IRUCAA@TDC : Requirement for JNK and ERK Activation in BMP-２/BMP-７ -Induced Osteogenesis of Human Periodontal Ligament Cells

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Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/

Title

Requirement for JNK and ERK Activation in

BMP-２/BMP-７ -Induced Osteogenesis of Human

Periodontal Ligament Cells

Author(s)

手錢, 親良

Journal

歯科学報, 113(3): 322-323

URL

http://hdl.handle.net/10130/3113

Right

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論文内容の要旨１．研究目的歯根膜には未分化な間葉系細胞が多く認められ，歯周組織の傷害の修復，再生に重大な役割を担っているが，歯槽骨の損傷における修復，再生にどのような役割を果たしているかについては，未解明な部分が多い。今回，我々はヒト歯根膜由来細胞を材料に，BMP-２/BMP-７で誘導される骨分化誘導過程でのマーカータンパク質の発現を定量的 Real-Time PCR 法を用いて解析し MAPKs によって骨形成の遺伝子について，ヒトの歯根膜細胞とその修飾メカニズムを制御するかを明らかにする。２．研究方法材料はヒト歯根膜由来細胞（HPDL 細胞）を１×１０５_cells/cm２_{で１２well プレートに播種し，未分化維持培養液} SCGM で１２時間培養後，骨芽細胞分化誘導培地｛OBM：α-MEM（２％FBS，５０μg/ml L-アスコルビン酸，１０ mMβ-グリセロリン酸）｝に培地を交換した。MAPK 系阻害剤として ERK 阻害剤（FR１８０２０４），JNK 阻害剤

（SP６００１２５）を用いた。ERK 阻害剤は，Dimethyl sulfoxide（DMSO）にて溶解し，ストック溶液１０mM を作製した。JNK 阻害剤は DMSO にてストック溶液２５mM を作製した。HPDL 細胞をコントロール群，BMP-２/ BMP-７（１００ng/ml）処理群，BMP-２/BMP-７（１００ng/ml）＋FR１８０２０４（終濃度２５μM）処理群，BMP-２/BMP-７

（１００ng/ml）＋SP６００１２５（終濃度２５μM）処理群に分け，３７℃の５％CO２インキュベーター内で４８時間および９６時

間培養した。９６時間培養群の一部は PBS で２回洗浄し，４％パラホルムアルデヒド緩衝液で５分間固定した。 PBS で３回洗浄後，BCIP/NBT 溶液を用い１時間，暗所で Alkaline Phosphatase（ALP）を染色した。Real-Time PCR 反応は，Premix Ex TaqTM

reagent を用い，骨分化マーカー｛Runx２，Alkaline Phosphatase， TypeⅠ collagen（COL１A１），Bonesialo protein（BSP），Osterix（OSX），Osteocalcin（OCN）｝の発現を定量的に検出した。

３．研究成績および結論

コントロールと比較し ALP 染色像は BMP-２/BMP-７処理群で増強した。ERK 阻害剤処理群は BMP-２/ BMP-７単独処理群とほとんど変化がなかった。JNK 阻害剤処理群は ALP 活性が著しく抑制された。定量的 Real-Time PCR の結果は，各時間において，BMP-２/BMP-７処理群ではコントロールと比較し RUNX２が３ ∼４倍，ALP が１５∼２５倍，COL１A１が４∼７倍，OSX が３００∼３５０倍，BSP が２００∼７００倍，OCN が３０∼１４０

氏名（本籍）てぜんちから

手

錢

親

良

（島根県）学位の種類博士（歯学）学位記番号第１８９５号（甲第１１４７号）学位授与の日付平成２３年３月３１日学位授与の要件学位規則第４条第１項該当

学位論文題目 Requirement for JNK and ERK Activation in BMP-２/BMP-７ -Induced Osteogenesis of Human Periodontal Ligament Cells

掲載雑誌名 Journal of Hard Tissue Biology 第２１巻４号４３５−４４２頁

２０１２年１２月論文審査委員（主査）中川寛一教授（副査）井上孝教授新谷誠康教授下野正基教授東俊文教授歯科学報 Vol．１１３，No．３（２０１３）３２２ ―１００―

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倍の発現上昇を認めた。BMP-２/BMP-７＋ERK 阻害剤処理群は BMP-２/BMP-７単独に比べ，後期骨分化マーカーである BSP，OCN に著しい減少が認められたが，前期骨分化マーカーである Runx２，ALP， COL１A１には有意な変化は認められなかった。BMP-２/BMP-７＋JNK 阻害剤処理群は，全ての骨分化マーカーにおいて BMP-２/BMP-７単独群に比べ著しい発現の低下を認めた。マウス骨芽細胞株 MC３T３-E１では，BMP-２で骨分化を誘導し JNK が活性化されるが ERK の活性化に影響を与えない。HPDL 細胞は，BMP-２/BMP-７により骨分化誘導が促進されることが示された。BMP-２/ BMP-７の作用は，HPDL 細胞で ERK 阻害剤処理により骨分化後期のマーカーである BSP，OCN の発現のみが抑制され，初期段階の骨分化誘導に影響を与えることが少ないことを示した。JNK 阻害剤処理によっては，全ての骨分化マーカーの発現が抑制された。従って，分化段階の BMP による骨分化誘導に non-Smad 経路である MAPK 系が関係していることが示唆された。これらが示すように，ヒトと他の生物の種や由来で，異なった結果が得られた。これは，種による間葉系幹細胞の，特に骨芽細胞分化に関与する MAPK の調整機構の働きが大きく異なっていることを示している。さらなる研究が，HPDL 細胞をはじめとする個々の組織での骨分化過程の詳細な検討が必要であると考えられる。論文審査の要旨本論文は，ヒト歯根膜由来細胞（HPDL 細胞）を材料に，BMP-２/BMP-７で誘導される骨分化誘導過程でのマーカータンパク質の発現を定量的 Real-Time PCR 法を用いて解析し MAPKs によって骨形成の遺伝子について，ヒトの歯根膜細胞とその修飾メカニズムを制御するかを検討した。HPDL 細胞は，BMP-２/BMP-７により骨分化誘導が促進されることが示された。BMP-２/BMP-７の作用は，HPDL 細胞で ERK 阻害剤処理により骨分化後期のマーカーである BSP，OCN の発現のみが抑制され，初期段階の骨分化誘導に影響を与えることが少ないことを示した。JNK 阻害剤処理によっては，全ての骨分化マーカーの発現が抑制された。従って，分化段階の BMP による骨分化誘導に non-Smad 経路である MAPK 系が関係していることが示唆されたことを報告したものである。本審査委員会は，１）HPDL 細胞の詳細，２）骨分化誘導培地の定義，３）骨分化マーカーの発現について，４）前期，後期骨分化の概念，５）論文中の臨床応用についての表現などの質疑が行われ，おおむね妥当な解答が得られた。その他，論文の記載方法の補足等についても指摘があり，修正がなされた。本研究で得られた結果は，今後の歯学の進歩，発展に寄与するところ大であり，学位授与に値するものと判定した。歯科学報 Vol．１１３，No．３（２０１３）３２３ ―１０１―