Polymerase Chain Reactionによる水痘 -帯状疱疹ウイルス株間の異同判定と臨床的応用
24
0
0
全文
(2) 博 士 学 位 論 文. PolymeraseChainReactionに. よ る 水 痘 一 帯 状. 庖 疹 ウ イ ル ス 株 間 の 異 同 判 定 と臨 床 的 応 用. 平 成7年11月. 近畿大学大学院医学研 究科 内科学 系専 攻(指 導:手 塚. 田. 村. 隆. 正 教 授). 弘.
(3) PolymeraseChainReactionに. よ る 水 痘 一 帯 状. 庖 疹 ウイル ス株 間 の異 同判 定 と臨床 的応 用 idAt*N*SZW4tftV M. 44. (114:TW. Differentiation. by. polymerase. of. chain. reaction. strain. virus. and. clinical. application. Tamura of. University. Dermatology,. School. of. : Prof. Tadashi. 抄 水 痘 一帯 状 庖 疹 ウ イ ル ス(VZV)感. MC. varicella-zoster. Department. (Director. V,. T. Takahiro. Kinki. 14. Medicine,. Tezuka). 録. 染 症 に 関 す る い わ ゆ る 分 子 疫 学 的 研 究 は,単. 純 ヘ ルペ ス ウイル ス. 感 染 症 の そ れ と 比 較 し て 非 常 に 遅 れ て い る.本 研 究 で は,polymerasechainreactionを 間 の 異 同 判 定 を,VZVゲ IN-K断. ノ ム 上 に存 在 す るR1,R2,R4,R5の4箇. 用 い てVZV株. 所 の 反 復 配 列 の 反 復 数 とPst. 片 間 切 断 点 変 異 を 解 析 す る こ と で 試 み た.. は じめ に 前 述 のVZVゲ. ノ ム 上 の5箇. 所 の 解 析 で 株 間 の 異 同 判 定 が 可 能 か ど うか を 検 討 す る た め に,34. 人 の 帯 状 庖 疹 患 者 か ら個 別 に 得 た34株 に っ い て 解 析 し た. R1は18bp単 bp単. 位 が5∼7回. 位6回,15bp単. と15bp単. 位 を は さ ん だ88bp単. た.PstI切. 位 が7回. 位 が4回. か ら18回 に わ た り,最. 位 の 構 造 の 繰 り返 しが1回. 断 点 変 異 は切 断 点(+)が27株. ム 上 の5箇. の 組 み 合 わ せ よ り成 り立 っ て お り,最 も 多 い の は18. 位10回 の 組 み 合 わ せ で13株 あ っ た.R2は42bp単. が11株 と 最 も 多 か っ た.R4は27bp単 R5は24bp単. 位 が7∼12回. も 多 い の は9回. か ら3回. で 多 数 を 占 め て い た.ま. か ら13回 に わ た り,8回. ま で あ り,2回. た,34株. で9株. で あ っ た.. が28株 と最 も多 か っ. す べ て に つ い てVZvゲ. ノ. 所 を 解 析 し た 結 果 は ,株 間 で 同 一 の パ タ ー ン を 示 す も の は な く,こ の 方 法 で 株 間 の 異 同 判 定 が. 可 能 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た. さ ら に 本 研 究 で は,臨 床 的 応 用 を 試 み る た め 以 下 の11症 例 に っ い て 検 討 し た.帯 状 庖 疹4例. にっ いて は. 病 日 別 と 病 変 部 内 の 離 れ た 部 位 か ら検 体 を 採 取 して 比 較 し た と こ ろ,同 一 患 者 内 の 各 検 体 は 同 一 株 と判 定 さ れ た.ま. た,汎 発 性 帯 状 庖 疹 で は 原 発 疹 と 汎 発 疹 を,眼 部 帯 状 庖 疹 で は主 病 変 と 結 膜 か ら,複. 庖 疹 で は2箇. 所 の 病 変 部 か ら得 た 各 検 体 は,同 一 患 者 内 で は 同 一 株 で あ っ た.帯. 仮 説 が あ る が,学 校 の 寮 内 で ほ ぼ 同 時 期 に 発 症 した 帯 状 庖 疹2例. 一1一. 発 性帯 状. 状 庖 疹 は流 行 す る と い う. か ら得 た 株 は 異 な る 株 で あ っ た.一. 方,.
(4) 家 族 内 で 発 症 した水 痘2例. は同一 株 に よ る もので あ っ た.以 上 の よ うに,本 方 法 はVZV感. 染症 の疫 学 的. 検討 や 発 症 機 序 の解 析 に 有 用 で あ る と考 え られ る.. Key. words. : varicella-zoster chain. reaction,. virus,strain repeat. region. diff erentiation,. molecular. epidermiology,. polymerase.
(5) 緒. 言 水 痘 ・帯 状 庖 疹 ウ イ ル ス(VZV)は. ヒ トを 宿 主 と す る 病 原 体 で あ る.そ. の初 感 染 の 臨 床 像 は水 痘 で あ. り,水 痘 が 治 癒 した あ と 神 経 節 に 一 生 涯 潜 伏 感 染 し,そ の 後,宿 主 の 免 疫 能 が 低 下 した 場 合 に 帯 状 庖 疹 と して 発 症 す る.特 に 高 齢 者 が 帯 状 庖 疹 に 罹 患 す る と皮 疹 治 癒 後 に 神 経 痛 が 残 る こ と が 多 く,そ の 後 の 人 生 が 悲 惨 な も の と な り か ね な い.ま た,時. に 髄 膜 炎,脳. あ る い は 死 に 至 る場 合 も あ る.し た が っ て,VZV感. 炎,眼. 合 併 症 な ど を 伴 い,重. 篤 な 後 遺 症 を 残 した り. 染 症 の 伝 播 や 発 症 機 序 を 検 討 す る こ と は,臨. 床医 に. と っ て 重 要 な 仕 事 の ひ と っ と考 え られ る. ウ イ ル ス の 伝 播 や 発 症 機 序 を 検 索 す る 方 法 の ひ とっ と して,ウ ム で 解 析 す る い わ ゆ る分 子 疫 学 的 手 法 が あ る が ,VZV感. イ ル ス 株 間 の 異 同 判 定 を ポ リモ ル フ ィ ズ. 染 症 に っ い て は 報 告 が 少 な い1-4.VZVと. ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス群 に属 す る単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス(HSV)株. 同 じ. 間 の 異 同 判 定 は,HSVDNAの. 制限. 酵 素 切 断 点 の 獲 得 と消 失,す な わ ち,点 変 異 の 有 無 の 解 析 に よ り行 わ れ て い る.坂 岡`に よ れ ば,BamHI, KpnI,SalIの3種 方,VZV株. 類 の 制 限 酵 素 を 用 い れ ば,HSV1型. 間 の 比 較 は,VZVDNAを12種. Ban皿,SalI,BamHI,EcoRIに. 類 の 制 限 酵 素 を 用 い て 切 断 した 電 気 泳 動 像 の 解 析 で も,PstI, よ る ウ イ ル スDNA切. み で あ る.し か し な が ら,実 際 に利 用 で き る の はPstI切 検 出 さ れ な い と さ れ て い る1'6.し. 株 間 の 異 同 判 定 が 可 能 で あ る と 述 べ て い る.一. 断 で1箇. 所 ず っ に点 変 異 が 検 出 さ れ て い る の. 断 点 変 異 の み で,そ. た が っ て,切 断 点 変 異 の 解 析 に よ るVZV株. れ以 外 の 変 異 は ま れ に しか 間の 異 同 判 定 は現 在 の と こ. ろ 困 難 な 状 況 に あ る. と こ ろ で,VZVゲ. ノ ム の 基 本 的 構 造 は 図1に. ユ ニ ー ク な 配 列 部(Us)の す る.ま. た,UL部. 示 し た よ う に,長. 結 合 か ら成 り ,さ ら にUs部. い ユ ニ ー ク な 塩 基 配 列 部(UL)と. の 両 末 端 に は 倒 置 反 復 配 列(TRs,IRs)が. の 両 末 端 に も短 い 倒 置 反 復 配 列(TRL,IRL)が. 1に 示 し た よ う にR1∼R5の 箇 所 に 存 在 す る.こ. 存 在 す る6.ま. 反 復 配 列 領 域 が 存 在 す る.な お,R4は. れ らR1∼R5の. 反 復 領 域 はVZV株. 短い. たVZVゲ. 存在. ノ ム上 に は 図. 倒 置 反 復 配 列 上 に 位 置 す る た め2. 間 で 反 復 数 の 違 い が 示 唆 さ れ て お り,制. 限 酵素. 切 断 像 で は 反 復 領 域 を 含 ん だ 切 断 断 片 サ イ ズ の わ ず か な 差 と し て 見 出 さ れ る7-12.仮 に こ れ ら の 領 域 の 反 復 数 の 違 い が 点 変 異 の 少 な いVZV株. 間 の 異 同 判 定 に 利 用 で き れ ば,臨. 床 ウ イ ル ス 学 的 に 有 用 と考 え ら れ. る. 最 近,臨. 床 ウ イ ル ス 学 の 分 野 で はpolymerasechainreaction(PCR)を. 用 い て ウ イ ル スDNAを. 検. 出 す る 報 告 が 盛 ん に 行 わ れ て い る'3」4.本 法 の 利 点 は ウ イ ル ス を 培 養 せ ず に ウ イ ル ス ゲ ノ ム を 直 接 取 り 扱 う こ と が で き る 点 に あ る.VZVはinvitroで の 点 が 現 在 ま でHSVと られ る.そ. の 点,PCR法. こ と が で き る.そ. 比 較 してVZVの. 非 常 に 増 殖 しに く い た め 多 量 のVZVDNAを. 分 子 疫 学 的 な 研 究 を 遅 ら せ る 原 因 の ひ とっ に な っ て い た と 考 え. を 利 用 す れ ば 微 量 の 検 体 か らで も検 索 に 必 要 な ウ イ ル スDNAを. こ で 本 研 究 で は,VZVゲ. 断 点 変 異 の 有 無 と共 にPCR法. 増 幅 して 得 る. ノ ム の 全 塩 基 配 列 が 明 らか に な っ て い る こ と か ら15,反 復 配 列. 部 の 反 復 数 を 解 析 す る た め の プ ラ イ マ ー を 設 定 して,臨 PstI切. 得 が た く,こ. 床 の 場 で 得 たVZV株. 間 に お け る反 復 数 の 違 い を. に よ り解 析 し,株 間 の 違 い が 判 定 で き る か ど う か を 検 討 し た.さ. ら に,実 際 に 臨 床 的 応 用 を 試 み た の で 併 せ て 報 告 す る.. 一3一.
(6) 図1.VZVゲ. ノ ム に お け る 反 復 配 列R1∼R5の. 位 置 とPstI切. 断点地図. 材 料 と方 法 1.対. 象 患 者 と材料 採 取 方 法. 材 料 は,1992年4月. か ら1995年3月. まで の期 間 に近 畿大 学 医 学 部 附属 病 院 皮 膚 科 と その 関連 病 院 を受 診. した 帯 状 庖 疹 患 者43例 と 水 痘 患 者2例 た.性 別 は 帯 状 庖 疹 で は 男 性23例,女 83歳 ま で で,水. 痘 は1歳. か ら採 取 し た.材 料 を 採 取 す る に あ た っ て は,患 者 か らの 同 意 を 得 性20例,水. と30歳 で あ る.そ. 痘 で は 女 性2例. の う ち 帯 状 庖 疹34例. で あ る.年. 齢 は,帯. は,VZVゲ. 状 庖 疹 で は12歳 か ら. ノ ム 上 の5箇. 株 間 の 異 同 判 定 が 可 能 か ど う か を検 討 す る た あ の 基 礎 デ ー タ用 の 材 料 と して,1患 を 採 取 し た.残. り11例 は,臨. ン セ ッ トで は が し,こ れ を1m4のphosphate-bufferredsaline(PBS)の 時 に 滅 菌 綿 棒 で 水 庖 底 を 擦 過 し て,こ. 一 患 者 に っ き 数 個 の 皮 疹 を ま と め て1本 水 痘 疹 な ど は,1個. 者 に っ き1検. 体 ずっ. 床 的 応 用 と し て 同 一 患 者 か ら数 検 体 を 採 取 した.. 採 取 方 法 は,病 変 が 水 庖 な い し膿 庖 の 場 合 は水 庖 蓋 を 滅 菌 勢 刀 で 切 り取 る か,あ. に 入 れ た.同. 所 の解 析 に よ り. る い は痂 皮 の 場 合 は ピ. 入 っ た セ ラ ムチ ュ ー 一ブ(Nunc). れ もす す ぎ 出 し た.水 庖,膿. 庖,痂. 皮 は原 則 と して 同. の セ ラ ム チ ュ ー ブ に 採 取 した .た だ し,帯 状 庖 疹 の 際 の 汎 発 疹 や. ず つ の 皮 疹 か ら材 料 を 採 取 し た,採 取 し た 材 料 は,PCR法. を 行 う 時 ま で 一80℃ の デ. イ ー プ フ リ ー ザ ー 内 で 保 管 し た. 2.テ PCR法. ン プ レ ー トの調 整 の 際 に 使 用 す る テ ン プ レ ー ト は 以 下 の よ う に 調 整 し た.前. Releaser⑮(Bioventure)20μ2をPCR用 P一 サ ー ク ラ ー ⑪(Toyobo)に. 述 の 各 材 料 の1μ2とGene. リア ク シ ョ ン チ ュ ー ブ(Assist)に て ウ イ ル ス ゲ ノ ムDNAを. 放 出 さ せ た.設. 入 れ て 混 和 し,こ. 定 温 度 と 時 間 は65℃30秒,8. ℃30秒,65℃90秒,97℃180秒,8℃60秒,65℃180秒,97℃60秒,65℃60秒,80℃10分 の 場 合 は,あ. らか じめ100μ2を30.000rpm,1時. れ をT. で あ る.材 料 が 少 量. 間 で 超 遠 心 し,沈 渣 にPBS(一)10μ4を. 加 え て再調. 整 して 用 い た. 3。 プ ラ イ マ ー の 設 定 反 復 領 域R1か R1領. 域 は 図2の. らR5の. プ ラ イ マ ー は す で に 報 告 さ れ て い るVZVの. よ う に18bp単. 位 のa,a',a"配. 列 と15bp単. 一4一. 全 塩 基 配 列15か ら設 定 し た.. 位 のb,b'配. 列 の 組 み 合 わ せ と,ひ.
(7) と っ の3bp単 た.プ. 位 のx配. 列 よ り成 る構 造 を も っ て い る.プ. ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 図3のR1-Aに. ラ イ マ ー は この反 復 領 域 を は さ む よ う に 設 定 し. 示 した,反 復 配 列 の 上 流 は177bp,下. た が っ て バ ン ド の 長 さ は,177+{18×(a,a'の. 反 復 数)+15×(b,b'の. 流 は264bpで. 反 復 数)+3}+264bpと. 計 算 で き る.. a a ab b X. Rl. GGACGCGAT⊆GACGACΩA GGACGCGATTGACGACGA. 18bp. GGACGCGATCGACGACAA GGGAGAGGCGGAGGA GGACGCGGCGGAGGA GGA. 15bp. 42bp 42bp. GCGGGATCGGGCTTTCGGGrAGCGGCCGAGGT. 32bp. X. aaaaaaax. aGCCC㏄. ㏄A. 9bp. a'GACCGrCCA. gbp. xGCC. 3bp. a. CCCCGCCGATGGGGAGGGGGCGCGGTA. 27bp. X. CCCCGCCGATG. llbp. Dumas株:. R5. 3bp. GCGGGATCGGGCTTTCGG(πAGCGGCCGAGGTGGGCGCGACG. a. R4. l5bp. GCGGGATCGGGCTTTCGGGへAGCGGCCGAGGTGGGCGCGACG. a. Dumas株:. R3. 15bp. abbabbabbabababx. H.S1株:. R2. 且8bp. ヨaaaax. aACTGAAAACGCTCAAATTGCCTTTTGGAGGCCTGCCCAACGGCCATTA TCCCTTGGATCTAAGATTGATTTGCGGTAACGTTTGCCAA88bp a'ACTTAAAACGCTCAAATTGCCTTTTGGAGGCCTGCCCAACGGCCATTA TCCCTTGGATCTAAGATTGATTTGCGGTAACGTTTGCCAA88bp bTCAAGCTTTAAAAACGTACCCCAA24bp. YS株:. abalba「ba'. L_」L_」. PstI. N断. _」. 片. ↓K断. 片. 一 一 一CTGCAG-一. 一. 一 一 一CTGCGG-一. 一. 図2、R1,R2,R3,R4,R5,PstIN-K断. 片 間 切 断 点 の構 造. 一5一. あ る.し.
(8) く﹂ ご﹂. - A B R. ノ 5-TCGTATAATCCTTGGACCGTA-3. ーACTGAACTCCGAGATGGATCA-3 。GGACGCGATCGACGACGA-3. 51-TCGTATAATCCTTGGACCGTA-3. R2 5-AGGGTATGGATTGTATTCCGCC-35-TCGCGTGTATACAATTATCGA-3 R3 A B. 5-CCGGATTATGTGGTCTTTTG-3 5-CAAATTATTGCCGGTTATGCGC-3. 5-ATGGAGGTGGTTAATTGCTTA-3!. C. 5-GGGAACGAAAAGASCTCGATTC-3. 5-CGAGTCATCTGTCGGAATGGA-3〆. 5-GACAATTGG胃AmGGTGG-3'. ノ. R4. ノ. 5-AAGGGATACCAGACATGTGAA-35-CGGGTrTACATGCCTCAGATATG-3 5 R B. fJ く﹂. A. 一ACTGAAAACGCTCAAATTGCC-3. 5-TGCCTTAAACATCCACAGTCT-3. -GGCAAATACTTAGACCGTTTT-3. 5'-TAATGGACTTTTAATGGATTG-3. Pst-1. 5,TTCAGCCAACGTGCCAATAAA-3. 5.GACGCGCTTAACGGAAGTAAC3. 図3.Polymerasechainreactionに A=ア. しか しな が ら,R1領. 域 は18bp単. 使 用 した プ ライ マー. デ ニ ン,C;シ. 位 と15bp単. ト シ ン,G=グ. ア ニ ン,T=チ. ミン. 位 の ふ た っ の 組 み 合 わ せ が 反 復 す る 構 造 で あ る こ と か ら,. ま ず 片 方 の 単 位 の 反 復 数 を 決 定 して か ら残 る単 位 の 反 復 数 を 割 り 出 す こ と に し た.そ 復 数 を 決 定 す る た め にa配. 列 と 配 列 が 同 じ プ ラ イ マ ー を 作 製 してPCR法. わ ち,図2の. よ う に 例 え ばH-S1株. 列 を(+)側. の プ ラ イ マ ー と して 用 い れ ば 反 復 数 と 一 致 す る6本. 際,18bp単. た が っ て,H-S1株. で は42bp単. む よ う に設 定 し た.プ し た が っ て 、PCR産. 2).R3領. 位 のa,a'配. 域 は9bp単 域 はGC量. 量 の 多 い 配 列 のPCR法. の バ ン ドが 検 出 で き る は ず で あ る.こ. の. のプラ. の プ ラ イ マ ー と 同 一 の も の を 用 い た.し. バ ン ドが 検 出 で き る は ず で あ る. 列 よ り成 り立 っ 領 域 で あ る(図2).. 示 した.反 復 配 列 の 上 流 は80bp,下. 物 の バ ン ドの 長 さ は,80+{42×(a,a'の. の 多 い9bp単. な. が 報 告 さ れ て い る 二5.プラ イ マ ー は こ の 反 復 領 域 を は さ み こ. ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 図3に. 位 のa,a'配. を 行 っ た(図3R1-B).す. 位 の 反 復 数 が 計 算 で き る.な お(一)側. 列 の 反 復 と ひ と っ の32bpのx配. 位 の 反 復 数7回. 位 の反. 所 あ る こ と が す で に判 明 し て い る こ と か ら,a配. 域 を は さ む プ ラ イ マ ー セ ッ トの(一)側. で は510,462,414,366,333,300bpの. 域 は42bp単. 例 え ばDumas株. R3領. 列 が6箇. 位 の バ ン ド間 の 間 隔 を 測 定 す る こ と で15bp単. イ マ ー は,前 述 のR1領. R2領. で はa配. こ で18bp単. 列 の 反 復 と ひ とっ の3bp単. 反 復 数)+32}+62bpと 位 のx配. 流 は62bpで. あ る.. な る.. 列 よ り成 り立 っ 領 域 で あ る(図. 位 が100回 近 く繰 り返 す こ と が す で に 示 唆 さ れ て い る15.通 常 ,GC. は 変 性 温 度 を 高 温 に設 定 す る 必 要 が あ る た め に,PCR法. 一6一. に は不 向 きとされ て い.
(9) る16.そ こ で プ ラ イ マ ー は 反 復 配 列 を は さ む よ う に3種 イ マ ー の 塩 基 配 列 は 図3に R4は27bp単 2).例. 列 の 反 復 と ひ とっ の11bp単. で は27bp単. 域 を は さ ん で 図3の. 位 が5回. 位 のa,a'配. い る(図2).今. R5-Aに. 反 復 数+11}+96bpと 位 のb配. の プ ラ イ マ ー を88bp単. た が っ て,図2の. 下 流 は96bpで. ラ イ マ ー は この 領. あ る.し. た が っ て,PCR. 計 算 で き る.. 列 を は さみ こむ組 み 合 わせ が 反 復 す る構 造 を と っ て 位 内 の1番. の プ ラ イ マ ー は 反 復 配 列 か ら840bp下. 示 した.し. 繰 り返 しが3回. 列 の 組 み 合 わ せ よ り な る 領 域 で あ る(図. 反 復 し て い る こ と が 報 告 さ れ て い る'5.プ. 列 が24bp単. 回 は(+)側. て 設 定 し,(一)側. 位 のx配. よ う に設 定 し た.反 復 配 列 の 上 流 は327bpで. 産 物 の バ ン ドの 長 さ は327+{27×aの R5は88bp単. ラ. 示 した.. 位 のa配. え ばDumas株. 類 ほ ど作 製 し て 増 幅 可 能 か ど う か 検 討 し た.プ. 目 か ら21番 目 ま で の 塩 基 配 列 に一 致 さ せ. 流 に 設 定 し た.プ. よ う に,例 え ばYS株. で は88bp単. ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 図3の. 位 が24bp単. 位 を は さん だ 構 造 の. で あ る こ とが す で に 判 明 して い る こ とか ら12,こ の プ ラ イ マ ー で928,1040,1152,1264bpの. 4本 の バ ン ドが 検 出 で き る は ず で あ る.な お2回. な ら ば3本,1回. な ら ば2本. の バ ン ドが 検 出 で き る こ と. に な る. 同 時 に,本 藤6の 設 定 し た こ の 領 域 を は さ ん だ プ ラ イ マ ー(図3,R5-B)も ラ イ マ ー に よ る反 復 数 を 確 認 した.こ 583bpの. 位 置 に1本. PstlN-K断. 片 間 にPstlが. 点 変 異 して い る た めPstlで. PstlN-K断. 化 に よ り286bpと356bpに 4.PCR法. 認 識 す るCTGCAGの. 配 列 が あ り,PstI切. 断(一)変. 消 化 さ れ な い こ と が 判 明 して い る6.. 増 幅 で き る.PCR産. の プ ラ イ マ ー はN-K. 物 は 切 断 点(+)で. あ れ ばPstIの. 消. の温 度 と時 間設 定 はGeneAmp⑭PCRReagentKit(宝. 酒 造)を. 塩 酸pH8.3,15mM塩. 2,dATP2μ2,dCTP2μ. 乏,dGTP2μ. フ゜ラ イ マ ー 各5μ2,テ. 乏,dTTP2μ. ン プ レー ト10μ2,再. に 同 じで94℃1分,55℃2分,72℃3分 グ ネ シ ウ ム 濃 度2.OmMに. 用 い て 行 っ た.10倍. 反 応 緩 衝 液(500mM塩. 化 マ グ ネ シ ウ ム2,0.01%(W/V)ゼ 乏,AmpliTaq⑧DNAポ. 蒸 留 水61.5μ4,計100μ. サ ー モ サ ー ク ラ ー はTP-Cycler-100⑬(Toyobo)を. PCR産. な らば. 切 断 さ れ る.. 化 カ リ ウ ム,100mMTris一. 5.電. な ら ば471bp,3回. 片 間 切 断 点 変 異 は 本 藤6の 報 告 した プ ラ イ マ ー を 用 い た(図3).こ. 断 片 間 を は さ む よ う に 設 定 して あ り,642bpを. PCR法. な ら ば359bp,2回. 回作 製 した プ. の バ ン ドと して 検 出 で き る6.. 片 間 変 異 は,N-K断. 異 株 で はAがGに. の 場 合 は,反 復 数1回. 使 用 し て,今. ラ チ ン)10μ リメ ラ ー ゼ0.5μ. 乏 を 調 整 し てPCR法1?を. 乏,. 行 っ た.. 使 用 した.設 定 温 度 と時 間 は す べ て の プ ラ イ マ ー 共. で あ る.な お,R4の. プ ラ イ マ ー 使 用 時 は 反 応 緩 衝 液pH9.5に. マ. 調 整 した.. 気 泳動 物 は1.2%ア. ガ ロ ー ス ゲ ル(Biorad)内. で200V,95mAで1時. マ ー カ ー はBioMarkerLow⑬(BioVentures),も. し く はDNAMWmarker4⑪(和. い た.泳 動 後,ゲ ル を エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ドで 染 色 し,UVイ し,写 真 撮 影 を 行 っ た.ま %NuSieve3:1ア. たR1のPCR産. 間 半 電 気 泳 動 し た.DNAサ. ル ミ ネ ー タ ー(フ. 光 純 薬)を ナ コ シ)で. 一7一. 使 用 し,DNAサ. 用. バ ン ドを 検 出. 物 に つ い て は バ ン ドの 正 確 な 位 置 を 確 認 す る た め,ゲ. ガ ロ ー ス ゲ ル⑪(FMCBioProducts)を. イズ. ル は3. イ ズ マ ー カ ー と し て20.
(10) bp間. 隔 の 読 み と りが 可 能 なSuperladder-low⑪(フ. に は,PCR産. 物5μ4とPstI(宝. 恒 温 槽 に て37℃1時 6.プ. 酒 造)2.0μ2,添. 使 用 し た.な. 付 バ ッ フ ァー2.5μ2,再. お,PstI変 蒸 留 水15.5μ. 異 領 域 の検 討 乏 を 調 整 し,. 間 処 理 後 に 前 述 の よ う に ゲ ル 内 で 泳 動 し て エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド染 色 し た.. ラ イ マ ー の特 異 性. 今 回 使 用 し た す べ て の プ ラ イ マ ー は,VZV以 HSV2型(UW-268株),Epstein-Barrウ. サ イ ト(ク. ラ ボ ウ)を. 外 の ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス 群 に属 す る 葦{SV1型(HF株),. イ ル ス(B95-8株),ヒ. ヒ トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス ー6(HST株),ヒ. トサ イ ト メ ガ ロ ウ イ ル ス(AD169株),. トヘ ル ペ ス ウ イ ル ス ー7(KHR株). 同 一 条 件 で す べ て 検 出 しな い こ と を 確 認 した.図4に. を 示 し た.(HST株,KHR株,AD169株 所. ナ コ シ)を. は大 阪 大 学 医学 部. ライ マ ー の特 異 性 の 検 討 M.W.. :分 子 量 マ ー カ ー. レ ー ン1. :単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス1型. レ ー ン2. :単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス2型. レ ー ン3. :ヒ. レ ー ン4. :EBウ. レ ー ン5. :ヒ. ト ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス6型. レ ー ン6. :ヒ. ト ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス7型. レ ー ン7. :培 養 ヒ ト ケ ラ チ ノ サ イ ト. レ ー ン8. :水 痘 ・帯 状 庖 疹 ウ イ ル ス. N.C。. :陰 性 コ ン ト ロ ー ル. トサ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス イル ス. 一8一. プ ラ イ マ ーR1-Aに. 山 西 弘 一 教 授,B95-8株. 西 蓮 寺 剛 博 士 よ り分 与 を 受 け た). 図4.プ. ,お よ び 培 養 ヒ ト ケ ラ チ ノ よ る結 果. は国 立 予 防 衛 生 研 究.
(11) 結. 果 1.基. 礎 デ ー タの解 析. VZVゲ. ノ ム 上 の5箇. 所 の 解 析 で 株 間 の 異 同 判 定 が 可 能 か ど うか を 検 討 す る た め の34検 体 の 結 果 は 以 下. に 示 し た. R1領. 域 は,例 え ばH-S1株(国. 立 公 衆 衛 生 院 本 藤 良 博 士 よ り分 与)で. は さ ん だ プ ラ イ マ ー を 用 い た 場 合 に687bpの. 位 置 に1本. は 予 想 した よ う に,反 復 配 列 を. の バ ン ドが 検 出 さ れ た.ま た,反. し た プ ラ イ マ ー を 用 い た 場 合 は510bp,462bp,414bp,366bp,333bp,300bpの. 位 置 に6本. 出 で き た(図5).. 図5,R1領. 域 のPolymerasechainreactionに レ ー ン1:HS-1株(18bp単. M.W.:分. よ る検 出 位 に 一 致 す る フ゜ラ イ マ ー). レ ー ン2:HS-1株(R1領. 域 を は さ ん だ プ ラ イ マ ー). 子 量 マ ー カ ー. 一9一. 復配列 部 に一 致 の バ ン ドが 検.
(12) 34検 体 の 解 析 結 果 を 図6aに 4株,18bp単 単 位7回. 位6回 と15bp単. の 反 復 数6回 回,7回. と15bp単. 位8,9,10,11回. 位10,11,12回. と15bp単. と10回,7回. 示 し た.18bp単. 位 の 反 復 数5回. と15bp単. の 組 み 合 わ せ が 各 々2,1,4株. 体 の 各R1,R2,R4,R5,PstI領 a:R1領. 域 の反 復 数. b:R2領. 域 の反 復 数. c:R4領. 域 の反 復 数. d:R5領. 域 の反 復 数 片 間 切 断 点 の有 無. 一10一. た18bp. で あ っ た.今 回 の 結 果 で は,18bp単. と11回 の 組 み 合 わ せ は 少 な く各 々1,1,2株. e:PstIN-K断. の組 み 合 わ せ が. の 組 み 合 わ せ が 各 々1株5株,13株,4株,ま. 位 の 反 復 数10回 の 株 が 一 番 多 く,38%(13/34)を. 図6,34検. 位 の 反 復 数9回. 占 め て い た.逆 で あ っ た.. 域 の解 析 結 果. に,6回. 位 と8.
(13) R2領. 域 は,42bp単. 反 復 数4回. 位 の 反 復 数 が4回. が1株,5回. が2株,6回. 1株 で あ っ た(図6b).今 た.4回. が5株,7回. お よ び12回,13回 が5株,8回. 回 の 結 果 で は,反 復 数6回. の 反 復 数 で は342bpの. 7回 で は468bp,8回. か ら9回. か ら9回. で あ っ た.反. が11株9回. が8株,12回. で は552bp,12回. が1株,13回. の 株 が85%(29/34)と. 位 置 に一 本 の バ ン ド と し て,ま た 反 復 数5回. で は510bp,9回. 復 数 と株 数 に関 して は,. で は678bp,13回. が. 多数 を 占めて い. で は384bp,6回. で は720bpの. で は426bp,. 位 置 に1本. のバ ン. ド と して 検 出 で き た(図7).. 図7.R2領. 域 のPolymerasechainreactionに M.W.:分 レ ー ン1:4回.レ. ー ン2:5回.レ. ー. ン3:6回.レ. ー ン4:7回. レ ー ン5:8回.レ. ー ン6:9回.レ. ー. ン7:12回.レ. ー ン8:13回. N.C.:陰. R3領. 性. 域 は前 述 の よ う に フ゜ラ イ マ ー を3種. え て み た が,予 想 し た よ うに,G,C量 ず か に1種 ま た,仮. よ る 反 復 数 の 検 出. 子 量 マ ー カ ー. 類 の プ ラ イ マ ー で1株. コ ン ト ロ ー ル. 類 ほ ど 作 製 し,さ ら に 設 定 温 度 な どPCR法. の 多 い こ の 領 域 で はPCR産 の み1000bp以. 物 は ほ と ん ど 検 出 で き な か っ た.わ. 上 の 位 置 に うす い バ ン ド と して 検 出 で き た の み で あ っ た.. に す べ て の 株 で バ ン ドが 検 出 で き た と して も,1000bp前. の は ほ と ん ど不 可 能 で あ る.し た が っ て ,R3領. の際 の条 件 を変. 域 は 今 回 のPCR法. と判 断 し た.. 一11一. 後 の 位 置 で9bp単 に よ るVZV株. 位 の変化 を解析 す る 間 の 解 析 に は不 適 格.
(14) R4領. 域 は,27bp単. 7回 が2株,8回. 位 の 反 復 数 が7回. が3株9回. 16回 が2株,17回. が1株. を 占 め て い た.反. 復 数7回. で は731bp,12回. か ら14回 お よ び16回 と18回 で あ っ た.反 復 数 と 株 数 に 関 し て は,. が9株,10回. が5株,11回. で あ っ た(図6c).今 で は623bpの. で は758bp,13回. が4株,12回. 回 の 結 果 で は,反. 位 置 に,8回. で は785bp,14回. が4株,13回. 復 数9回. で は650bp,9回 で は812bp,16回. が2株,14回. が2株,. か ら12回 の 株 が64.7%(22/34). で は677bp,10回 で は866bp,18回. で は704bp,11回 で1ま920bpの. 位置に. 1本 の バ ン ドと し て 検 出 で き た(図8).. 図8.R4領. 域 のPolymerasechainreactionに M.W.:分. ー ン2:8回.レ. ー ン3:9回.レ. ー. ン4:10回.. レ ー ン5:11回.レ. ー ン6:12回.レ. ー ン7:13回.レ. ー. ン8:14回.. レ ー ン9:16回.レ. ー ン10:18回. 性 コ ン ト ロ ー ル. 域 は,反 復 数 の 違 い に よ り 明 瞭 に2本. 1回 が5株,2回 が1回. 子 量 マ ー カ ー. レ ー ン1:7回.レ. N.C.:陰. R5領. が27株,3回. の 場 合 は2本,2回. bp,1040bp,928bpで 同 一 の 材 料 で 反 復 数1回. よ る反 復 数 の 検 出. が2株 は3本,3回. あ る(図9).同 で は359bp,2回. か ら4本. で,反 復 数2回 は4本. ま で の バ ン ドを 検 出 で き た.解 析 結 果 は,反. の 株 が79.4%と. 多 数 を 占 め て い た(図6d).反. の バ ン ドが 認 あ ら れ た.バ. 時 に 行 っ たR5領 で は471bp,3回. 一12一. 復数 復数. ン ドの 位 置 は 各 々1264bp,1152. 域 を は さ み こ む プ ラ イ マ ー を 使 用 した 場 合 で は, で は583bpの. 位 置 に1本. の バ ン ド と して 検 出.
(15) で き,2種. 類 の プ ラ イ マ ー に よ る 解 析 結 果 は 完 全 に 一 致 し た(図9).. 図9.R5領. 域 のPolymerasechainreactionに M.W.:分. よ る反 復 数 の 検 出. 子 量 マ ー カ ー. レ ー ン1:3回 レ ー ン2:2回 レ ー ン3:1回 レ ー ン4:3回(レ. ー ン1と. 同 じ 株). レ ー ン5:2回(レ. ー ン2と. 同 じ 株). レ ー ン6:1回(レ. ー ン3と. 同 じ 株). N.C.:陰. PstIN-K断 (図10).図6eの. 性 コ ン トロ ー ル. 片 間 切 断 点 変 異 領 域 は,PstI消 如 く(+)株. は27株(79.4%)で. 化 に よ り切 断(+)株 多 数 を 占 あ,(一)株. _1Q_. と(一)株 は7株(20.6%)で. に完 全 に 分 け られ た あ っ た..
(16) 図10.PstIN-K断 M.W.:分. 片 間 切 断 領 域 のPolymerasechainreactionに. よ る検 出. 子 量 マ ー カー. レ ー ン1:PstI切. 断 点 を 有 す る株. レ ー ン2:PstI切. 断点 を有 しな い株. +:Polymerasechainreaction産. 物 をPstI切. 断 酵 素 で切 断 あ り. 一:Polymerasechainreaction産. 物 をPstI切. 断 酵 素 で切 断 な し. N.C.:陰. 性 コ ン トロ ー ル. 34検 体 の5箇 所 の解 析 結 果 を表1に 示 した.今 回 検討 したす べ て の領 域 で 同 一 パ ター ンを 示 す株 はな く 今 回 の 方 法 でVZV株. 間 の 異 同 判 定 が可 能 で あ る こ とが示 唆 さ れ た.. 一14一.
(17) 表1帯. 状 庖 疹 患 者 か ら得 た34検 体 のR1,R2,R4,R5,PstI切. 症例 年齢 性別 病 日. R2R4R5PstI. 89. 齢. 89. 0 l. 一. 99 99. 2 l. 一. 9. ■. 78. 9 0 l. 一. 1 l. 一. 88. 9. 一. 812. 一. 0 9 望 1. 816. 騨. 611. 層 一. 2 0 8 1 ¶ 1. 1311. 璽. 810 67. 噂 ■ 層. 79. 一 〇. 0 2 9 11 1. 810 710. 一. 610. 0 1. ﹁. 511. 1 1. 一. 714. 0 1. 噂. 99. 0 1. 一. 813. 甲. 0 0 ¶l 1. 輪. 1212 516. 9. 一. 88. 0 1. 5. 一. 914. 0 1. 2. 一. 9 1 1. 7 9. 暉. 913 912. 十 十. 騨. 811. 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十 十. ■. 0 0 0 9 1 11 1. 67 79 410. 十 十 十 十 十 十 十 }十 十. ■. 918 912. 十 十 十. 一. 5. 9. 2. 2 2 2 2 2 2 2 1 2 2 2 1 2 2 3 2 2 2 2 1 2 2 2 2 2 2 3 2 2 2 2 2 1 2. 一. 1 1 2 11 ーユ ー. 89. 十. コ ピー数. 18bp-15bp 6 6 7 6 7 5 5 6 6 6 6 5 7 6 6 6 7 6 6 6 7 6 6 7 6 7 6 6 6 6 6 5 6 6. 1. 69. 一. 34. 4. 32 33. 5. 31. 3. 30. 4. 29. 5. 27 28. 4. 26. 8. 25. 8. 24. 3. 23. 5. 22. 9. 20 21. 1 6. 19. 4. 18. 4 3. 16 17. 5. 15. 3. 13 14. 3. 10 11 12. 5. 9. 6. 8. 9 6. 7. 5. 6. 8. 5. 2. 4. 4 1. 3. 男 男 男 女 男 男 男 男 女 女 男 女 女 男 女 男 男 女 女 女 男 女 女 男 男 女 女 女 女 男 男 男 女 男. 2. 1 9 3 1 4 9 0 3 4 2 7 7 2 0 4 2 3 3 6 8 0 7 3 7 6 7 5 5 5 6 5 9 2 0 6 6 8 5 7 5 2 1 5 6 1 2 6 6 6 2 6 5 1 1 6 2 5 4 7 7 1 6 6 5 3 7 2 6. 1. Rl. 断点変異の解析結果. 2.臨 床 応 用 例 今 回作 製 した プ ライ マ ー を用 いて,実 際 にVZV感. 染 症 で株 間 の異 同判 定 が 可 能 か ど うか を検 討 した.. 検 討 した症 例 は,病 日別 に検 体 を 採取 した帯 状 庖 疹4例,病 た帯 状庖 疹2例(4例. 変 部 内 の相 離 れ た2箇 所 か ら検 体 を採 取 し. 共 に ア シク ロ ビルを投 与),汎 発 性帯 状 庖 疹 で 原発 疹 と汎 発 疹 か ら検 体 を 採 取 した. 1例,眼 部 帯 状 疸 疹 で前 額 部 と眼 瞼 結 膜 か ら検 体 を採 取 した1例,躯 例,学 校 の寮 内 で ほぼ 同時 期 に発 症 した帯 状庖 疹2例,お. 一15一. 幹 の両 側 に生 じた 複発 性 帯 状 庖 疹1. よ び水 痘 の家族 内感 染2例 で あ る(表2)..
(18) 表2臨 年齢. 部位. 病 日RlR2R4R5PstI. 男66. 帯状庖疹. 男25. 複発性 帯状庖疹 帯状庖疹 帯状庖疹 水痘. 男69左. 族内. 1 ⊥ 可 ⊥. 66 0α. 10家. ㎝ " 柵 鎚. 7. 籠. 6. 右腹腰部4 男14右 男12左 女30全. 胸 部3 磐部4 身8 1△2. 11又k・. 同 一 患者 で複 数 の株 を採 取 した例 で は各 領 域 のPCR法. ﹂十. 汎発性. 十 十 十 十 十 十. 原発疹 汎発疹 主病変 結膜 主病変 2箇 所 寮内同 時発症. ﹁. 5. 十 十 十 十. 女53左. 2 2 2 2 2 2 2 2 1 1 1 12 2 2 2 2 2 2 2 1 1. 帯状庖 疹. 1 1 1 1 1. 位別 病 日別. 3 3 0 0 2 1 9 9. 4部. 胸 部3 左 背部3 左胸 部3 左 背部3 腹 部7 左腰 部7 左腹部12 左 腰部12 右頚部8 左 大腿8 左 前額10 左 結膜10 胸 部4. 0 0 2 2. 女67左. 1 1 ー ユ ー. 帯状 庖疹. 4 0 0. 位別 病 臼別. 1 1 1. 3部. 6. 1. 腹 部12 16. 1 1. 女71右. 1 4 4 4. 帯 状庖疹. 6 6 1. 日別. 1 1 1 1. 2病. 7 7. 腹 部3. 9 9 6 8. 女37右. l815b. 8 8 8 2 2. 帯 状庖疹. 3 8 8 8. 日別. 3. 1病. 1←-⊥ ⊥ 1. 病名. 8 8 3 3. 種類. 8 8. 症例. 補 川 掬 川 剛 繊. 性別. 床応用例. の結 果 は一 致 して お り,各 患 者 にお け る 複 数 の. 株 は そ れ ぞ れ同 一 株 で あ る こ とが 示 唆 され た.ま た,水 痘 の家 族 内 発 症 例 で も各 領 域 のPCR法 同 じで あ り,同 一 株 で あ る と考 え られ た,一 方,学 校 内 で ほぼ 同時 に 発 症 した帯 状 庖 疹2例 域 の 反 復数 が2回. の結 果 は. で は,R5領. と一 致 して い た が,そ の他 の プ ラ イ マ ーに よ る結 果 す べ て一 致 せ ず,異 な る株 と判 定 し. た.. 考. 察 一 般 に臨 床 ウイ ル ス学 領 域 で の 疫 学 的 研 究 手 法 と して は. ,大 きな集 団 内 で血 清 中 の ウ イル ス抗 体 保 有 率. を 測 定 して特 定 の ウ イ ル ス感 染症 の 流 行 な どを検 討 す る血 清 疫 学 的 方 法 と分 子 生 物 学 的 手 法 を利 用 して ウ イ ル ス株 間 の異 同 を調 べ て 個体 間 で の ウイル ス伝 播 な どを検 討 す る い わ ゆ る分 子 疫 学 的方 法 の2つ. に. 大 別 され る. 水 痘 一帯 状 庖 疹 に関 す る分 子疫 学 的 研 究 と して は,家 族 内 で発 症 した水 痘 患 者 か ら分 離 した株 が 同 一 株 で あ った報 告1な どが あ り,VZV感. 染 か らの疫 学 的 検 討 に役 だ って い る.ま た,水 痘 罹 患 児 が 治 癒 後 に帯. 状 庖 疹 を発 症 し,水 痘 か ら得 た株 と帯 状 疸 疹 か ら得 た株 が 同一 で あ った例2や 汎 発 疹 を 伴 う複 発 性 帯 状 庖 疹 で 汎 発疹 と2箇 所 の 帯 状 庖 疹病 変 部 か ら採 取 した3株 が 同一 で あ っ た例3な どが 報 告 され,VZV感. 染症. の 発 症 機 序 の解 明 に も役 立 って い る.す なわ ち,過 去 に は水 痘 と帯 状 庖 疹 は別 の 病 気 と考 え られ て い た 時. 一16一.
(19) 代 も あ っ た が,帯 状 庖 疹 は 神 経 節 に 潜 伏 感 染 し て い た水 痘 罹 患 時 の 株 が 再 活 性 化 さ れ て 発 症 す る こ と が, VZV株. 間 の 異 同 判 定 す る こ と で は じめ て 確 立 さ れ た と言 え る.ま た,汎. たVZVが. 発 疹 は帯 状 庖 疹 病 変 部 で増 殖 し. ウ イ ル ス 血 症 に よ り散 布 さ れ て 発 症 す る こ と が 判 明 した と 言 え る.し か しな が ら,こ. 例 の 検 討 に 用 い ら れ た 方 法 は,VZVを. 培 養 した あ とVZVDNAを. 抽 出 し,さ. れ らの 症. らに 制 限 酵 素 で 切 断 して 電. 気 泳 動 像 を 解 析 す る と い う煩 雑 な も の で あ っ た. 今 回,本. 研 究 で は こ の よ う な方 法 を 用 い ず に 臨 床 材 料 か ら直 接 的 か つ 簡 便 にPCR法. 各 領 域 の 解 析 か ら よ い 結 果 を 得 る こ と が 出 来 た.ま た,今 各 領 域 をPCR法. に よ りウイル スの. 回 設 定 し た プ ラ イ マ ー を 用 い る と,ウ. イル スの. で 増 幅 す る 際 に設 定 温 度 と時 間 が 同 一 の 条 件 で で き る た め,各 領 域 ご と に 設 定 条 件 を か. え て 何 回 もPCR法. を 行 う手 間 と時 間 が 省 け る と い う,忙. し い 臨 床 医 に と っ て の 研 究 上 の 利 点 も持 ち 合 わ. せ て い る. ウ イ ル ス株 間 の 異 同 を 判 定 す る際 は,ウ. イ ル ス ゲ ノ ム 上 に あ る変 異 領 域 を な る べ く多 数 検 討 す れ ば,株. 間 の 異 同 判 定 の 際 の 正 確 性 が 向上 す る の は 言 う ま で もな い.前 述 の よ う に,VZVで. は6塩. 基 を認識 す る. 制 限 酵 素 を 多 数 用 い た ポ リモ ル フ ィ ズ ム の 解 析 で 点 変 異 が 少 な い こ と が 判 明 して お り,株 間 で 差 が 認 め ら れ る の は 主 に反 復 配 列R1∼R5の5箇 と こ ろ で 現 在,PCR法 の み で あ り6,こ. の2箇. 所 の 領 域 で あ る4'7覗18-2°.. に よ り株 間 の 異 同 判 定 に 利 用 さ れ て い る領 域 と し て は,R5とPstI変. 所 の 解 析 の み で は ウ イ ル ス 株 間 の 異 同 判 定 に 苦 慮 す る 場 合 が 稀 な ら ず あ っ た.す. な わ ち,本 邦 で 分 離 さ れ る 株 に っ い て はR5領 N-K断 た2株. 域 の 反 復 数2回. 片 切 断 点 を 有 して い る こ と か ら6,例 を 比 較 し た場 合,両. れ る が,し. 異領域. 株 共 にR5の. か し こ のVZVゲ. な る21.し た が っ て 今 回,PCR法 の 解 析 を 加 え る こ と で,株. あ り,ま. え ば 複 発 性 帯 状 庖 疹 で 相 離 れ た2箇. 反 復 数 が2回. ノ ム上 の2箇. が86%で. で,PstI切. 断(+)で. 所 の 解 析 の み で は100%同. に 不 適 格 と判 断 し たR3以. た 約70%の. 株 がPstI. 所 の 病 変 部 か ら採 取 し. あ るな らば 同 一 株 と考 え ら. 一 株 と す る に は危 険 性 が あ る こ と に. 外 のR1,R2,R4,の3箇. 所 の反復領 域. 間 の 異 同 を よ り正 確 に 判 定 で き る よ う に な っ た と考 え る.. 次 に 基 礎 デ ー タ と な る べ き帯 状 庖 疹34検 体 に っ い て 各 領 域 ご と に 検 討 す る. 1.基. 礎 デ ー タの検 討. ま ずR1領 15bp単. 域 は 、VZV遺. 伝 子11に あ り 蛋 白 を コ ー ド し て い る領 域 で あ る9・'5.こ の 領 域 は18bp単. 位 の 反 復 を 含 ん で い る の で18bpと15bpの. 差 で あ る3bpの. 位 と. 違 い を 判 定 しな け れ ば な らな い 可 能 性. も あ り,制 限 酵 素 切 断 像 で は株 間 の わ ず か な バ ン ドの 位 置 の わ ず か な 差 を 判 定 す る の は 非 常 に 難 し い9. そ こ で 今 回 は18bp単 結 果 は,18bp単 て い た 。一 方,6回 6a),こ. 位 の 配 列 の 反 復 数 を 決 定 した あ と,残. 位 の 反 復 数6回,15bp単 と8回,7回. る15bp単. 位 の 反 復 数 を 数 え る 方 法 を 取 っ た.. 位 の 反 復 数10回 の 組 み 合 わ せ が13株 で38.2%と. と10回,7回. と11回 の組 み 合 わ せ は1∼2株(2.9%∼5.9%)で. れ らの 組 み 合 わ せ を 有 す る株 で あ れ ば,R1の. 一 番多 く占め あ り(図. 解 析 だ け で も他 株 と の 異 同 判 定 を し や す い こ と に. な る. R1領. 域 の 安 定 性 に 関 し て は,VZVの. 限 られ た 培 養 継 代 数 で は 変 化 は 少 な い と 報 告 さ れ て い る9.ま. 今 回 の 臨 床 応 用 例 の 結 果 か ら は 同 一 患 者 の 株 は す べ て 同 一 パ タ ー ンを 示 し て お り,R1領 で 充 分 に 臨 床 的 応 用 で き る も の と考 え る.. 一17一. た,. 域 は比 較 的 安 定.
(20) R2領. 域 はVZV遺. glycoproteinCと. 伝 子14に. 存 在 し,蛋. 白 を コ ー ド し て い る 領 域 で あ る1q15.ま. ホ モ ロ ジ ー が 高 い と 報 告 さ れ て い る'°.さ ら に,プ. た,HSV-1の. ラ ス ミ ド内 の ク ロ ー ニ ン グ の 際 に. も安 定 と さ れ て い る且 ゜.実 際 に,今 回 の 臨 床 応 用 例 で も同 一 患 者 か らの 株 は 同 一 反 復 数 で あ り こ の 領 域 が 安 定 し て い る こ とが 確 認 で き た. R2は42bp単 88.2%を. 位 の反 復 数 が4回. 占 め て い た(図6b).し. か ら13回 の 広 範 囲 に 及 び,そ た が っ て,R2領. の う ち 反 復 数6∼9回. 域 で は 反 復 数6∼9回. が29株. で全 体 の. 以 外 の 株 で あ れ ば,R2の. 解析. の み で 株 間 の 異 同 判 定 に は 充 分 に利 用 で き る と考 え る. R4領. 域 はVZVゲ. ノ ム 上 の 倒 置 反 復 配 列 上 に存 在 し タ ンパ ク を コ ー ド し て い な い 領 域 で,27bp単. の 配 列 が 反 復 し て い る.HSV-1ゲ R4は 一方. 反 復 数 が7回. ノ ム の 倒 置 反 復 配 列cに. や や ホ モ ロ ジ ー が あ る11・15.. か ら17回 の 広 範 囲 に わ た り,反 復 数9∼12回. ,そ れ 以 外 の 反 復 数 を 示 し た 株 の 占 め る 割 合 は各 々10%以. が っ て,反 復 数9∼12回 R4領. 位. が22株 で 全 体 の64.7%を. 占 め て い た.. 下 の 占 め る 割 合 で あ っ た(図6c).し. た. 以 外 の 株 で あ る な ら ば 株 間 の 異 同 判 定 が しや す い と 考 え る.. 域 はinvitroでVZVを. 継 代 す る 際 に や や 不 安 定 と さ れ て い る.し. か し な が ら今 回,臨. と し て 同 一 患 者 か ら採 取 し た 複 数 の 株 は い ず れ も同 一 の 反 復 数 を 示 し た.今 後,症. 床応 用例. 例 数 を増 や して 更 に 検. 討 す る 予 定 で あ る. R5領. 域 はVZV遺. 配 列 が24bpの. 伝 子60と61の. 間 に 位 置 し,蛋 白 を コ ー ド して い な い 領 域 で あ る8'15.R5は88bpの. 配 列 を は さ む 構 造 で 成 り立 っ て お り,こ の 組 み 合 わ せ を 反 復 数1回. 反 復 数 に 関 して は,現 在 の と こ ろ 本 邦 に お い て は1∼3回 継 代 で も安 定 して お り,前 述 の よ う にPCR法. と数 え て い る8.R5の. の 株 が 見 出 さ れ て い る.invitroで. のVZVの. を 用 い た 株 間 の 異 同 判 定 に よ く利 用 さ れ て い る領 域 で あ. る6. 今 回,本. 研 究 で は(+)側. の プ ラ イ マ ー を88bp単. PCR法. を 行 っ て み る と,一. PCR法. の 結 果 と も一 致 し て い た. が28株 で82。4%と. 一 致 し て い た .し た が っ て,本. PstIN-K断 とGの. 多 数 を 占 め て お り(図6d),こ. 邦 に お い て は 反 復 数2回. お,中 国 で 分 離 さ れ た 株 は 反 復 数2回. 報 告 さ れ て い る22.今 後,各. の プ ラ イ マ ー の 利 点 は実 際 に. 見 して 反 復 数 が わ か る点 で あ る.ま た,反 復 配 列 を は さ む プ ラ イ マ ー を 用 い た. 今 回 の 解 析 で は,反 復 数2回. え ら れ る.な. 位 内 に 設 定 し た.こ. の 結 果 は 本 藤 の 報 告6と. 以 外 の 株 で あ れ ば,株. が52%(13/25)と,日. 間 の異 同 判 定 しや す い と 考. 本 と比 較 す る と 少 な い こ と も. 国 で 分 離 さ れ る 株 間 の違 い も検 討 す る 必 要 が あ ろ う.. 片 間 切 断 点 変 異 は,制. 限 酵 素PstIの. 認 識 す るCTGCAGのAがGに. 間 で 切 断 で き な い た め 生 ず る こ と が 明 ら か に さ れ て い る6.こ. ら れ る が,そ. の 分 布 に っ い て 関 東 で は25%,関. しな が ら,今. 日 の 結 果 は,大. 西 で は36%と. た が っ て,R5領. 間 の 異 同 判 定 に は利 用 しや す い こ と に な る.な. お,PstI変. の 切 断 点 変 異 は 本 邦 で は 約30%に. 地 域 差 が あ る こ と が 示 唆 さ れ て い た6.し. 阪 で 採 取 し た 株 の20.6%(7/34)が. は 分 布 に 地 域 差 の な い こ と が 示 唆 さ れ た.し. 点 変 異 す る た めA. 変 異 株 で あ り(図6e),本 域 で はPstI切. 断(一)の. み か. 邦 にお いて 変 異 株 の方 が 株. 異 株 は 中 国 で は 全 く検 出 さ れ な い こ と が 報 告. さ れ て お り,各 国 間 で 検 出 率 に差 が あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る22. 今 回 の 結 果 か らは,R1領. 域 で18bp単. 位6回,15bp単. 一18一. 位10回 で,か. っR2領. 域 で8回,R4領. 域 で9.
(21) 回,R5領. 域 で2回,PstI切. 断 点(+)の. 組 み 合 わ せ の株 が 一 番 多 い可 能 性 が 推 察 され る が,実 際 に は. この よ うな株 は検 討 した株 の 中 に見 出 せ な か った.し たが って,今 回 検 討 した5箇 所 の領 域 で株 間 の異 同 判 定 は充 分 に可 能 と考 え られ る. 2.臨 床 応 用 例 の検 討 前 述 の よ うに,VZVゲ. ノ ム上 の5箇 所 を解 析 す る ことで株 間 の 異 同判 定 が可 能 で あ る と示 唆 さ れ た の. で,実 際 に臨 床 的 に応 用 で き るか ど うか検 討 して み た. 帯 状 痕 疹4例 か ら は病 日別 に検 体 を採 取 した.病 日別 に採 取 した理 由 は,こ の4例 が ア シ ク ロ ビル投 与 を 受 け て お り,ア シ ク ロ ビル存 在 下 の病 変 部 でVZVゲ. ノ ムが変 化 す るか ど うか を検 討 す る た め で あ る.. 結 果 は,各 症 例 と も5箇 所 の 領 域 で変 化 はみ られ な か った. 帯 状 庖 疹2例 で は病 変 部 内 の相 離 れ た2箇 所 か ら検 体 を採 取 した.そ の 理 由 は,野 生 株 の 中 に は複 数 の 株 が 存 在 し,異 な る部 位 に は異 な る株 が 皮 膚 で増 殖 して病 変 を形 成 して い るか も しれ な い と考 え た た あ で あ る.結 果 は,2例. と も に部 位 別 に採 取 した株 は同一 株 と推 察 され た.. 汎 発 性 帯 状 庖 疹1例 で は,原 発 巣 で増 殖 した株 と汎 発 疹 の株 が 同 一 か ど うか を検 討 した.結 果 は,両 株 と もに 同一 株 と推 察 され,原 発 巣 で増 殖 した ウイ ル スが ウイ ル ス血 症 と して 全身 に散 布 され汎 発 疹 を生 じ る経 路3が 確 認 され た. 眼 部 帯 状 庖 疹1例 で は,主 病 変 で あ る前額 部 と同 じ三 叉神 経 一 枝 支 配 領 域 で あ る結 膜 か ら採 取 した両 株 が 同 一 で あ るか ど うか を検 討 した23.結 果 は同一 株 と考 え られ,眼 部 帯 状 疸 疹 で は眼 合 併 症 の 株 が 同 一 株 に 由来 す る こ とが 示 唆 され た. 複 発 性 帯 状 庖 疹1例 で は,左 右 の違 っ た脊髄 後 根 神 経 節 に潜伏 す るVZV株. が 同 一 株 で あ る か ど うか を. 検 討 す る機 会 を得 た.結 果 は 同一 株 と推 察 され,水 痘 罹 患 時 に恐 ら く1種 類 のVZV株. が多数 の脊 髄後 根. 神 経 節 に感 染 した可 能性 が示 唆 さ れ た3. 寮 内 で ほぼ 同 時 期 に発症 した帯 状 庖 疹 か ら検 体 を 採取 して 検 討 した.そ の理 由 は,帯 状 庖疹 は流 行 す る か も しれ な い と い う仮説2箆 否 定 す るた め で あ る.結 果 は予想 した ご と く2株 は全 く異 な る もの で あ った. 通 常,帯 状庖 疹 は初 感 染後 に神 経 節 に潜 伏 感 染 して いたVZVが. 再 活 性 化 す るた め発 症 す る と考 え られ て. お り,ま た 今 回,寮 内 で 発症 した帯 状 庖 疹2例 も異 な る株 に よ る と判 明 した ことか ら,帯 状 庖 疹 の 同 時 発 症 は偶 発 的 と考 え られ る. 同 一 家 族 内 で 発 症 した水痘2例 で は,2株 るTakayamaら1の. は同 一 株 と推 察 され,同 一 ウイ ル ス株 の家 族 内感 染 を 示 唆 す. 結 果 を支 持 す る もの で あ った.水 痘 は空 気 感 染 に よ り伝 播 す る と言 われ て お り,同 居. して い る家 族 構 成 員 同志 で感 染 し発 症 した もの と考 え る. 今 後,本 方 法 を用 い て さ らに症 例 を増 や して 検 討 して い き た い.. 結. 論 1.PCR法. VZV株. を 用 いてVZVゲ. ノム上 の4箇 所 の反 復領 域 とPstIN-K断. 片 間 変異 を解 析 す る こ と で,. 間 の異 同判 定 が可 能 で あ った.. 2.本 方 法 は,VZV感. 染 症 の疫 学 的検 討 や発 症 機 序 の解析 に有 用 と考 え られ た.. 一19一.
(22) 謝. 辞 稿 を終 わ る に あ た り御 指 導 御 校 閲 を賜 った手 塚. 正 教 授 に謝 意 を 捧 げ ます.ま た 本 研 究 を遂 行 す る に あ. た り直接 御 指 導 い た だ きま した吉 田正 己講 師 に心 か ら感 謝 い た します. 本 論 文 の要 旨 は平 成7年5月,第94回. 皮 膚科 学 会 学 術大 会 に お いて 発 表 した..
(23) 文 1. 献 Takayama. M, Takayama. Comparative. restriction. Med Microbiol 2. Straus. SE, Reinhold. Y, Hachimori analysis. K, Kaneda. of varicella-. K, Minamitani. zoster. virus. M (1989). clinical. isolates.. 178 : 61-67. W, Smith H, Ruyechan. analysis. the same patient. 田 正 己,本. endonuclease. Immunol. Endonuclease. 3.吉. N, Kameoka. WT, Henderson. of viral DNA from varicella. DK, Blease RM, Hay J (1984). and subsequent. zoster. infections. in. N Engl J Med 22 : 1362-1364. 藤 良(1989)汎. 発 疹 を 伴 う 複 発 性 帯 状 庖 疹 の1例.日. 皮 会 誌99:457-461. 4.HayakawaY,YamamotoT,YamanishiK,TakahashiM(1986)AnalysisofvaricellazostervirusDNAsofclinicalisolatesbyendonucleaseHpal.JGenVirol67:1817-1829 5.坂. 岡 博(1990)分. 6.本. 藤 良.1989.PCR法. 7.. Straus. 子 疫 学 一 ヘ ル ペ ス か ら エ イ ズ まで 一.東. Hondo virus. 立 出 版 株 式 会 社,52-96. 断 へ の 応 用.感 染 ・炎 症 ・免 疫:東. SE, Hay J, Smith H, Owens J (1983) Genome. virus isolates. 8.. のDNA診. 京:共. 京:19:326-337. differences. among. varicella-zoster. Y (1987) Genome variation. among. varicella-zoster. J Gen Virol 64 : 1031-1041. R, Yogo Y, Kurata isolates. derived. T, Aoyama. from different. individuals. and. from. the same. individuals.. Arch. Virol 93 : 1-12 9.. Kinoshita present. 10.. H, Hondo. R, Taguchi. in open reading. Kinchington Putative. PR,. Remenick. glycoprotein. base-pair. repeat. frame. F, Yogo Y (1988) Variation 11 of varicella-zoster. J, Ostrove. JM,. sequence. has homology. virus strains.. Straus. gene of varicella-zoster. of R 1 repeated. to herpes. J Virol 62 : 1097-1100. SE, Ruyechan. virus with variable simplex. sequence. WT, Hay. J. copy numbers. virus glycoprotein. (1986) of a 42-. C. J Virol. 39 : 660-668 11.. Casey. TA, Ruyechan. and sequencing. 12.. WT, Flora MN, Reinhold. of a variable. virus. DNA. J Virol 54 : 639-642. Hondo. R, Yogo Y (1988) Strain. of the long unique segment 13.瀬. 口 得 二,弓. 立 達 夫,田. 14.. Yoshida. M, Tezuka. Ophthalmologica 15. Davison Gen 16.. Innis. MA,. variation. repeat. region. of R 5 direct repeats. of varicella-zoster. in the right-hand. portion. virus DNA. J Virol 62 : 2916-2921. 田 正 己,手 塚 正(1993)白. 感 染 症 の1例.皮. SE, Hay J (1985) Fine mapping. 血 病 患 者 に 併 発 し水 痘 様 外 観 を 呈 し た. 膚 臨 床35:1037-1041. T (1994) Conjunctivitis. caused. by. human. parvovirus. B 19 infection.. 208: 161-162. AJ, Scott. Virol. in the inverted. of varicella-zoster. 村 隆 弘,吉. 単 純 ヘ ル ペ ス ウ イ ル ス2型. segment. W, Straus. JE. (1986) The complete. DNA. sequence. of. varicella-zoster. virus.. J. 67 : 1759-1816. Gelf and. DH, Sninsky. JJ,. White. — 21 —. TJ. ( 1990 ) PCR. protocols. : A. guide. to.
(24) methods 17. Saiki. and applications.. RK, Gelfand. Primer-directed. Academic. DH, Stoffel. enzymatic. Press. S, Scharf. amplification. : 3-12 SJ,. Horn. GT, Mullis. KB, Erlich. of DNA with a thermostable. HA.. (1988). DNA polymerase.. Science 239: 487-491 18. Richards. zoster. JC, Hyman. RW, Rapp. virus isolates.. 19. Zweerink. F (1979) Analysis. of the DNAs from. seven varicella-. J Virol 32 : 812-821. HJ, Morton. DH, Stanton. of the DNA from varicella-zoster. LW, Neff BJ (1981) Restriction virus : Stability. endonuclease. of the DNA after. analysis. passage. in vitro.. J. Gen Virol 55 : 207-211 20. Martin. analysia. JH,. Dohner. DE, Wellinghoff. of varicella-zoster. 21.高. 屋 通 子,田. 22.本. 藤 良,伊. 村 隆 弘,吉. 東 佑 英,井. virus. WJ,. and wild-type. 上 栄,横. 井 清,本. Tamura. T,. conjunctivas 24. Wander. Yos hid. a M, Tezuka. of patients. Proc R Soc Med 58 : 9-12. 膚 臨 床(投. 田 ま り こ,新 村 真 人(1993)中. zoster.. of herpes. Restriction. Detection. of. Ophthalmologica. zoster : A long-term. endonuclease. Immunol. 9 : 69-76. 稿 中) 国,韓. 国 お よ び 日本 に お け る 水. 日本 ウ イ ル ス学 会 総 会 演 説 抄 録. T (1994). with herpes. A (1965) The nature. LD (1982). DNAs. Med Microbiol. 田 正 己.複 発 性 帯 状 庖 疹 の1例.皮. 痘 ・帯 状 庖 疹 ウ イ ル ス 感 染 の 分 子 疫 学.第41回 23.. Gelb. 札 幌:161 virus. varicella-zoster. DNA. 208: 41-43 study. and. a new. hypothesis.. in.
(25)
関連したドキュメント
当社は取締役会において、取締役の個人別の報酬等の内容にかかる決定方針を決めておりま
「系統情報の公開」に関する留意事項
2001 年（平成 13 年）９月に発生したアメリカ 同時多発テロや、同年 12
医療法上の病床種別と当該特定入院料が施設基準上求めている看護配置に
本変更以前の柏崎刈羽原子力発電所 6 号及び 7 号炉の「設置許可基準規則第 五条 津波による損傷の防止」に適合するための具体的設計については「発電
発生日時： 平成２６年８月２９日 １２時４５分頃 発生場所： ３号機原子炉建屋 使用済燃料プール.
ハンセン病は、1980年代に治療薬MDT（Multidrug Therapy;
