIMS法を開発し､その検出感度や特異性について 検討した｡供試菌株として､病原性ye月ね∫り00〟ぬ4株､ならびにこれらからプラスミ ドを欠落させたもの4株､および耳pβ錯(わ加ゎ〝打ゐ且由2株の計10株を用いた｡今回開 発したIMS法により､1払dA _{をコードする病原性プラスミドを保有する病原性} ア 錯ね〝Cク〟ぬおよぴy♪β錯(わね鮎〝〟ゐ由の供試菌株のすべてが検出可能であり､菌量 が101∼102CFU/mlの場合まで検出された｡また､病原性施血jbを実験的に河川水に 接種し､IMS法とアルカリ処理法で検出感度を比較した結果､IMS法ではいずれの供試菌 株においても菌量が102∼10さCf■U/mlの場合まで回収され､アルカリ処理法に比べて高い 検出感度を示した｡これらのことから､今回開発した1払dAに対する抗体を用いたIMS法 は､特異的かつ高感度に環境中から広く痛原性 ア _{e月ね〝00〃ぬ} および y ♪β錯ゐね加∫℃打ゐ由kを検出することが可能な方法であると考えられた｡ き.LA虻F法による病原性肋ね血の検出 近年開発された迅速かつ高感度な遺伝子診断法である LAMP _{法を病原性} ア 8月ね〝〝〟ぬおよびア♪β錯ゐ加ゎ〝Uゐβ血の検出に応尽し､開発したLAMP法の検出 感度や特異性を､.PCR法と比較しながら検討した｡供試菌株として､病原性 ア e月ね∫P00必ぬ10株､rpβeび(わ血鮎〝〟ゐ凰由21株､非病原性施用血血属菌6株およびそ の他のグラム陰性菌10株の計 47株を用いた｡標的遺伝子としては､病原性 ア 鋸由肌相通混血およびア♪β蝕(わね鮎∫C払わ由kの染色体上にそれぞれに特異的に存在するa〟 および血γ､ならびに両者の病原性プラスミド上に共通して存在する血Fを選び､プライ マーを設計した｡今回開発したLAMP法により､供試した病原性アβ月お∫Pα血およ びypβ錯(わね鮎∫紺ゐβぉのいずれの菌株とも保有する標的遺伝子が特異的に増喘され､ その検出感度はPCR法に比べ約10∼100借高く､100∼101C万一Uの菌量でも検出が可能で あった｡.また､検出に要する時間は､最も短い血yで30分間以内､最も長い乱〟でも60

法は､病原性アe創始和α漬揖由およびア♪β錯ゐ加ゎ〝Uゐ由を検出するための迅速で感 度の高い遺伝子診断法になり得るものと思われた｡ 以上のように､環境中から病原性ア紺ね〝00∬政治およびy♪β錯ゐねム∽払わ由を検出 するためにIMS法およびLAMP法を応用して最適な条件などを検討し､これら病原体を 環境中から迅速かつ高感度に検出するための方浜を開発することができた｡本研究で開発 した方汝は､今後これら病原性施ヱ血血の自然界における生態や疫学を解明し､これら病 原体の人への感染予防対策を図る上で､優れた調査解析ツールになり得るものと考える｡ 審 査 結 果 の 要 一旨 本研究は病原性施躇血由郎鹿川似批適および胞融通切削虚血施借血由を環境中から迅速かつ 高感度に検出するために､近年開発された手法であるIMS(Immunomagnetic8eparation)法と LAMP(b･mediatedisothermala血phfi飴tion)法を応用し､その最適な検出条件などを検討し たものである｡ 申請者はまず､ア甜お適0鳩の0抗原に対する抗体を用いた_別S法を開発し､河川水や食 品などからの施指血血の検出に一般的に用いられているアルカリ処理法と比較しながら検出感度や 特異性について検討した｡接種菌に新鮮培養菌を用いた場合にはややm唱法のほうがアルカリ処理 汝より優れている程度であったが､損傷したy郎鹿川の放適0:8を用いた場合には､IMS法はアル ヵリ処理法に比べて検出率が高いこと､ならびに損傷したア即ぬⅣα肋0‥8をMS法で分離す

る際､ⅤⅧ培地に抗生物質を含まない培地を重層した選択培地を用いた場合が最も回収率が高い土

とを明らかにした｡ 次いで､病原性ア即ぬ代肋およびy渾剛血血ぬ閻血由をともに検出するために､両菌種 が共通して産生する菌体外膜タンパクである協dAに対する抗体を用いたMS法を開発し､その検 出感度や特異性について検討した｡今回開発したIMS法により､協dAをコードする病原性プラスミ ドを保有する病原性y班ぬ畑地およびy♪脚血ぬ加血血のいずれもが検出可能であり､ 菌量が101∼1伊CFU/mlの場合まで検出■した○また､これら病原性施指血血を実験的に河川永に接 種し､Ⅱ止S法とアルカリ処理法で検出感度を比較した結呆､IMS法ではいずれの供試菌株において も菌量が102∼103CFU/mlの場合まで回収し､アルカリ処理法に比べて高い検出感度であることを 示した｡ 最後に､近年開発された迅速かつ高感度な遺伝子診断泣であるLAMP法を病原性ア錯ぬ血 およびyp郎〟血血加血血の検出に応用し､病原性r餌ぬ適およびア押Ⅳ血f油虫 の染色体上にそれぞれに特異的に存在する丘ガおよび血Ⅵならびに両者の病原性プラスミド上に共 通して存在する血ダを標的遺伝子として開発したU劇貯法の検出感度や特異性をPCR法と比較し ながら検討した｡今回開発したL心慮P法により､病原性 y甜ぬ適およびy 押肌わ血ぬⅥ虎姫ぁのいずれの菌株とも保有する標的遺伝子が特異的に増幅され､その検出感度は

-242-PCR法に比べ約10∼1(カ倍高く､■10P∼101CFUの菌量でも検出が可能であることを示した｡また､ 検出に要する時間は､最も短い血γで30分間以内､最も長い威Jでも60分間以内であった｡ 以上のように､申請者は環境中から病原性g即ぬ肋およびア♪甜び血山鹿止旭由を検出す るためにm岱法およびLAMP法を応用して最適な条件などを検討し､これら病原体を環境中から迅 速かつ高感度に検出するための方法を開発した｡本研究で廟発した方法は､今後これら病原性 施摺血血の自然界における生態や疫学を解明し､これら病原体の人への感染予防対策を図る上で､優 れた調査解析ツールになり濁るものと期待される｡ 以上について､審査委鼻会全員一敦で本論文が岐阜大学大学院連合獣医学研究科の学位論文として 十分価値があると静めた｡ 基礎となる学術論文 1)題 目:Sewitiveand8PeCificdetectionof施血由pseⅢあtzL地由byloqp-mediated 由otbemd8mp出払at血n･ 著 者 名:Ho血血,T,F両iね,K,Iwぬ,℃,Nakad由,A,Okaぬ鴎AT,Ⅱ○曲,℃, 恥血卯￠払T,Honda,E.,Ⅶbm血,Y,andH野a$bda血,E･ 学術雑誌名:JburnalofChmicalMicrobiology 巻･号･貢･発行年:42(11):5349-5352,2004 既発表学術論文 1)題 目:PulBed･Seklgelekctrophore8i8indilkrentiationof物eb血女8peCie88t 著者名:0kntani,AT,Uto,T,Thmi印Chi,T,Horisakn,T,Horikita,T,Eaneko,Kand Haya8旭a血,H. 学術雑誌名:あⅦ血ofCh血dMiα止血b訂 巻･号･貢･発行年:3決11):亜32一朝36,2001 分題 目:我が国に飛来する水鳥における倣お属菌の保有状泳 者者名:渡辺麻衣子,Okaね鴎AT,茂田良光,岩田剛軌■堀坂知子,堀北哲也林谷秀樹 学術雑誌名:獣医疫学絆誌 巻･号･貢･発行年:2(カ:77-83,2002 3)題 _{目:Increa8ed8eがitivityinPCRdetectionoftdh-pO$itive倣おpaLdaeLZ2ゆおzein} 8e血dw封血pⅦ:追edtemplaねDNA 著者名:Eara･馳血,Y,E鮎ugちY,追u血もA,Ho血濾a,T,Eaw舶Ⅵ鵬℃andEumag如,S･ 学術雑誌名:J血mdd如Pm喚d加n

4)題 目:Antomatedribtyping,ar叩idbTPingmethodforand搾i80f抽血thtir8PP.8trainB 著者名:蝕a叫A℃,ぉも址awa,Mり｢払$hda,Sリ鮎貼gud亘M.,恥n00,K,Og8WちM., Ho血,℃,Ⅱ0血aka,℃,恥血gue払T,ぬb,YandHaya8bda血,H. 学術雑誌名:Ⅵ始あwndofⅥ血rh釘yMe血d鮎始n伐 巻･号･貢･発行年:66(㊥:729-733,2004