タンパク質のリフォールディング：原理と実際 Protein refolding: principles and practices
津本 浩平 Kouhei TSUMOTO 東京大学大学院新領域創成科学研究科
Graduate School of Frontier Sciences, The University of Tokyo 1. はじめに 遺 伝 子 が 手 に 入 れ ば 、さ ま ざ ま な 発 現 系 に よ り 目 的 の 機 能 を 持 つ 蛋 白 質 を 大 量 に 調 製 す る こ と が 可 能 で あ る 。 し か し な が ら 、 不 溶 性 顆 粒(封 入 体 と も よ ぶ ) と い わ れ る 凝 集 体 を 形 成 し 、結 果 と し て 不 活 性 型 の 組 換 え 蛋 白 質 と し て 得 ら れ る こ と が し ば し ば あ る 。ま た 、蛋 白 質 の 機 能 ・ 構 造 を 保 持 さ せ る 高 次 構 造 を よ り 安 定 に 制 御 す る た め は 、 溶 媒 側 の 調 整 が 重 要 で あ る 。 筆 者 ら は 、 最 近 、 こ の よ う な ハ ン ド リ ン グ 技 術 を「 プ ロ テ イ ン マ ニ ピ ュ レ ー シ ョ ン 」と 総 称 し 、フ ォ ー ル デ ィ ン グ 制 御 に 関 す る 新 規 で か つ 汎 用 性 の 高 い 溶 媒・共 溶 質 シ ス テ ム の 開 発 を 目 指 し て 研 究 を 進 め て い る 。以 下 に 、フ ォ ー ル デ ィ ン グ 制 御 に 関 連 す る 諸 技 術 開 発 研 究 の 現 状 を 、特 に 原 理 と 実 際 に つ い て 、最 近 の 研 究 例 も 交 え て 、ま と め て み た い 。 2 蛋 白 質 の リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ ： 原 理 ア ン フ ィ ン ゼ ン の ド グ マ と し て よ く 知 ら れ て い る よ う に 、お の お の の 蛋 白 質 は 、そ の ア ミ ノ 酸 配 列 に よ っ て 最 も 適 切 で エ ネ ル ギ ー 的 に 安 定 な 立 体 構 造 を 取 る[1]。 基 本 的 に は 、 疎 水 的 な 領 域 を 分 子 内 部 に 置 き 、 親 水 的 な 領 域 を 分 子 表 面 に 置 く こ と に よ り 蛋 白 質 の フ ォ ー ル デ ィ ン グ が 促 進 さ れ 、分 子 内 部 に 形 成 さ れ る 水 素 結 合 や 塩 橋（ 静 電 的 相 互 作 用 ）に よ り 構 造 安 定 化 の エ ネ ル ギ ー を 獲 得 す る [2]。 蛋 白 質 の 折 り 畳 み 過 程 そ の も の の 記 述 に 関 す る 基 礎 的 研 究 が 、実 験 的 に あ る い は 計 算 科 学 的 に 精 力 的 に 行 わ れ て お り 、一 定 の 成 果 を 収 め て い る 。こ の よ う な フ ォ ー ル デ ィ ン グ に よ り 獲 得 さ れ る 熱 力 学 的 安 定 性 は ‐10 kcal/mol 程 度 で あ り 、Marginal Stability と 呼 ば れ る 。 熱 力 学 支 配 と い う 観 点 で は 、 蛋 白 質 の フ ォ ー ル デ ィ ン グ は 、協 同 的 と さ れ る 分 子 内 非 共 有 結 合 形 成 に よ る エ ン タ ル ピ ー 変 化 量 と エ ン ト ロ ピ ー 変 化 量 の 微 妙 な バ ラ ン ス で 安 定 化 さ れ て い る こ と に な る 。こ の よ う な 蛋 白 質 の フ ォ ー ル デ ィ ン グ を 溶 媒 側 か ら 制 御 す る の が 、い わ ゆ る リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ と 総 称 さ れ る 操 作 で あ る[3-6]。 フ ォ ー ル デ ィ ン グ の 制 御 は 、正 し く 折 り た た ま れ る か 、凝 集 形 成 あ る い は 天 然 型 と 異 な る 折 り た た み に す る か の 競 争 反 応 に お い て 、よ り 正 し く 折 り た た ま れ 天 然 型 の 立 体 構 造 を 形 成 ・ 維 持 さ せ る 方 向 （ 正 方 向 ） に 導 く こ と に あ り 、 そ
の 効 率 は 、こ の 個 々 の 蛋 白 質 が 示 す 中 間 状 態 自 身 の 性 質 に 強 く 依 存 す る 。例 え ば 凝 集 は 、部 分 的 に 構 造 を と っ た 中 間 体 ど う し あ る い は 部 分 変 性 し た 蛋 白 質 の 分 子 間 相 互 作 用 に 起 因 す る 。 3 蛋 白 質 の リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ ： 実 際 凝 集 体 を 活 性 あ る 分 子 種 に リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ す る ま で の 大 き な 流 れ は 、単 離 、 可 溶 化 、 巻 き 戻 し 反 応 の 3 段 階 に 分 け ら れ る 。 a) 単 離 組 換 え 蛋 白 質 を 細 胞 質 内 で 大 量 発 現 さ せ る こ と に よ っ て 得 ら れ る 凝 集 体 は 、 細 胞 の 中 で 比 較 的 高 密 度 に あ る た め 、細 胞 を 破 砕 し た 後 、比 較 的 低 速 度 の 遠 心 分 離 に よ り 分 離 が 可 能 で あ る 。残 渣 は 界 面 活 性 剤 な ど で 除 去 す る こ と が 可 能 で あ る 。一 方 、高 発 現 さ せ た 際 、発 現 蛋 白 質 が 可 溶 性 画 分 と 封 入 体 画 分 が 共 存 す る 現 象 が 頻 繁 に 見 ら れ る 。こ の よ う な 場 合 は 、先 に 述 べ た 従 来 取 り 上 げ ら れ る 封 入 体 と は 異 な り 、比 較 的 ル ー ズ な 会 合 体 を 形 成 し て い る こ と が 多 く 、後 述 の L-ア ル ギ ニ ン に よ る 抽 出 が 有 効 と な る [7]。 b) 可 溶 化 会 合 凝 集 体 に あ る 摂 動 を 与 え て 可 溶 化 さ せ る こ と に な る 。こ れ に は 、変 性 剤 が 濃 度 依 存 的 に ポ リ ペ プ チ ド 鎖 に 結 合 す る こ と 、界 面 活 性 剤 を 用 い て ミ セ ル 抽 出 す る こ と 、温 度 あ る い は 圧 力 を 会 合 凝 集 体 に 与 え て ポ リ ペ プ チ ド 鎖 間 相 互 作 用 を 摂 動 さ せ 、 水 和 さ せ る 、 と い っ た 手 法 が 試 み ら れ て い る 。 一 般 的 に は 尿 素 や 塩 酸 グ ア ニ ジ ン に 代 表 さ れ る 変 性 作 用 の 強 い 物 質 を 高 濃 度 で 用 い る 場 合 が 多 い 。こ れ ら は そ の 濃 度 に 依 存 し て 蛋 白 質 に 結 合 す る が 、十 分 に 蛋 白 質 に 結 合 さ せ て 変 性 状 態 を 得 る た め に は 、か な り の 高 濃 度 を 必 要 と す る 。 界 面 活 性 剤 系 可 溶 化 剤 と し て 、SDS、n-セ チ ル ト リ メ チ ル ア ン モ ニ ウ ム 塩 酸 塩(CTAB)、n-ラ ウ リ ル サ ル コ シ ン ナ ト リ ウ ム な ど の 適 用 が 報 告 さ れ て い る [3]。 界 面 活 性 剤 の 場 合 は 、 臨 界 ミ セ ル 濃 度 （CMC ） 以 上 で 抽 出 す る こ と が 多 く 、 実 際 、封 入 体 の 可 溶 化 も ミ セ ル 様 結 合 を 示 す 。ミ セ ル 様 抽 出 後 フ ォ ー ル デ ィ ン グ し な い 場 合 は 、 界 面 活 性 剤 の 濃 度 を CMC 以 下 に 低 下 さ せ た と き に 蛋 白 質 の 溶 解 度 が 著 し く 低 下 し 再 び 凝 集 が 起 こ る[3]た め 、 各 種 添 加 剤 に よ っ て 凝 集 形 成 を 回 避 し つ つ 折 り 畳 み を 促 す 必 要 が あ る 。 封 入 体 中 に 存 在 す る 蛋 白 質 の 構 造 に つ い て の 議 論 は 、封 入 体 形 成 機 構 も 含 め て 、 盛 ん に 行 わ れ て き た[8-11]。 我 々 は 、 超 高 度 好 熱 菌 由 来 蛋 白 質 や 一 本 鎖 抗 体 、 緑 色 蛍 光 蛋 白 質 あ る い は β2― ミ ク ロ グ ロ ブ リ ン に つ い て 、 形 成 さ れ る 封 入 体 の 二 次 構 造 を 分 光 学 的 に 解 析 し た と こ ろ 、天 然 類 似 の 分 子 種 を 多 数 含 む こ と を 示 唆 す る デ ー タ を 得 た[10]。そ こ で 、こ の 封 入 体 か ら の 蛋 白 質 の 可 溶 化 に 、 凝 集 抑 制 剤 で あ る L-ア ル ギ ニ ン を 用 い た と こ ろ 、 天 然 類 似 の 構 造 を 持 つ 分 子 種 を 選 択 的 に 可 溶 化 で き る こ と を 見 出 し て い る[7,12,13]。可 溶 性 画 分 と 不 溶 性 画 分 の 双 方 に 発 現 が 見 ら れ る 分 子 種 に お い て は 、不 溶 性 画 分 に お い て 天 然 様 の 折 り 畳 み 構 造 を 有 す る こ と が 多 く あ る 。 こ の よ う な 場 合 は 、 特 に L-ア ル ギ ニ ン を 加 え 、さ ら に 熱 や ほ か の 試 薬 に よ り 、若 干 の 摂 動 を 与 え る こ と に よ り 、効 果 的 に 可 溶 性 分 子 種 を 得 る こ と が 可 能 と な る 。 封 入 体 を 変 性 剤 を 含 ま な い 緩 衝 液 に 浸 し 、１ ０ ０ ０ － ５ ０ ０ ０ 気 圧 程 度 の 超 高 圧 下 に お く 、 と い う い わ ゆ る 圧 力 摂 動 法 が 最 近 注 目 を 集 め て い る[14]。 こ の
手 法 は 、 高 圧 力 に よ り 、 蛋 白 質 の 折 り 畳 み 構 造 に は 不 本 意 な 疎 水 的 相 互 作 用 、 静 電 的 相 互 作 用 を 抑 え 、ミ ス フ ォ ー ル ド し た 中 間 体 を 不 安 定 に し 、安 定 な 天 然 様 構 造 に 収 束 さ せ る 、と い う も の で あ る 。緩 衝 液 の 選 択 、多 量 体 蛋 白 質 へ の 適 用 な ど に 問 題 を 残 す も の の 、会 合 凝 集 体 の 可 溶 化 、と い う 観 点 で は 、効 果 的 な 手 法 の 一 つ 、と い っ て よ い だ ろ う 。圧 力 摂 動 法 に お い て も 、L-ア ル ギ ニ ン が も っ と も 効 果 的 で あ る ら し い 。 c) 巻 き 戻 し 反 応 一 般 に 、変 性 剤 で あ れ 界 面 活 性 剤 で あ れ 、可 溶 化 剤 を 用 い て 可 溶 化 し た 封 入 体 か ら 可 溶 化 剤 を 除 去 す る こ と に よ り 、リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ 反 応 を 進 め る 。可 溶 化 剤 の 除 去 に は 、 通 常 、 希 釈 法 か 透 析 法 が 用 い ら れ る 。 基 本 的 に は 、 折 り 畳 み 反 応 と 凝 集 形 成 反 応 の 競 争 反 応 で あ り 、こ の 競 争 を ど の よ う に 制 御 し て 天 然 型 構 造 へ 導 く か 、 と い う こ と に な る [15]。 い か に 可 溶 化 剤 を 除 去 す る か 、 そ の 方 法 論 が 最 も 重 要 で あ る 。 透 析 法 の 場 合 は 、可 溶 化 剤 の 濃 度 を 比 較 的 穏 や か に 低 下 さ せ る こ と が で き る が 、よ り 長 く 折 り 畳 み 中 間 状 態 に 置 く こ と に な り 、結 果 と し て 折 り 畳 み 中 間 体 か ら 凝 集 に 向 か い や す い 蛋 白 質 に つ い て は 、後 述 の よ う な 添 加 剤 を 工 夫 し て 凝 集 を 抑 え る か 、希 釈 に よ り 可 溶 化 剤 濃 度 を 速 や か に 低 下 さ せ る こ と に よ り 巻 き 戻 し 効 率 を 高 め る こ と が で き る 。一 方 、一 気 に 希 釈 し て し ま う と 凝 集 し て し ま う 場 合 も あ り 、 こ の 場 合 は 透 析 法 で 徐 々 に 可 溶 化 剤 を 除 く こ と で 解 消 で き る [15]。 こ の よ う な 巻 き 戻 し 過 程 に お け る 凝 集 を 防 ぐ こ と が 、活 性 回 復 に お い て 最 も 重 要 な 要 因 で あ り 、分 子 間 の 疎 水 的 相 互 作 用 を 防 ぐ た め に 、あ る い は 折 り 畳 み を 促 進 す る た め に 、低 分 子 化 合 物 を 添 加 す る こ と が 多 い 。こ の 効 用 と し て 、① 天 然 状 態 の 安 定 化 、② 誤 っ て 折 り 畳 ま っ た 分 子 を 選 択 的 に 不 安 定 化 、③ 折 り 畳 み 中 間 体 の 溶 解 度 の 上 昇 、④ 変 性 状 態 の 溶 解 度 の 増 加 、な ど が 考 え ら れ る 。添 加 剤 は 、 折 り 畳 み の 速 度 を 加 速 さ せ る も の （Folding Enhancer ） と 、 不 本 意 な 凝 集 形 成 を 防 ぐ も の（Aggregation Suppressor）に 大 き く 分 け る こ と が で き る[15]。 も っ と も 良 く 使 わ れ る 添 加 剤 と し て 、L-ア ル ギ ニ ン が あ る 。L-ア ル ギ ニ ン が な ぜ 有 効 に 働 く か 、そ の 詳 細 は 明 ら か で は な か っ た が 、最 近 の 筆 者 ら の 研 究 に よ り 、カ オ ト ロ ピ ッ ク 溶 媒 で あ る 塩 酸 グ ア ニ ジ ン と 同 じ グ ア ニ ジ ウ ム 基 を 持 っ て い る が 、変 性 作 用 は な く 、巻 き 戻 り 中 間 体 の 溶 解 度 を 高 め る と こ ろ に あ る こ と が 示 さ れ て い る[12,7]。 グ ア ニ ジ ウ ム 基 が 蛋 白 質 構 造 に 示 す 作 用 と ア ミ ノ 酸 の 持 つ 作 用 を 共 存 さ せ る こ と に よ り 、既 存 の 溶 媒 ・ 共 溶 質 効 果 で は 説 明 し づ ら い 作 用 を 示 す[16,17]。 界 面 活 性 剤 で は 、 ラ ウ リ ル-マ ル ト シ ド 、 ラ ウ リ ル サ ル コ シ ン ナ ト リ ウ ム な ど を 用 い る こ と で 、活 性 回 復 の 上 昇 が 報 告 さ れ て い る ほ か 、臨 界 ミ セ ル 濃 度 以 上 の ラ ウ リ ル マ ル ト シ ド の 存 在 下 で の 効 率 よ い 巻 き 戻 し の 成 功 例 が あ る[18]。 特 に 最 近 注 目 さ れ て き た の が 、人 工 シ ャ ペ ロ ン 系 で あ ろ う 。基 本 概 念 は 、変 性 剤 に よ り 抽 出 し た 蛋 白 質 を 、界 面 活 性 剤 を 含 む 緩 衝 液 に 置 き 、会 合 凝 集 を 抑 制 し な が ら 高 次 構 造 を 回 復 さ せ 、次 に 界 面 活 性 剤 を シ ク ロ デ キ ス ト リ ン な ど に よ り 脱 離 回 収 し て 、高 次 構 造 形 成 を 完 了 す る 、と い う も の で あ り 、生 体 内 の フ ォ ー ル ダ ー ゼ が 示 す 機 能 を 真 似 て い る[18,19]。界 面 活 性 剤 で は な く ポ リ エ チ レ ン
グ リ コ ー ル 、ヒ ド ロ ゲ ル ナ ノ 粒 子 が 化 学 量 論 的 に 変 性 蛋 白 質 に 結 合 し て 凝 集 を 抑 制 し 、 巻 き 戻 し 効 率 の 大 幅 な 上 昇 に つ な が る と い う 報 告 も あ る[20]。 折 り 畳 み と 凝 集 の 間 の 競 争 反 応 を 制 御 す る 、と い う 意 味 で 、分 子 シ ャ ペ ロ ン あ る い は 一 連 の フ ォ ー ル ダ ー ゼ の 利 用 も 有 効 で あ る 。微 粒 子 へ の 固 定 化 、固 定 化 樹 脂 へ の 応 用 も 可 能 で あ る[21,22]。最 近 報 告 さ れ て い る ゼ オ ラ イ ト を 使 っ た 方 法 も そ の 汎 用 性 が 期 待 さ れ る と こ ろ で あ る[23]。我 々 が 最 近 開 発 し た ア ミ ノ 酸 系 界 面 活 性 剤 を 用 い た リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ 法 も 界 面 活 性 剤 の 問 題 点 で あ る 脱 離 性 を 大 幅 に 改 善 し た 点 で 評 価 が 高 く 、 汎 用 性 の 高 さ が 示 さ れ つ つ あ る[未 発 表 ]。 4. 最 後 に 蛋 白 質 リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ は 各 論 的 で あ る も の の 、デ ー タ ベ ー ス も 整 備 さ れ つ つ あ る ほ か[24]、条 件 の ス ク リ ー ニ ン グ シ ス テ ム も 開 発 さ れ つ つ あ る [例 え ば 25]。 リ フ ォ ー ル デ ィ ン グ に 関 す る 発 表 論 文 が 年 々 増 え て い る こ と 、 我 々 の 発 表 論 文 の 引 用 数 や DL 数 が 年 々 増 え て い る こ と は 、研 究 者 の 本 技 術 へ の 関 心 が さ ら な る 高 ま り を 示 し て い る と 思 わ れ る 。 引 用 文 献 ( 1 ) A n fi n s e n, C . B . & S c he r a ga , H . A . A d v P r o t e i n C he m. 2 9 , 2 0 5 -3 0 0 ( 1 9 7 5 ) ( 2 ) Ta n fo r d , C . P r o t e i n S c i . 6 , 1 3 5 8 -1 3 6 6 ( 1 9 9 7 ) ( 3 ) 津 本 浩 平 ら ： 蛋 白 質 核 酸 酵 素 4 6 , 1 2 3 8 -1 2 4 6 ( 2 0 0 1 ) ( 4 ) B ur ge s s , R . R . M e t ho d s E n z y mo l . 4 6 3 : 2 5 9 -2 8 2 ( 2 0 0 9 ) ( 5 ) R ud o l p h, R . a nd L i l i e , H . : FA S E B J . 1 0 , 4 9 - 5 6 ( 1 9 9 6 ) ( 6 ) S i n g h, S . M . , & P a nd a , A . K . J . B i o s c i . B i o e n g. 9 9 , 3 0 3 -3 1 0 ( 2 0 0 5 ) ( 7 ) Ts u mo t o , K . e t a l . B i o t e c h no l . P r o g. 2 0 , 1 3 0 1 -1 3 0 8 ( 2 0 0 4 ) ( 8 ) F i n k, A . L. F o l d . D e s . 3 , R 9 - R 2 3 ( 1 9 9 8 ) ( 9 ) K o p i t o , R . R . Tr e nd s C e l l B i o l . 1 0 , 5 2 4 -5 3 0 ( 2 0 0 0 ) ( 1 0 ) U me t s u, M . e t a l . F E B S L e t t . 5 5 7 , 4 9 -5 6 ( 2 0 0 4 ) ( 11 ) M a r ko s s i a n , K . A . & K urg a no v, B . I . B i o c h e mi s t r y ( M o s c o w) 6 9 , 9 7 1 -9 8 4 ( 2 0 0 4 ) ( 1 2 ) Ts u mo t o , K . e t a l . B i o c he m. B i o p h ys . R e s . C o m mu n . 3 1 2 , 1 3 8 3 -1 3 8 6 ( 2 0 0 3 ) ( 1 3 ) 荒 川 力 ら 、 蛋 白 質 核 酸 酵 素 、 4 8 、 2 3 1 0 -2 3 1 7 ( 2 0 0 3 ) ( 1 4 ) S e e fe l d t M B , e t a l . P r o t e i n S c i . 1 4 , 2 2 5 8 - 2 2 6 6 . ( 2 0 0 5 ) ( 1 5 ) Ts u mo t o , K . e t a l . P r o t e i n E xp . P ur i f. 2 8 , 1 -8 ( 2 0 0 3 ) ( 1 6 ) Ar a ka wa T, Ts u mo t o K , Ti ma s he ff S N e t a l . B i o p h ys C h e m. 1 2 7 , 1 - 8 ( 2 0 0 7 ) ( 1 7 ) N a ka k i d o M , K ud o u M , A r a k a wa T, Ts u mo t o K . C ur r P ha r m B i o t e c h no l . 1 0 , 4 1 5 -4 2 0 ( 2 0 0 9 ) ( 1 8 ) Za r d e n e t a G , & H o r o wi t z P M . A n a l . B i o c h e m. 2 2 3 , 1 -6 ( 1 9 9 4 ) ( 1 9 ) C l e l a nd , J . H . e t a l . J . B i o l . C h e m. 2 6 7 , 1 3 3 2 7 -1 3 3 3 4 ( 1 9 9 2 ) ( 2 0 ) N o mu r a , Y. e t a l . F E B S L e t t . 5 5 3 , 2 7 1 -2 7 6 ( 2 0 0 3 ) ( 2 1 ) Te s h i ma , T. e t a l . B i o t e c h no l . B i o e n g. 6 8 , 1 8 4 -1 9 0 ( 2 0 0 0 ) ( 2 2 ) A l t a mi r a no , M . e t a l . N a t ur e b i o t e c h no l . 1 7 , 1 8 7 -1 9 1 ( 1 9 9 9 ) ( 2 3 ) C hi k u H , e t a l . A n a l B i o c h e m. 3 4 8 , 3 0 7 -3 1 4 ( 2 0 0 6 ) ; N a r a T Y, e t a l . B i o t e c h no l P r o g. 2 5 , 1 0 7 1 - 1 0 7 7 ( 2 0 0 9 ) ( 2 4 ) h t t p : / / r e fo l d . me d . m o na s h. e d u. a u / ; B u c kl e A M e t a l . N a t ur e M e t ho d s 2 , 3 ( 2 0 0 6 )
