JAIST Repository: 低温菌 it Flavobacterium balustinum P104株のピルビン酸デヒドロゲナーゼ様遺伝子の解析
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(2) 低温菌 Flavobacterium balustinum P104 株のピルビン酸 デヒドロゲナーゼ様遺伝子の解析 及川 一摩. (横山研究室). 【目的】 本研究室で単離された低温菌 Flavobacterium balustinum P104 株の低温プロテアーゼ CP-70 の構造遺伝子の下流に、何らかのタンパク質をコードする遺伝子の開始コドンが見 つかっている。開始コドンから 801 塩基対までの塩基配列をアミノ酸配列に変換した後、 ホモロジー検索プログラム:BLAST および FASTA で既知のアミノ酸配列との相同性を検 索した。その結果、主にピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ PDH ）複合体などの E1 αサブユ ニットと約 30 ％の相同性があった。そこで本研究では、CP-70 遺伝子の下流に存在する 遺伝子の機能の予測を行なうことを目的とした。 【方法】 1. 塩基配列の決定と ORF の検索 in vitro パッケージングされたλファージを XL1-Blue MRA E.coli に感染・増殖させ、目的遺伝子が挿入されたファージベクター（λ FIX II ） を単離した。これを PCR の鋳型として目的遺伝子の増幅を試みた。5' → 3' 方向のプラ イマーは目的遺伝子の開始コドンから 3' 末端側に相補的な 20mer のオリゴヌクレオチド を用いた。3' → 5' 方向のプライマーは、プロモーターに相補的な 20mer のオリゴヌクレ オチドを用いた。PCR 終了後、PCR 産物を精製して、ダイターミネーターサイクルシー ケンス反応を行い、DNA シーケンサーを用いて塩基配列を決定した。また、決定された 塩基配列に対してタンパク質のコード領域の検索を行なった。 2. ホモロジー検索 タンパク質のコード領域の機能を探る目的で、NCBI の BLAST お よび FASTA を使用して翻訳配列とデータベースのタンパク質との相同性を調べた。類似 性の高いタンパク質と翻訳配列とのアミノ酸配列を比較し、高保存残基、補因子結合領域 領域を検索した。 【結果】 CP-70 遺伝子の下流の塩基配列 3.5kbp の塩基配列を決定した。タンパク質のコード領 域を検索したところ、3 つの読み枠が存在した。ホモロジー検索の結果、ORF1（ 346 残 基）は PDH 複合体を構成するピルビン酸デヒドロゲナーゼ（ E1p ）のαサブユニットと 約 30 ％のホモロジーを、ORF2 はβサブユニットと 35-40 ％のホモロジーを有していた。 ORF3 はこれまでに明らかにされていないタンパク質をコードしていることがわかった。 また、アミノ酸配列の比較をしたところ、ORF1 、ORF2 には高保存残基がそれぞれ 10ヶ 所以上存在し、ORF1 の翻訳配列には、補因子チアミン二リン酸（ TPP ）結合領域である βαβモチーフが確認された。これより、ORF1 、ORF2 は E1p のα、βサブユニットを コードしていると予想された。これまで研究されたグラム陰性菌および陽性菌では、E1p と E2p（ジヒドロリポアミドトランスアセチラーゼ）の遺伝子がクラスター状になってい るが、P104 株の E1p 遺伝子のすぐ下流には E2p 遺伝子はないことがわかった。 発表状況：日本化学会北陸地区発表会（平成 10 年 11 月）、日本化学会第 76 春季年会 （平成 11 年 3 月発表予定） keywords Copyright. c. 低温菌、構造遺伝子、ホモロジー検索、ピルビン酸デヒド ロゲナーゼ 1999 by Kazuma Oikawa.
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