IRUCAA@TDC : Streptococcus mutansにおける蔗糖輸送･代謝系の遺伝子解析

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(1)Title Author(s) Journal URL. Streptococcus mutansにおける蔗糖輸送･代謝系の遺伝子解析佐藤, 裕歯科学報, 93(6): 643-654 http://hdl.handle.net/10130/2182. Right. Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/.

(2) 643. 歯学の進歩･現状-. における蕉糖輸送･代謝系の遺伝子解析* 佐藤裕東京歯科大学生化学話座. DNA Sequence Analysis Of Sucrose Transport and Metabolism Genes of Streptococcus mutans Yutaka SATO Department of Biochemistry, Tokyo I)ental College. ようになる｡. はじめに. - ピルビン酸. 外来DNAをプラスミッドにつないで大脇菌の中で増殖させたやらの実験に端を発する組換. ､､. えDNA技術は,以. 庵-㈲P用巴欄曲親-㈲閣iin沌-値鞘親. 煮糖- 庶糖6リン酸蕉糖-ピルビン酸+薫糖6リン酸. 来およそ20年を経過して,今やあらゆる分野で利用されるに至っているo顧蝕原因菌においても年らにより初めて遺伝子. さらに煮糖6リン酸は,細胞内インベルター. クローニングがなされて1)以来,本菌の顧蝕魔性と関連. ゼ様酵素である庶糖6リン酸水解酵素によ. する多くの園子の遺伝子がクローニングされ,遺伝子レ. り,グルコース6リン酸と遊離のフルクトースとに加水. ベルで解析されてきている53)｡. 分解されたのち,解壮系を経てエネルギー. 我々はの顧蝕原性23)の一つである醸酸. 代謝される｡なお,ここでEⅡは輸送されるそれぞれの. 舵,特に庶糖から乳酸までの代謝経路における鼻初のス. 糖に対応して異なったEエ♯(* -般にで. テップである蕉糖輸送系の遺伝子解析を行ってきたO. 対応する糖が示される)として形質膜に存在するが,そ. は,ホスホエノールビルビン酸依存ホスホトランスフェラーゼ系という輸送系で,庶糖を. れ以外の成分は細胞寛に存在し,いずれの糖)に対しても共通してリン酸基の供与体となる(図. 細胞内に取り込むこの系は解稜系の基寛のひとつ. は他の口腔レンサ球菌との鑑別点として,マン. であるホスホエノールビルビン酸の高エネル. ニトール,ソルビトール分解(代謝)性が挙げられるが. ギーリン酸結合を利用して庶糖をリン酸化して細胞内に. これらの糖を含めてがその糖を分解. 乗り込む系で,細菌にのみ認められる系である. (代謝)できるか否かは,その糖に対応するEⅡ*を持っ. T Sはエンザイム. ているか否かに依存していると考えられる｡従来の酵素. エンザイム等の成分からなり,庶糖. レベルの研究によりにおいては,表1に. がリン酸化され,輸送されたときの全体の反応は以下の. 示される9種のの存在が示唆されている20)｡そして,近年の著しい組換えDNA技術の進歩にともない, これらのE =酵素活性を示す実体としてのそれぞれのE. ♯本稿は平成3年度東貢歯科大学奨励研兜報吾として第 247回東京歯科大学学会総会(平成4年11月7日,千葉)において特別講演したものである｡. II'をコードする遺伝子がからクローニングされつつあるのが現状である｡. -35-.

(3) 佐藤における蕉糖輸送･代謝系の遺伝子解柿. 644. 我々はのPTSのE拝甘遺伝子を,. より取り込まれた煮糖は煮糖6リン酸となり更に. 既にクローニングされている遺伝子. 産物のにより加水分解されてグルコース6リン. の近傍に存在することを同定しこれら両遺伝子の塩. 酸と遊離のフルクトースとなる｡ここでG6P. 基配列を決定したその結果遺伝子. は解糖系の基質でありそのままこの解糖系でエネルギー. は,それぞれの相補能上に逆向きに存在していた(図. 代謝される｡一方細胞内に生じた遊離のフルクトースは. 2).又,この周辺領域には,これら構造遺伝子. 解粧系で代謝されるにはリン酸化されなく. の調節遺伝子の存在や, EIFrおよびにより生じたフルクトースを代謝する酵素の遺伝子などの存. てはならない(図1)｡糖を制限条件下にを培養した時の糖同一重量当たりの増殖収量はグルコースの場合も薫糖の場合も全く同じ値を. 在が推定されたので周辺機域の塩基配列の決定をおこなったところの下流に一つ. 与えることから,庶糖より生じたフルクトースがS.. の下流に二つ,計三つのオープンリーディングフレーム. においてエネルギー代謝されていることは疑う. がこれらの領域に兄いだされた(図2)o そこ. 余地はない｡フルクトースをリン酸化する酵素としてA. で,これら三つのと名づけられたORF. TP依存フルクトキナーゼの存在が知られているが. の機能に関し,得られた知見を報吾する｡. においてこの酵素をコードしている遺伝子は未だ同定されていない｡そこで,煮糖代謝に必索なこ. について40). の酵素の遺伝子はの近傍に存在した三つのO R. の蕉糖代謝において産物のに. Fのいずれかではないかと推定された｡既にクローンされているの断片にはがインタクトな ORFとして存在していたが(図2),これらはフルクトキナ∼ゼ活性を示さなかったので,もう一つのORFであるdsaがその候補であることが推定されたo そこで,前述の断片上で切断されているdsaの下流部分をの染色体DNAからのクローニングを試み,プラスミッド上にインタクトなを構築した -･図2)ところとに依存したフルクトキナーゼ活性を検出した｡そこで,このを庶糖代謝に必東なATP依存. 図の糖PTS｡. フルクトキナーゼ遺伝子としてと名ずけ,その全塩基配列を決定した(図3 )｡遺伝子は882塩素. 表のPT Sの糖特異的E IIと輸送茎葉. 対アミノ酸残基をコ-ドしており,その計算による推定分子量はであった｡この遺伝子の転. 輸送基質. 写開始シグナル(プロモーター)様配列はその開始コドン. マンノース. グルコース,マンノース, 2 1デオキシグルコース. から84塩基上流に認められ,それは遺伝子の転写. グルコース. グルコース, α-メチルグルコース. 終結シグナル様配列の53塩基下流にあたるので. フルクトース. フルクトース. スクロース*. スクロース. ラクトース*. ラクト-ス. マルトース. マルトース. トレハロース. N-アセチルブルコサミン,トレハロース. マンニトール*. マンニトール. ソルビトール. ソルビトール. ･遺伝子が固定されたもの,されっっあるもの. 遺伝子は遺伝子とは独立に転写が調節されていると推察された｡またのアミノ酸配列について,相同性を固際データベース検索を行ったところ,相同性の高い配列は検出されなかった｡遺伝子は夫々のものと同じ煮糖PTSとしての機能を持っものがのプラスミッド等で報害されておりに関してはそれらの問で相互に相同性が認められる｡しかしに関してはのアミノ酸 36 -.

(4) 645. 歯科学報. 7 8 9 10 11. 0 1 2 3 4 5 6. E. EV. EV. II. B. Pv. A. pMH613. E G. = = =. ds2 dsl scrB. dsa. H(A). E. S. H. SH. B. pVA891 S. ｢聖書-｣ G __ -L. scrK. H(A)E. S. pSWM6 pBluescript II tel. 図2 プラスミッドとの遺伝子地図o プラスミッドはの染色体DNAのの断片を含み,その断片中には遺伝子とが,矢印で転写方向とともに示されており,プロモーターと推定される部位が矢印と反対伽の小さな丸印で示されている.又は一部分のみがこのプラスミッド上の存在したので oRFの下流部分がの染色体DNAより上にサブクローンされたはインタクトなを含むプラスミッドとしてポリメラ-ゼによる発現系に用いられたは遺伝子にテトラサイクリン耐性遺伝子が挿入されたもので,これを直鎖化しての失活変異株を得るための形薯転換に用いた｡記号上P｡. JhLI上.. 配列は他のタンパク薯のそれらと全く. フルクトースのキナーゼ活性に対し競合的に阻害し,そ. 相同性が認められず,最近報吾されたPTSとは関連し. のKi値はとしている｡そこでこれらの値を検. ていないのフルクトキナーゼ. 証するためポリメラーゼ発現系(図5)を用. 遺伝のそれ61)と38%という高い相同性が認められ. いクローン化タンパク質の過剰発環を試みたo. た(図4)ことは輿昧深い結果であった｡また,クローン. らの方法52)に従い発現誘導された大勝菌. 化遺伝子はフルクトキナーゼ活性と同時にマンノ. クローンより待られた. キナーゼ活性を合わせて持っており,従来報吾されてい. 粗抽出細胞賛画分はとかなり高い. る株(寛在はに分寿. フルクトキナ∼ゼ活性を有していたので,これをSDS. されている)のマンノフルクトキナーゼ30)はこの. ポリアクリルアミド電気泳動による酵素. 遺伝子物産と同様なものと考えられた｡そこで,まず. 分子室の測定,及び酵素活性の各キネディックパラメー. 遺伝子を失活したの変翼株の構築を. ターの測定に用いたタンパク薯の分子茎は,図. 試みた｡遺伝子の5'端に近い部位にテトラサイ. 6のごとくで示される大. クリン耐性遺伝子を挿入した断片(直也状にした. 腸菌クローンのレーンにのみ認められるバンドの. 6-図2)で形転換して待られたこの変異株で. 位置から,約と推定された｡この値はDNA塩基. は,フルクトキナーゼ,マンノキナ-ゼ両活性がそれぞ. 配列より求められた値とよく一致するが,従来のゲル波. れと,親株の. 過法により求められた値30)とは異なっていたo しかし,. minと比較し,ともに著しく減少していた｡しかし,先. このような差異はのフルクトキ. の報吾30)によると部分精製されたマンノフルクトキナー. ナーゼタンパク薯においても同様に認められることが最. ゼタンパク質のゲル波過法で求められた分子室は約. 近報吾された55)｡フルクトキナーゼタンパク寛は二量体. と塩基配列より求められた値と異なって. が活性型とされ一室体と条件により一定の平衡関係にあ. いた｡また,その酵素活性の各キネディックパラメー. るため,ゲル波過法による分子室測定は一牽体と二量体. ターは,フルクトースに対するKm値は. の中間の値をとるとされのマンノフルク. はマンノース対するそれ. トキナ-ゼにおけるその差異もこれによると考えられ. らは β ｡又マンノースは. た｡又,同粗抽出液を用い,酵素活性の各キネティツク. --- 37 -.

(5) 646 佐藤: における蕉糖輸送･代謝系の遺伝子解析 Pyull 9 18 2 7 36 45 54 C▲ ▲▲ A D Y A S V T T L A S S G T V A V G. 1 10 20 30 40 50 60 70 RLY 礼 * * ** ** ***** * * * ***** ** * * **** ** * +*. N- 酵正札 1 10 20 30 40 50 60 70. 63 72 81. m 志 ;‡ 眠慧. D. S. L. L. I: V. X. X + st:TA. 71 80 90 100 110 120 130 140 月DOEE荒畑≒吠出白票白中高5両は融は臓画D旭田仲巾qla吠沌粕亘 OLa再出D山田旦qu白㌍肩山0--m≒触Fal臓Eii ** * * **** **** * * * * * * **** * * * ** * ¥ 71 80 90 100 110 120 130 140. l17 126 135 144 153 162 GTC TTT TTG ACT GCT TAR AAG ATT CAB TAR CAR VAC TAT TAR AGC C.rT TTG GCT 171 135 180 189 110 198 207 216 ▲▲ ▲▲▲ ▲ ▲ TAT 旭 ▲. 141 150 160 170 180 190 200 210 1 独【 AGE *** * * * * * * * ** ** * * * ** * ** **** * *. 225 234 243 252 261 270 GTA GAP TⅡ GGG TAT Tea ZLAT CCA A.a APT GAY TTG GT.A ACT TZLh GVA An TAT. 崇高崇庖酬固黒粕怒P期Hi由蘭と制空再mi闇爾 --髄ra時飽師冊uB･害蝿黒掴拍題はla怒脚舶rD 141 150 160 170 180 190 200 210. 279 288 297 306 315 324 旭G AGG 乎 SD SCrK .. 班 S R L Y G S I E A a G T K. 211 220 230 240 250 260 270 280 =JZ】! * * *** * ******** ** ** * * * ** 】灯明〉GELA Y. 333 342 351 360 369 378 ▲▲ 九▲ A▲▲ A V G D E Jq F 9 I i E R V Q F. F. V. P. 387 396 405 414 423 431 知U 欄白のu福郡高FJ 怒冊臓uh丹頴h高【由良高藤 h山ii冊u 冊 T T T P Y E T I E R T V A F F K i(. 211 220 230 240 250 260 270 280. C. 281 290 300 甘 * * ***. iIは封l頴跡鑑餌廼旦酬っ庖旬間膵:亘潮｢止rFlの 281 290 300. 図のタンパク覚と IisのFrkタンパク質のアミノ酸配列の比較｡. 441 450 459 468 477 486 TTT GAL GCT GAT TTA Gce AG'r GTT Gee APT GG'r TCT T'rT GCE CCT AT'r GAY ATT F Z: A D L A S V A I G S F G P = D I 495 504 513 521 531 540 GAY CAR AAT TCA GAG ACT TAT GGT TAG ATT ACT Tea ACA CCA AAG CCA Abc TGG D Q d S D T Y G Y I T S T P X P P W. 5拍 ▲e A. LI. V. D. F. V. G. L. I. B. X. D. F. X. I. P. F. Y. 603 612 621 630 639 648 TTT'ACG ACA GAY GTT ⅡT TCT TCT GCT TAT GGG GAL ACA ATT GCT COT Tea A.AT F T T D V H S S A Y G J: T I A Ft S F 657 666 675 684 593 702 GTT AAA ACT CTG GTJP TAT TAT ACT APT GGA ACA GGC ATT GGA GCE QGG GCT ATT V K S L V Y Y T I a V G = G A G A I 711 Ecdql 720 729 738 747 756 C旭 Q. F. G. E. F. I. G. G. H. G. FI. T. I. A. G. El. V. Y. 765 774 783 792 801 810 ATG GET eCG CAT CCe BLAT GAY GTT CAT CAT GOT TTT GTA GGC ACE TGT CCT TTC M A P 玩 a19 828 837 846 855 864 CAT AAA GGC TGT TVA G.a GGA CTT GCA GCG GOT CCT AGC TVA GAG GCT COT ACT H X a C i E G i A A G P S i E A A T. G. r. 図ポリメラーゼ発寛系上にコードされたポリメラーゼは42℃で誘導されのベクター上のポリメラーゼプロモーターから転写を開始し遺伝子が発窮する｡一方,宿主大腰菌のRNAポリメラーゼによるその他の遺伝子発寛は,その阻害剤である抗生物賛リファンピシンの添加により,抑制されているo. a73 882 891 900 909 918 ▲▲ G E i I E Q F S E V W D I Q A. R. 927 936 945 954 963 972 TAC TAG ATT GCT CAG Gce GCT Aft CAR Gce ACT- GTC CTT TAT COT ecg ChLA GTC Y Y ェ A Q A A = Q A T V i Y A P Q V 981 990 999 1008 1017 1026 ▲A G▲▲ ▲▲ r G G G V H A Q E EI H i ZI A V A. = V. IO35 1044 1053 1062 1071 1080 GAL ALAA TTT ACT Tea CTT TTG ZLAT GAG TAT CTT CCA GTT CCA OAT GTT AAA GAY E X F T S i i F D Y i P V P D V R D IO89 1098 1107 1116 1125 1134 TAT ATT GTG ACA CCA GCT GTT GCA GAL JLhT GOT Tea GCA ACA TTG GGA ZLAT CTC Y I V T P A V A I JI G S A T i G I i. A. i. l143 1152 1161 1170 1179 PIL 1188 ▲▲ ▲▲ TTA ▲▲▲ ▲Tt) ▲▲ ▲▲ ▲▲ X R I A A R *. A. 1197 Pl" 1206 1215 1224 1233 1242 GC▲ ▲▲ ▲▲c GⅡ ▲ P2'1251 1260 1269P2" 1278 1287 1296 LLTT PTA TGA GGA TAA Tea ACT GAL TZLT JuT VAC JrCT TGA TTT CCT CTG AAA CTA l305 1314 1323 1332 1341 1350 加旭LgAG ▲▲ ▲九千･r SD h E G P i F. L. パラメーターを求めた(図7)｡のタンパク質のフルクトース,マンノースに対するKm値はそれぞれで,マンノースはフルクトキナ-ゼ反応に対し競合的に阻害し,そのKi値は. 1359 1368 1377 1386 1395 1404 ▲▲ TC▲ C▲▲ ▲ ▲▲ ▲ oAA g S Q bl Jl R X = W Q G F A i A X E. 図遺伝子領域の塩素配列と融訳されたアミノ酸配列｡塩基配列は,図2の5.8の位置に存在するPuu IIサイトから遺伝子の240塩基下流迄が示されており遺伝子の3'磯城遺伝子,そして次のORFを含んでいる｡下流の2つの向かい合った矢印は転写終結シグナル配列と思われる｡又はの, 望ま次のORFの,プロモーターと推定される部位をはリボソーム結合配列を,それぞれ示している｡. であった｡これらの値は従来の報吾に近い値でありのタンパク葉はのマンノフルクトキナ-ゼと同様,マンノースにも素餐特異性があるフルクトキナーゼであると結論されたo一方などで報害された達伝子産物はフルクト-スに特異的なキナーゼで,マンノースをリン酸化もせず,マンノースにより阻害もされない最近報害された歯周病関連菌であるのフルクトキナーゼ及び前述のL. のそれ55)はともにマンノキナーゼ活性を持つ酵素. -38 -.

(6) 歯科学報. ∼. 図7 クローン化フルクトキナ-ゼタンパク薯のキネディックス｡. 図ポリメラーゼ発項系を用いた発環タンパク寛のSDSポリアクリルアミド電気泳動像｡レーンポリメラーゼを用いなかった系(対照);レーン3,サイズマーカータンパク薯;レーンポリメラーゼ発現系｡. 〃記号: ○,マンノースロ,マンノース0･5 mM;◆,マンノースのリブレッサーではないかと考え,まずこれら遺伝子を大鹿菌において再構成する実験を企図した｡. タンパク質として精製され,そのN末端のアミノ酸配列. しかしく大場菌に対する毒性のためか等. それぞれ20前後が決定されており,それらは. のハイコピー数のベクターはおろか,数コピーといわれ. のタンパク宴とかなり高い相同性が認められた｡. るベクターにもサブクローンできず,断念せざるを待な. これらの基質特異性とアミノ酸配列の相同性から考え. かった｡そこでを宿主として発場を. て,これらのマンノフルクトキナーゼは. より容易に簡便に観察する事を考え,大腰菌のβ-ガ. のフルクトキナーゼとともにのものなど. ラクトシダーゼ遺伝子をリポーター遺伝子とし. とは別の-つのサブファ善リーを形成するのかもしれない｡近い将来やのフルクト. て融合遺伝子を作製し,更にこれを持つ. キナ-ゼ遺伝子の全塩基配列が決定されるであろう事は. 株として作製した41)｡ dslがのリブレッサーな. 輿昧深いことである｡. ら,これを失活することにより発現が構成的に. の変異株を発現モニター. なることを期待して,このモニター株のdslを失活したOしかし発現はdsl失活により,若干上昇す. について. るものの完全な構成的発現は認められなかった｡従っ. 決定されたDNA塩素配列から融訳さ革だタンパク質のアミノ酸配列は∴天虜蘭のガラク. てくに対し何らかの調節を行っている可能. ト∼スオペロンのリブレッサータンパタ茸と,特にその. 性は示唆されたものの,これがのリブレッサーと. DNA結合磯城で高く,全体で26%の相周性が認められ. は結論ずける事ができず,その機能の詳細ま現在も依然. た｡このことからDslはscr構造遺伝子のリブレッ. 不明のままである｡. サーではないかと推察された発現は構成的49)であるのに対し発≠鋸ま薫糖誘導性であることから -39. しかしの変異株を用いた実験から,次のような興味深い事実が観察された｡即ち,.

(7) 佐藤における薫絶輸送･代謝系の遺伝子解析. 648. グルコースや蕉稜で培養された菌においては庶. これとは違向きにもう一つ小さなORFがみとめられた. 糖により発現誘導される事はラクト∼スが共存しても変. のでds2と名付けた｡その翻訳されたタンパ. わらないが,ラクトースで前培養された菌は,庶櫨が存在してもラクトースが共存するとはラクトース. ク賛のアミノ酸配列は,大鹿菌のタンパ. 単独存在時とほぼ同程度の発項しか認められなかった｡. の大鹿菌における機能は,メッセンジャの転写. このことはラクトース輸送代謝系遺伝子の発現が. 伸長調節園子の一つであることと｡Cにおける増殖. 発現に何等かの影響を与えていることを示唆している｡. 速度が著しく低下する低濫感受性という現象に関与して. そこで,その分子機構を解明する[拍勺で,ラクト-ス輸. いること等の他にはあまり詳しくは解っていない｡. ク薯と30数%の相同性が認められたタンパク寛. 送代謝系遺伝子のクローニングを試みた｡ラクトースは. において,常法により抗生物薯耐性遺伝子. においては庶糖同様PTSにより輸送され. の挿入失活によりds2変異株を構築して,その性嚢を. たのち,ホスホβガラクトシダーゼにより加水分解さ. 調べた結果,以下のような事が解った変異株. れ,更に代謝されるそこでこのホスホβガラクト. は大腸菌の低温感受性と戴似した現象が認められた.し. シダーゼ活性を寒天培養地上で検出するスクリーニング. かし,その機序は不明である遺伝子は薫櫨P. 法を開発し,マーカーレスキュープラスミッドによるランダム変異導入法(図8)により,同活性を欠失した変其株を約株のなかから3株待た｡これら変異株において,プラスミッドの挿入部位及び周辺のDNA をサザンハイプリグイション法およびマーカーレス. H,EV Ban Sat. (茎) S調 Isc-labon oE chromosomal DNA. 官曝ヲ. ㊨. I S:umBPieT dig(elh20KnbTih BBTpHDle:aeesnbion iiiZl. ･･､ -. キュー法により解析したところ, 3株のうち2株はボス. ､･･･--･＼- -メ. 一了二ニー/-､. ホβガラクトシダーゼ遺伝子の上流に(図8株はその中に(図それぞれプラスミッドが挿入されたことにより,同活性が発窮しなくなったものと思われた(図｡そこで,前2株(図8-Bのとにおいては遺伝子自体はイン. Llgat10n TransforlTLatlOn Of HB 1 01 Plasmid Isolation. --- C) 1 1白く pooled plasTnids. タクトに存在しているので,マーカーレスキュープラスミッドともにpbg遺伝子の存在する断片を同活性を指標として大脇菌にクローニングしたそしてその断片の制限酵素地図を作製し,それらの酵素切断による同活性の失活の有無を調べることにより遺伝子の存在する磯城を限定した(図9)｡極最近のラクトースPTS関連遺伝子のクローニングが二つのグループから同時に報吾されたそれらによるとラクトースPTS遺伝子はタガトース経蹟13)のガラクトース代謝遺伝子郡とともに大きなクラスターをなし存在しており,我々のクロ-ニングしたpbg遺伝子の上流の制限酵素地図がそれらときわめて短似していることから, それら遺伝子はpbg遺伝子の上流に存在すると考えられ,我々は同じ領域をクローニングしていたことになる｡今後我々はラクト∼スPTS遺伝子の発場と発現の調節機構を中心にして,分子レベルで解析して行きたい｡について決定されたDNA塩基配列からの下流に一40-. 図8 マーカーレスキュープラスミッドによるランダム変異導入法｡㈱標的遺伝子内へのの挿入クローン標的遺伝子上流の同一オペロン内へのの挿入クローンと｡初(B)ともに標的遺伝子ネガティブとなる｡記号細菌アルカリフオスファクーゼエリスロマンシン耐性遺伝子｡.

(8) 歯科学報. 649. 93, No. 6 (1993). T Sの遺伝子の発現調節には関与していないらし. ｡それらのうち遺伝子レベルでその因子が同定され. い変異株は蕉糖依存性の凝集を示すように. ているものとしてのグルカン結合タンパ. なった.ここでの庶糖依存性凝集は本菌の. ク薯kbp遺伝子産物)4)及び三つのグルコシルトランスフェラーゼ及びの各遺伝子産物)2'. 歯面付着性更には顧蝕原性と密接な関係があるので,この項象に焦点を絞り検討を行った｡この変異株の凝集. ･5丑がある｡これらによって媒介されるグルカン. は,蕉糖を含む培地で培養した時認められるだけでな. 依存性凝集は,比較的長い時間( 1時間-<)を費やした. く,煮糖以外の糖で培養後,デキストランを加えること. 後観察されている｡一方,その因子が末だ遺伝子. によっても認められたことから,この変異株で認められ. レベルで同定されていないものとして. た煮糖依存性の凝集という現象は,本菌の菌体外酵素グ. などで報曹されているグルカン結合タンパ. ルコシルトランスフェラーゼにより煮糖より作られるグ. ク賛59)又はグルカン結合レクチンと呼ばれ. ルカンに依存した凝集であることが解った｡そして,こ. るものがある｡このグルカン結合性タンパク薯による凝. の凝集は変異株の洗浄菌体をの蕉糖. 集は, 5万以上の分子室のグルカンに対して認められ･. 含有培地培養上清や市敗のデキストラン溶液に懸蘭して. 分子量200万のグルカンでは,添加後1分程度で肉眼的. も認められることから,グルカン依存性は. に観察できるほど,強力で早い反応である｡そしてこの. により作られたグルカンにのみ依存するのではなく, α 1-6グルカンに依存することがわかった｡ミュータン. ような反応はでは認められないとされ. スレンサ球菌におけるデキストラン依存性凝集は,いく. 蛋白はのそれやブルコシルトランスフェ. っかの因子により起こることが従来報告されている. ラーゼとは異なる物薯であると推定される｡そ. る事からやのグルカン結合. こで,我々も変異株において,どの程度の分子室のグルカンにより又どの程度の早さで凝集が生じるか. pSW540EV EV. E. H. H. P. BH. BSal. E. HEV. を,市販の分子量の異なるデキストラン(1万, 7万, 万万)を用い調べたところ,分子量7. トトI一一-. Cmr Emr. pSW563Sal. pVA89 1. salHEVHP H EV HEV E. H. H. P. EVH. E. Sod. 子室200万のデキストランは添加後1-3分程度で凝集. , J. ･/ L ,･･ L. Em' Cmr. が認められた.もちろんこのds2変異株で認められた. pVA891. ,･･ l. EV/ /. / E. Hc. H. 万以上のデキストラン添加で凝集が認められ(図分. HBgHcP. 完己. グルカン依存性凝集はその親株では認められないことは従来の報吾と-致したが,対照として用いたS･株の凝集は変異株と比較すると明らかにその度合いは強力であった｡そこでこの凝集が従. ･■●･･.･.･･.pbg. 図9 クローン化断片の制限酵素地図とホスホβガラクトシダーゼ活性遺伝子pbgの櫨域決定｡のホスホβガラクトシダーゼネガティブクローンS 及びより,マーカーレスキュー法で大腺薗に回収されたホスホβガラクトシダーゼポジティブプラスミッド｡両方向矢印と+記号は,両プラスミッドの共通領域からの各制限酵素切断によるサブクローニング断片の同活性の有無｡記号. 1 2 3 4 5 6 7 8 9. 図10 分子室の異なるデキストラン添加後のds2 変異株の凝集｡ 1- 変異株親株; 1,デキストランー平均分子量1万同7万; 同万同50万同200万｡. BglII ; E, EcoRl ; EV･ EcoRV ;H, Hind. III ;HC, mncII ;P, PstI ; Sat ;SalI ; クロラムフェニコール耐性遺伝子; エリスロマイシン耐性遺伝子｡ -41-.

(9) 650. 佐藤における薫糖輸送･代謝系の遺伝子解析. 乗で報吾されているGbpやにより媒. バク質やいずれのグルコシルトランスフェラー. 介されている魂象かどうかを調べるため,これら遺伝子. ゼとも別の未知物薯が媒介し,それをds2遺伝. を服次そして全てを欠失したds2変臭株を構築し,そ. 子が調節している可能性があると考えられた｡現在の所. のグルカン依存性凝集の有無を調べた｡なお,これらの. この現象が顧蝕原性とどの程度関与しているかは禾明で. 遺伝子を欠失した変異株の構築は,常法どおり,各標的. あるがの典型的な蘭地病原因子であるG. 遺伝子の可及的5 '端に近い部位にそれぞれ異なる抗生. TFやGbpなどによる凝集と同等ないしそれ以上の凝. 物質耐性遺伝子を挿入し,その断片を用い順次S.. 集が起こることからこの凝集が本菌の歯面付着に関与し. を形質転換することによりおこなった｡結果は. ている可能性があることとやGbpなどとは異. 表2に示される通り株におい. なる調節を受けていることなどから,今後はこの未知物. ての全てを欠失したds2変. 質の検索を行い,この現象の機構解明を行いたい｡. 異株においても,デキストランを添加すると依然として凝集は認められた｡また三つのgtf遺伝子のうち. まとめ. を欠失すると蕉糖からのグルカン庄成室は. などのミュータンスレンサ. 著しく減少するので,庶糖を含む培地での凝集はおこら. 球菌が雨鹿の原因菌と同定された後,明らかになったそ. なくなるが,これにグルカンを添加すると凝集が認めら. の病原因子について年以降次々とそれらの因子を. れるようになる｡一方,親株では庶糖で培養しても,グ. コードする遺伝子がクローニングされ,同定されるに. ルカンを添加しても凝集は全く認められないし変. 至っている0 -般にある菌の病原性など何らかの形質を. 異株でもグルカンが存在しなければ,何等凝集は認めら. コードしていると考えられる遺伝子が大腸菌にクローニ. れなかった｡以上の事から変異株のグルカン俵存. ングされると,その遺伝子が元の菌において確かにその. 性の凝集は,図11に示されるように,グルカン結合タン. 形質を塊定している遺伝子であるかどうか固定するため,大腸菌を用いたDNA組換え技術によりその遺伝子 DNA断片が元の菌で発現しないような改造を加え,そ. 表の各変異株とその劫株の凝集性. のDNA断片を形聾転換法などにより元の菌に戻すこと + L M 7S In a CtiV a ti0 n. N 0ne. により同一遺伝系統の該当遺伝子失. dS2. d/S 2. dS2. d S2. g tf D. g tf D. g bP. g tf D. g tf B C. 活変異株を得,その変異株においてその形寛が消失するか否かを調べるという方策がしば. g tf B C. M ed ia. しば用いられる｡ところでを構築. g bP. するための形葉転換法が開発されていない + 月T R. やでは,この方策を適用することが現在の所きわめて困華である｡一方において. B T R l G lu C0 Se + D eX tra n T 2 00 0. + ++. ++ +. + +十. は,形質転換法が既に開発されていたため,多くの達伝. ++. 子あるいは遺伝子機能の同定にこの方策が適用されてき B T R ∼S u Cr 0 Se. ++. た｡我々はの遺伝子の周辺に認められた三つの機能禾明の. 十+ +. ds2. l鵜-下図変異株の凝集機構モデル0 -42-.

(10) 歯科学報. 93, No. 6 (1993) 651. について,この方策を適用することによりは. こに定着する綿菌にとって変化の激しい環境である.食. 細胞内へ輸送された庶糖より生じる遊離のフルクトース. 生活や金文化の違いも淘汰圧として働くに違いない｡のいわば進化の履歴はその染色体DNAに. を解糖系へ送るための酵素フルクトキナーゼをコードする遺伝子であったことの機能を調べる. 刻み込まれているかもしれない｡. ため構築した変異株から発現にラクトースが何らかの影響を与えていることが分かり,その分子機構解明のため,ラクトースの輸送代謝系の酵素の一つであるホスホβガラクトシダーゼ遺伝子をクローニングしたことはのグルカン依存性凝集に関与する何らかの物葉の発現を制和している遺伝子であると考えられたこと,等の知見を得た｡. 稿を終わるに当たり,本研究を平成3年度東京歯科大学学長奨励研究として採択,発表の機会を与えて下さった関係各位に深謝の意を表しますO終始,ご指導ご校閲をいただいた講座主任木崎治俊教授をはじめ,ご協力をいただいた生化学講座の皆様,テキサス大学教授に感謝致します.また, T7ポリメラーゼ発魂系ベクターを分与いただいた愛知学院大学歯学部吉村文信教授に厚く御礼申し上げます｡参考文献 , -lOr肌 , p. Roveson,J.B. Hansen, J. R. Holt, and R･. おわ LJ に. は庶糖を始め多くの穂のPTSに関し, 酵素レベルで多くの研究がなされてきたが,それらは近. curtiss Ⅲ (1980) : Cloning and expression of. 年遺伝子レベルに移行しつつある｡ PTSのEⅡに関す. streptococcus TnutanS genes in Escherichia colt, J. Dent. Res., 59 : 949.. る遺伝子レベルの研究は大脇菌を中心に行われてきたが,その他の菌を含め今までにクローニングされ,その. 2) Aoki, H., T. Shiroza, M. Hayakawa, S･ Sato, and H. K. Kuramitsu. (1986) : Cloning of a Streptococcus mutans glucosyltransferase gene coding for insoluble glucan synthesis･ Infect･髄髭)班d-鍋孔. 塩基配列から決定されたのアミノ酸配列の相同性の比較において,ひとつの糖に対するの異なる細菌種間での相同性が, -細菌種における枚数の糖に対するそれぞれの間の相同性より高いことから,すべ. 3) Aulkemeyer, P., R. Ebner･, GI Heilenmann, K. Jahreis, K. Schmid, S･ Wrieden, and J･ W. Lengeler (1991) : Molecular analysis of two fructokinases involved in sucrose metabolism of enteric bacteria, Mol. Microbio1., 5 : 2913-. てのはグラム陰性菌と陰性菌が分岐する以前のある祖先遺伝子から由来し,種を越えてその配列が保存されてきたものと考えられている｡. 2922.. において,極最近,我々が同定した. 4) Banas, J. A., and R. R. B. Russell (1990) :. 遺伝子以外のEHあるいはその関連酵素の遺伝子ク. Sequence analysts Of the gene for the glucan. ローニングの報吾がなされるに至っており上. -binding protein of StreptococcLLS mutanS Ingbritt, Infect. Immun., 58 ･. 667-673.. におけるE H*間の相同性の如何は興味深いことである｡これらPTSのEコ:をはじめ糖輸送･代謝. 5) Blatch,G. L., R. R. Scholle, andD･ R･ Woods (1990) I. Nucleotide sequence and analysis of the. 系の遺伝子レベルの研究は,その調節機構の解明ととも. l' 恒i｡ -. にがプラークでの定着を確立していく機. reglOn, Gene, 95.. 17-23.. 構を解き明かす責重な基礎資料を与えることになるに違. 6) Calmes, R., and A. Brown (1979) ･. Regulation. いない｡またの綾輸送･代謝系の研究は,歯を脱灰して歯兎蝕に至らしめる有機酸の生成という観点はもとより,疲代謝はエネルギー代謝であるのでがプラークというミクロな生態系での定着を確立していく機構解明という観点から捕らえる必要がある｡. of lactose catabolism in Streptococcus mutans : purification and regulatory properties of phospho: 6879.. 7) Chassy, B. M" and E･ V･ Porter･ (1979) : Initial characterization of sucrose-61Phosphate hydrolase from Streptococcus mutans and its apparent identity with intracellular invertase,. は動物の口腔や上気遺以外から大量に検出された報吾はなく,おそらく,噛乳動物の大腸に住み着いた大鹿菌と同様に,噛乳動物の口腔に何らかの条件下で住み着き,噛乳動物と供にその進化の遺を歩んできたものに違いない.大場と比較して,口腔という環境はそ -43-. - -. 314.. 8) Douglas. C. W. I., and R･ R･ B･ Russell (1982) : Effect of specific antisera on adherence properties of the oral Bacterium Streptococcus TnutanS, Archs･ oral Biol･, 27 : 1039-1045･.

(11) 652 佐藤における薫糖輸送･代謝系の遺伝子解析 9) Drake, D., K. G. Taylor, A. S. Bleiweis, and. Carbohydrate uptake in the oral pathogen 〃= -. ･ : -. binding･ 1ectin of Streptococcus cricetus, Infect. Immun, 56 : 1864-1872.. ulation by protein phosphorylation, Biochimie, 71 :. 10) Ebner, R., and J. W. IJengeler. (1988) : DNA. 2D Jagusztyn-Krynicka, E. K., J. B, Hansen, V.. sequence of the gene scrA encoding･ the sucrose. L Crow, T. D. Thomas, A. L. Honeyman, and. ＼中ド=-Pmト二n/1･叫l i.r ･汗つIL(つ,ho当. R. Curtiss Ⅲ (1992) : Streptococcus mutans. transferase system from enteric bacteria : 上t"rいい】Pト:1里｡つlfl＼･r出仕1 L proteins, Mol. Microbio1., 2 ･. 9-17.. ､用y cluster, J. Bacterio1., 174 : 6152-6158. 22) IJandale, E. C., and M. M. McCabe (1987) :. ll) Gibbons, R. J., and R. J. Fitzgerald (1969) :. Characterization by affinity electrophoresis of an all, 61glucan-binding protein from. Dextran-induced agglutination of Streptococcus TnutanS, and its potentialrole in the formation of microbial dental plaques, J. Bacterio1., 98 : 341-346. 12) Hamada, S., and H. D. Sla°e (1980) : Biology, immunology, and carlOgenicity of Streptococcus TnutanS, Microbiol. Rev., 44 ･. 331-384.. っ 55 : 3011-3061.. 23) Loesche, W. J. (1986) : Role of Streptococcus mutans in human dental decay, Microbiol. Revっ. 24) Lu-Lu, J. S. Singh, M. Y. Galperin, D. Drake,. 13) Hamilton, I･ R., and H. Lebtag (1979) : Lactose metabolism by Streptococcus mutans :. K. G. Taylor, A. S. Bleiweis, and R. J. Doyle. evidence for induction of the tagatose 6-phoI. prevent expression of Streptococcal glucanbinglng Lectin, Infect. Immun., 60 : 1862-1872.. sphate pathway, J. Bacterio1., 140 ･. 1102-1104. 14) Hamilton, I. R., and G. C. Y. Lo(1978) : Co-. (1992) : Chelation agents inhibit activity and. 25) IJunSford, R. D., and F. L. Macrina. (1986) :. β. Molecular cloning and characterization of scrB,. Streptococcus saliuarius and Streptococcus. the structural gene for the Streptococcus mutans phosphoenolpyruvate-dependent sucrose phosI. mutans, J. Bacterio1., 136 I. 900-908.. photransferase system sucrose-61phosphate. P-enolpyruvate phosphotransferase system in. く. Iくul･〕 : Isolation and characterization of the Strepto-. hydrolase, J. Bacterio1., 166 : 426-434. 26) McCabe, M. M., and R. M. Hamelik (1978) :. coccus mutans gtfC gene, coding for synthesis. 'olつ･. 当. of both soluble and insoluable glucans, Infect.. M. McGhee, J. Mestecky, and J.i. Babb (Ed.),. l ‥56:. 16) Hanada, N., and IL K. Kuramitsu (1989) : Isolation and characterization of the StreptoI coccus mutans gtfD gene, coding for primer-. Secretary immunity and infection. Plenum W Yol･10., 271 . ll. 1 L Smith (1977) : Purification of dextran-binding. dependent soluble glucan synthesis, Infect. 湘軍の9-m鈍っ. protein from carlOgenic StrepfococcLLS mutanS,. lI71 ヽ用. M‥廿 . く. Biochem. Biophys. Res. Comm., 78 : 273-287.. (1986) : Isolation and characterization of the. つ･ 1. (1981) : Isolation and characterization of Strep-. sucrosel61Phosphate hydrolase gene from , 主I11. tococcus TnutanS mutants defective in adherence. -586.. 18) Honda, 0., C. Kato, and H. K. Kuramitsu. and aggregation, Infect. Immun., 34 : 10441055.. (1990) : Nucleotide sequence of the Streptococcus. 29) 01son, G. A. (198_7) : Dextran receptors as. mutans gtfD gene encoding the glucosyl-. immunogens in caries prophylaxis. pp7711781.. transferase-S enzyme, 136 : 2099-2105. 19) Honeyman, A. IJ., and a. Curtiss IE (1992) : Isolation, characterization, and nucleotide sequence of the Streptococcus mutans mannit01phosphate dehydrogenase gene and the mannito1. In J･ R･ M･ McGhee, J･ Mestecky, and J･ L･ Babb (Ed.), Secretary immunity and infection. Plenum press (New, York)., 30) Porter, E. V., B. M. Chassy, and C. E. II"ト111 冊i五日柄,p-. -specific factor Ill gene of the phosphoeno1pyruvate phosphotransferase system, Infect. hllmun.. 60 : 3369--3375. ､. to｡ l了一上､e上Tm1 50.. 3D Postma, P. W., and J. W.Lengeler (1985)': 一44-.

(12) 歯科学報. 653. 93, No. 6 (1993). Microbio1., 139 : 921-927.. Phosphoenolpyruvate: carbohydrate phospho-. 41) Sato, Y., Y. Yamamoto,R. Suzuki, HI Kizaki, and H. K. Kuramitsu (1991) : Construction of. transferase system of bacteria, Microbiol･ Rev･, 49 : 232-269.. scrA: :lacZ gene fusions to investigate regulation of the sucrose PTS of Streptococcus m,utans,. 32) Postma, P. W., and S. Roseman. (1976) : The ･ru用te : phosphotransferase system, Biochim･ Biophys･ Acta,457 ･. 213-257.. ･ :. 421 , K . J言＼･. 33) Rosey, E. L., and G. C･ Stewart (1992) ･･ Nucleotide and deduced amino acid sequences of. schmitt, and J. W. LengLeler (1988) : Plasmidmediated sucrose metabolism in Escherichia. the lacR, lacABCD, and lacFE genes encoding. coli Kl12 : Mapplng Of the scr genes of PUR 400. 1110主. the repressor, tagatose 61Phosphate gene cluster, and sugar-specific phosphotransferase. 43) Schmid, K., M. Schupfner, and R･ Schmitt･. system components of the lactose operon of. (1982) : Plasmid-mediated uptake and me-. Streptococcus mutans, J. Bacterio1., 174 : 61596170.. tabolism of sucrose by Escherichia colt Kl12, JI Bacterio1., 151 ･. 68-76.. 34) Russell,R. R. B., A. C. Donald, andC. W. I･主･･･of. 441 . ∴ く. 1く (1987) : Sequence analysis of the gtfB gene from streptococcus mutans, J･ Bacteriol･, 169 : 42634270.. a glucan-binding protein from Streptococcus 1. 45) Slee, A. M., and J. M. Tanzer (1979) :. 35) Saier, M. H., Jr., F. C. Grenier, C. A. Lee, and E. B. Waygood. (1985) I. Evidence for the. phosphoenolpyruvate-dependent sucrose phos-. evolutionary relatedness of the proteins of the. photransferase activity in five serotypes of Strep･血 111 ‥26 :. bと ° ･ruH ･ 110-. transferase system, J. Cell･ Biochem･, 27 : 4356.. 46) Slee, A. M., and J. M. Tanzer. (1980) ･･ Effect of growth conditions on sucrose phosphotransferase activity of Streptococcus mutans, Infect･犯葛-犯d. っJrっ Suda, J. Lengeler, RI Ebner, P･ Argos, B･ Rak, K. Schnetz, C. A. Lee, G. C. Stewart, J･ Breidt. 十｢Sl冊:呈出.(主上出､月･I･＼主上-昌Pht!つ臣:. Jrっ. AnalysIS Of sucrose catabolism in Klebsiella. ittle. (1988) : Sugar permeases of the bacterial. pneumoniae and in Scr+ derivatives of Escheri-. phosphoenolpyruvate-dependent phosphotrans-. chiα. ferase system : sequence comparisons･, FASEB J., 2 ･. 199-208.. 1644. 481 S主1 ‥ し. 37) Sato, Y., and H. K. Kuramitsu (1988主.. (1979) : Characterization of a phosphoenolpyruvate-dependent sucrose phosphotransferase. Sequence analysts Of the Streptococcus mutans. ヾ.-lP一､ -- 日ト1日-‥. 上 :. 〕 K･ Kuramitsu (1989) ･. Characterization and sequence. analysュs. Of. the. scrA. gene. 24 : 865-868.. 49) St. Martin, E. J., and C. L. Wittenberger･ (1979) : Regulation and function of sucrose-61. encoding. phosphate hydrolase in Streptococcus mutans･既訳)輿望7-掴1. enzyme II ST of the Streptococcus mutans phosphoenolpyruvate-dependent sucrose phoI sphotransferase system, J･ Bacteriol･, 171 : 263 -271.. 50) Swindle, J., J. Ajioka, D. Dawson, R･ Myers, D. Carroll, and C. Georgopoulos (1984) : The nucleotide sequence of the Escherichia colt K12. 39) Sato, Y., Y. Yamamoto, H. Kizaki, and H･. nusB (groNB) gene, Nucleic Acids Res･, 12 :. K. Kuramitsu (1992) : Cloning of the phospho-. 4977-4985.. βlactose-negative mutants of Streptococcus mutans isolated following rand_om mutagenesis. 51) Swindle, J., M. Zylicz, C. Georgopoulos,I J･ IJi, and J. Gerrnblatt (1988) : Purification and. with plasmid pVA891 clone banks, FEMS ,91:. properties of the NusB protein of Escherichia coli, J. Biol. Chem., 263 : 10229-10235･ 52) Tabor, S., and C. C. Richardson (1985) ･･ A. l 仕 K K. Kuramitsu (1993) ･. Isolation, charactreization,. bacterlOPhage T7 RNA polymerase/promoter. and sequence analysts Of the scrK geneencoding fructokinase of Streptococcus mutans, J･ Gen･. system for controlled exclusive expression of specific genes, Proc･ Natl･ Acad･ Sci･ USA･ 82 :. -45-.

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