論 文 要
旨 ､等 報
告書
氏
硬 与 し た 学 位 専 攻 分 野 の名 称 学 位 授 与 の番 号
黒博歯博
田 知 沙
甲
士学73
第 9 9号
学 位 授 与 の 日付 平 成 2 1 年 3 月 2
5 日
学 位 授 与 の 要 件 医歯学総合研究科機能再生 ･再建科学専攻 (学位 規則第4粂第1項咳 当) 学 位 論 文 題 名 Distribution
,
geneexbresPion,
andfuhctionalroleofEphA4duringossiBcation (骨形成 におけるEphA4の分布 ､遺伝子発現と機能的役割) 論 文 審 査 委 員 教授 長塚 仁 教授 山本 敏男 教授 滝川 正春
学 位 論 文 内 容 の 要
旨【緒言】
噛乳類において､長管骨は軟骨原基 として琴生 し､内軟骨性骨形成 を経て成長 を遂げて骨格を形 成す るとともに､造血臓器 としての骨髄 も作 り上げる｡その過程では間葉系､血球系のさまざま な細胞が種々のサイ トカイン､成長因子 とその受容体 を介 して情報交換 を行っている｡以前の研 究で我々は､ ヒ ト軟骨細胞株 HCS･2/8細胞に発現す るチロシンキナーゼ型受容体の一つ として Ep
h
A4を検出 した｡Ephを介 したシグナルは体節形成､細胞移軌 臓器形成､心脈管形成など さまざまな ところで重要な働 きをす る分子だが､その仕組みに関 してはいまだ不明の点が多 く残 されている.Ephファミリーメンバーの中でもEph
A4は比較的最近になって注 目されは じめた 分子であ り､神経領域での研究は比較的進んでいるが､骨､軟骨 における分布状況や機能は未だ わかっていない｡本研究では､長管骨組織 におけるEph
A4の発現､分布 と機能に関する薪知見 を得たのでここに報告す る｡【方法 ･及び材料】
免疫染色 :生後1週のマ ウス腰骨の切片に抗Ep
h
A4抗体を反応 させ､次に二次抗体であるHRP 標識ヤギ抗 ウサギIgGを反応 させた｡またカバーガラス上で培養 したSaOS･2細胞 を4%パラホ ルムアルデ ヒ ドで固定 し､抗Eph
A4抗体､抗核小体抗体を反応 させ､ さらにAlexaFlu｡r標識 の二次抗体を反応 させた｡細胞培養 ‥マ ウス成長軟骨細胞 を胎生18.5日マ ウス肋軟骨か らコラゲナーゼ処理により分離 し､
10%牛胎児血清伊BS)+
含有α･
MEMで培養 した｡HeLa(子宮頚部癌細胞株)､SaOS･2(骨芽細胞 様細胞株)､MDA･231(乳癌細胞株)､HCS･2伯微 骨細胞様細胞株)は10%FBS+含有DMEMで培 養 した｡RNA抽出とリアルタイムPCR:回収 した細胞をRNA抽出試薬Ⅰ80genにて抽出 したOリアルタ イムPCRにはLightCyclerシステムでTOYOBO SYBR GREEN PCRMasterMk を使用 し た｡
ウェスタンブロッ ト:4･20%勾配ポ リアク リルア ミ ドゲルを使用 し細胞か ら回収 したタンパクを 電気泳動LPVDF膜に転写 した｡それに抗Ep
h
A4抗体を反応 させ､ さらにHRP標識抗 ウサギ IgGを反応 させたO特異的シグナルはECLWestern BlottingDetectionシステムを使用 し検出した｡
Si.RNAによる遺伝子サイ レシンダ:SaOS‑2細胞 に
S i
RNA導入試薬si
PORTと共にsi
RNAを トランスフェクシ ョンした｡3日目にRNA抽出欝薬 にてRNAを回収 し､RNA精製のち逆転写､リアルタイムPCRをおこなった｡
アルカ リホスファターゼ活性 :酵素活性の評価は､パ ラニ トロフェニル リン酸を人工基質 とし､
生成 したパラニ トロフェノールの吸光度を測定 しで行 った｡
【結果
】
1
.マウス成長板におけるEph
A4の分布Ep
h
A4は､以前の研究で､ヒ ト軟骨細胞様HCS･2/8細胞上に存轟す るチロシンキナーゼ型 レセ プターの一つ として検出され､得 られた全クローンの約 20%を占めていた. よってこのEpb
A4 の局在を免疫染色法にて確落 した結果､肥大軟骨細胞層､および骨領域でEph
A4の明確な局在 を静め､静止､増殖軟骨細胞層にはEph
A4は検知 さ●れなかった02.invitroにおける内軟骨性骨化におけるEp
h
A4‑遺伝子発現の特性結合組織成長因子CCR2とep血44の遺伝子発現パターンを､胎生18.5日マ ウス肋軟骨より分離､
培養 した軟骨細胞 を用いて解析 した結果､cc
B
Bは分化培養開始後25日でピークを迎えたのに対 し､epb84はその後の分化の最終段階で遺伝子発現が急上昇 したO次に､ ヒ ト細胞株における Eph A4′mRNA
発現の比較検討 をRT L PCR
によりおこなった｡epL
A4の発現を各種細胞種で比較
し串結果､MDA2 3 1
､S a OS･ 2
､甲CS･2/8でEph A4mRNAが検出された一方､He La
では発現
が認められなかった.Eph A4の発現､産生の量的な違いを検討す るために､ リアルタイムPCR
He La
では発現 が認められなかった.Eph A4の発現､産生の量的な違いを検討す るために､ リアルタイムPCR
法 とウェスタンブロッ ト法に より検討 を行った｡リアルタイム
PCR
法による分析の結果､ S a OS･ 2
では､HCS,･2/8に比べて大幅にEp
h
A4の発現量が多い事がわか り､ウェスタンブロット法によ るタンパク質 レベルでの解析でも､HCS･2/8よりもS a OS･ 2
で強いEph A4分子のシグナルが検 出された｡
3.造骨細胞表現型におけるEp
h
A4ノックダウンの影響Ep
h A4の機能を探るためにS a OS･ 2
細胞に対 してs i RNA
を用いたepムA4
遺伝子ノックダウン
実験を行ったoepu 4連伝子が実際にノックダウンされている事を確認 したのち､同 じ条件下で
骨芽細胞のマーカー遺伝子であるosteocakiDとアルカ リフォスフアタ‑ゼ 6uPaβ 収 め m RNA
の発現を調べた ところ､､それぞれで発現の低下を認 めたOさらに
ALPa s e
活性の変動をみたtこ ろ､ノックダウン効果の強いS 皿NAの導入でわずかなが ら低下がみ られた｡
4 . S a OS ･ 2
細胞におけるEpb A4の細胞内局在
次に､
S a OS ･ 2
細胞におけるEph A4の局在 を明 らかにす るために､蛍光免疫染色を行った｡ レ
⊥ザ‑共焦点顕微鏡を用いた観察では､Ep
h
A4は細胞表面だけでなく､核内の小構造にも集積 している像がみ られた｡･そこで核小体のマーカーであるn u c l e o l i n
に対する抗体を用い､S a OS･ 2
細胞における核内Ep
h
A4の局在を再検討するとEph
A4の核内の集積が見 られ るも､核小体 とは 別の部位に局在す る事がわかった｡【考察】
本研究では骨芽細胞の形質維持におけるEp
h
A4機能の必要性が初めて示唆 された.そ して､骨 芽細胞での耳ph
A4のこの新 しい機能は､今まで報告 されているEph
A4､分子によって調節 される フォワー ドシグナル経路を介 した機能 と全 く異なるので､造骨細胞におけるこの機能が､Eph
A4 の核内移行による新たなシグナ リング経路を介 して行われている可能性 もある｡論 文 審 査 結 果 の 要 旨
Eph分子は受容体型チロシンキナーゼであ.り､EphA群､EphB群 に大き く分けられ､現 在 ヒ トではEphAl〜EphA8､EphBl〜EphB4お よび6とい う名称で整理 されている.EphA4 は比較的最近になって注 目されは じめた分子であ り､神経領域での研究は進んでいるが､
骨､軟骨 における分布状況や機能は未だ不明である｡本研究では､軟骨細胞様細胞株 (HCS‑2/8)において強 く発現 していたEphA4の骨形成における役割 を探ったものである｡
その結異､明 らかになったこととして以下の点を挙げている｡
1. マ ウス成長板の免疫染色では EphA4は､肥大軟骨細胞層､および骨周陶の細胞に 局在 していた｡
2.成長板軟骨初代培養細胞の分化過程で時､EphA4の遺伝子発現はCCN2遺伝子の発 現 ピーク後､すなわち分化の最終段階 (肥大化期)で急上昇が見 られた｡
3. Invitroの実験において､EphA4の遺伝子発現は､軟骨細胞様細胞株(HCS‑2/8)よ り骨芽細胞様細胞株(SaOS‑2)で高く､一方､子宮類癌細胞株(HeLa)では発現 していな かった｡
4. EphA4の機能を開べ るため､骨芽細胞様細胞株(SaOS‑2)でEphA4遺伝子をノックダ ウンす るとオステオカルシン遺伝子の発現は低下 し､ALPase活性 も低下 した｡
5.骨芽細胞様細胞森 (saos‑2)においてEphA4は細胞質のみでな く核内‑の集積が見 ら れ､核小体 とは別の醜位に局在 した｡
これ らの知見は､Ep姐4が骨形成に重要な役割 を果たす ことを初めて明 らかにす ると ともにEp叫4の新たなシグナ リング経路の存在の可能性 を示唆 した ものである｡
よって､本研究は博士 (歯学)の学位論文に値す るもの と静 めた｡
