金沢 大学 十 全 医 学 会雑 誌 第9 4巻 第1 号 3 9 −5 3 く1 9 8引 3 9
膵ラン ゲ ル ハ ン ス 氏島の異種移植に 関する研 究 特 に diffu sio n ch a m b e r を 伺 い た
膵 島 移 植 に つ い て
金 沢大 学 医学 部 第二外科 学 教室 住 任こ宮 崎 逸大 数 掛 福 井 即 斗大学等卜一外 科 学 教 室 住任こ中川原 儀三教 掛
野 手 雅 章
く昭和6 0年1月1 6日受 付I
ポ リ カ ー ボ ネー ト製のメ ンブ ラン フ ィ ルタ ー を利用し た diffu sio n cha mbe r に， ゴ ー ルデンハム ス タ ー の ランゲルハ ン ス氏 島 くラ氏 勘 を封入 くisletch am be rI し， ストレプ ト ゾ トシ ン糖尿病ラッ トに対 す る異種 移 植の研 究を行った■ 予備 実 験で， 材質の異な る 6 種 類の フ ィ ルタ ー を 比較し た が， グル コ ー ス や イン スリン の cha mbe r 内 外への透 過 性に著明な差は み ら れ な かった． 1，50 0 偶の ハム スタ ー ．ラ氏 島を 封入 し た islet cha mbe r を腹 腔 内に移 植し た場 合， 移植 後1週 間は血 中イン スリン億が有意に上昇し た が，
血糖 値には変 化が な か った− しかし， 封入 ラ氏 島 数を 6，0 0 0個にす る と， 5 匹の糖 尿 病ラット の う ち 2 匹 が約1 0 日間の 乳 血中イン スリン値の 上昇，血糖 値の低 下，尿 糖 値の低 下な ど著 明な改 善を 示 し た． 一 方，
ラ氏 島を直接 異種 移 植し た場 合は， 移植 後2 へ 3 日間のわずか な改 善を除いて， 糖 尿 病状 態に対し著 明な 改善 効 果は み ら れ な かった． 糖 尿 病ラットに移 植さ れ た d iffu sio n cha mbe r 内の ラ氏 島の組 織学 的 検 索で は， 免 疫 担 当細 胞の浸 潤はみら れ なか った が栄 養 素の フ ィ ルタ ー不 適過に起 因す る と思わ れ る ラ氏 島の変 性が認め ら れ た． し か し， d iffu sio n cha mbe r を 用いずに直 接 異種 移 植を し た場合に は， よ り著明 な免疫 拒 絶反応と ラ氏 島の破壊 が み ら れ た． d iffu sio n cha mbe r の使用によ る免疫反応回避 効果 を評 価す る た め に， 直接 細 胞 障 害 試験を 用いて被 移 植ラットの抗ハム スタ ー抗体を測 定し た． ラ氏 島を門脈 内ま た は腹 腱 内に直接 移 植し た糖 尿 病ラ ッ ト で は抗 体 価は 2 ん 5 日 以内に上昇し始め た が， d iffu sio n cha mbe rくislet Ch am be rl を 用いた場 合には， 2週間の軌 抗体 価の上昇を き た さ な かった． 以上 の結果よ り， diffu sio n Cha mbe r 内に封入 さ れ た ラ氏 島の異種 移 植は膵 移 植 研究のう えで有用 な方法であ り， d iffu sio n cha mbe r
が 異種 組 織に対す る免疫 拒 絶反応に対し て 回避効果 を有す ること が 示唆さ れ た．
K ey w ords islet cha m be r，diffu sio n ch a mbe r，X e n Otr a n Splantatio n of islets，im m un o s up pr e s sio n，dir e ct cy toto xic te st
19 2 2 年 B a nting らl ，によ る イン スリン の発見は， 糖 尿 病患者の予後を著し く改 善し たこと は 周 知の事 実で あ る． しかし 現在 一般に行な わ れ ている イン スリン の
投 与 方 法では， と くに血糖値の変 動が 不安 定な若 年型 糖 尿病 患 者に対しては適切 な 血糖 値の コ ントロ ー ルが 得ら れ難く， 長年イン スリン治療が行な わ れ ている糖 尿病 患者に お いて も， 徐々 に進 行す る細 小血管症 を完 全には防止 す ること が で き ない． さ らに近 年の外 科 手
術の進 歩に伴なっ て膵 癌や慢 性膵 炎に対して， し ば し ば膵 全摘 術が施行さ れ る よ うにな り， フ ィ ー ドバ ック
制 御によ る 血糖 管理 は ま す ま す 必要と なっている．
こ のよ う な問題を解 決す る う えで膵 移 植は有用 な一
つの手段で あ ることから， 近年， 膵ランゲルハ ン ス氏 島 くラ氏 劇 移植の研究が進め ら れてきて いる2 ト 61． と こ ろ で膵 移 植は， 血管 吻合を必要と す る膵臓 器 移 植と 血管吻 合を行な わず膵 組 織 片あ るいは膵ラ 氏島の み を A b br e viatio n s こB −W ．，body w eigh t ニC ha．
， Cha m be r芸D ．C ha．， diffu sio n cha mbe ri D ．C．T ．，
dir e ct cy toto xic te st 三D ．M ．E ．M ．1 Dulbe c c o m odified E agle
，
s m edi um ニE．C ha．， e m p t y Cha mbe r三H ．E ．
， he m ato xylin−e O SinニI．C ha−， islet cha m be ri K −R ．B −
， K r ebs−Ringe rbic a rbo−
4 0 野
移 植す る方 法とに大 別す ること が で き る． 従 来分離ラ 氏 島 移植は血管 吻合を行な う膵 臓 器 移植に比し拒絶反 応が起こりにくいと さ れ ていた が， Re cka rd ら7糊， 大 北ら鋸の報 告にみ ら れ る よ うにラ氏 島自 身にも強い抗 原 性を有す ること が明ら かにさ れ， 自家 あるいは同 系 移 植 以外で は拒 絶 反 応の出現は深 刻な問題と なってき た．
そこ で本 研究では， フ ィ ルタ ー膜くm e mbr a n efilte r，
M b．F1． を使用 し た diffu sio n cha mbe r の．C ha1． を作 製し， その内部に ゴー ルデンハ ム スタ ー よ り分 離し た ラ氏 島を封入 し て islet cha mbe r u．C ha．1 と し， ス ト
レプ ト ゾ トシ ンくS T ZI 糖 尿病ラッ トの腹 腔 内に異種 移 植を行なった． これによ る糖 尿病 状 態の改 善およ び 拒絶 反 応の発 現の有 無について， 主と し て免 疫反応回 避 効果の面から検 討し た．
Fig．1． P hotogr aph of diffu sio n cha mbe r． T he Cha mbe ris m ade of m e mbr a n e filte r sくBio−Radl
With a po r esiz e of O．45 JLm，at ta Ched toboth side s Of polyc a rbo n ate rings u sing M Fく診c e m e nt． T he polyc a rbo n ate ring ha s a hole to allo w a n l nje ctio n oftheisletsinto thed iffu sio n cha mbe r．
材料 お よ び方法 工． D．C ba．の作製
D ．C ha．の外 殻は ポ リ カ ー ボ ネ ー ト を 切断し利用 し た． す な わ ち， 外 径1 8 m m ，内径1 4 m m のポ リカー ボ ネ ー ト チュ ー ブ を幅7m m に切断し， その外周の 一部
にラ氏 島を封入 す る た め直 径 約2 m m のノJl孔を も う け た． その後ポ リ カー ボ ネ ー ト チュ ー ブの両面にM F 魯c e m e ntくM illipo r e Co rpo r atio n， Bed fo rdI で M b． F．を接 着し， D．C ha．を作 製し たく図1う．
使用 し た M b．F．は 6種 類で，その孔 径は 0 ，2 2，0．45，
くた だ し ポ リ カ ー ボ ネー ト製は 0．4 0メイ扉，1 ．2ノノm の 3 種で あ る． 材 質は 5種 類ま で が 人 工セ ルロ ー ス膜よ り な り， 他の 1 種 類は ポ リ カ ー ボ ネ ー ト製で あ る． ポ リ カー ボ ネー ト で作 製さ れ た M b．F．は，他の人工 セ ル
ロ ー スの も の よ り薄く く1 0ノJmう， 孔の形 態は m o n o．
po r e である く表 い．
工工． グルコ ー ス およ ぴ イン スリン の M b． F．透 過性
の検 索
1 ． ラ氏 島分 離 法
ラ氏 島は， 体重 くBody w eigh t， B．W I． 2 0 0JAb3 0 0g の ウ イスター 系雄ラッ ト よ り La cy ら1 01の方法に準じ て採 取し た． す な わ ち， 総 胆 管の十二指 腸 開口部を結 無し，肝 管 合 流 部よ り 21ノー2 3 G の翼状 針を刺入 し てハ
ンクス くH a nksl 液2 0 ml によ り膵を膨 化 後， 摘 出し た． 摘 出し た膵は 眼科用勢刀にて締 切 後， 脂肪 等の浮 遊細 片を除 去し て 5 0 ml容の三角フ ラ ス コに入 れ た． つ い で ハ ンクス液で 8 mgノd l濃 度と し たコ ラ ゲ ナー ゼ くc ollage n a s e，M illipo r e Co rpo r atio n，C la s sI VI 溶 液を 5 ml加え， 3 70C の水 浴 槽で1 0 へ 15 分 間 振と う
く15 0へJ2 0 0回ノ分I， 泥 状と なっ た時 点でイ ンキュベ ー ショ ンを中止 し た． 消 化さ れ た膵を 円錐形メ ス シリン
Table l． P hysic al pr ope rtie s of m e mbr a n e 丘1te r
M e mbr a n e s o u r c e C he mic al Po r e siz e
くc atalogu e n o1． c o m po sitio n くJLmJ
F ilte r th ickn e s s
FujiくF M −221 FujiくF M−4引 FtdiくF M −1 2 0I Sa rto riu sくS M l1 3 0 6I Sa rto riu sくS M l1 3 0 3ナ
B io−Radく3 1 3−0 0 5 9J
Cellulo s e a c etate
Cellulo s e a c etate
Cellulo s e a c etate Cellulo s e nitr ate
Cellulo s e nitr ate
Polyc a rbo n ate
2 5
ハリ
5 0 0 2 4 2 4 2 4 0 0 1 0
つ 上
0
n ate三M b ．F ．
， m e m br a n e filter三P．A ．P ．
， Pe r OXida s e a nti−pe r O Xid a s e三S．T ．I．． sh ort tim e
in c ubatio nニS T Z，Str ep tOZOtO Cin ．
ハム スター膵ラ ンゲル ハン ス氏 島の異種 移植 4 1
ダ ー に移し， 3 0 mlの温お よ び冷ハンクス液にて各々 4 回 の洗浄を く り返し た．
洗 浄後 得ら れ た沈殿を グル ベッ コ変 法イ ー グル培 地 くDul be c c o m odified Eaglets， D．M ．E．M ．1 を 入 れ た シ ャー レ内に移し， 実 体 顕微 鏡 下でラ氏 島を キャピ ラ リ ー ピペ ッ ト を 用いて採取し た．
2 ． 分 離ラ氏 島の D ．C ba．内封入法
採 取し た ラ氏 島は， 0．2％牛 血 清ア ル ブ ミ ン
くA bm o u r pha r ma c e utic al Co rpo r atio n， C h ic ago，
U．S．A．1， 5 m M グルタ ミン乳 5 m M ピル ビ ン酸， 5
m M フマ ー ル酸を添加し た グルコ ー スを含ま ないク
レ ブスリンガ一 重 炭 酸くKr ebs−R inge r bic a rbo n ate，
K． R． B1 頒 衝 液． 1 ml中に2 個 浮遊さ せ， D．C ha．の
小 孔よ り 注 入 し た． 小 孔 は注入後， 庖 高 速 遠心機用 チュ ー ブ くBe ckm a n 閻
， ultr a c e ntrifuge tubel を 5
m m X 5 m m に切 断し た もの で密 封し I．C ha．と し た．
3 ． sho rt tim ein c ubatio n くS．TI．1． によ る グルコ ー ス およ び イン スリン の D ．C ha．透過性の検 討
I．C ha．移 植 効 果発現の条 件と し て ま ず D．C ha．内に
封入 さ れ た ラ氏 島が正常にその内分 泌機 能を 発揮し，
さ らに分泌さ れ た イン スリンが D ．C ha．外へ 拡 散す る こと が 必要と な る． そこでこれ らの検 索のた めに， グ
JLJコ ー ス の D．C ha．内へ の， あ るいは イン スリン の D．
C ha，外への透 過 性を S，T エによ り検 討し た． す な わ ち グル コ ー ス 10 0 m gノdl ま た は 4 0 0 m gld l濃 度のK．R． B．液10 血 を 入 れ た試料 瓶 中に， 2 偶の ラ氏 島を容し た I．C ha．を浸漬 し，3 7OC混 浴 中にて 9 柑l 分で9 0 分間 振と う し た．
インキュベ ー シ ョン終了後， 1．C ha．内 外の グル コ ー ス濃 度およ び イン スリン濃 度を測 定し た． グルコ ー ス
濃 度くn lg川里 は グルコ ー スオ キシダ ー ゼ法川に て， イ
ン ス リ ン濃 度くJLUlmll は固相 法1 2 1t P hadeba sin s ulin te st，塩野義製 薬 社 製う により測 定し た．
グル コ ー ス の D．C ha．内へ の移 行 度は， インキュ ベ ー ショ ン後のD．C ha．内グル コ ー ス濃 度をg．， D．C ha，外 グル コ ー ク濃 度をg2と し， 内 外に おけ る濃 度比glノg2
で算 出し た− イン ス リ ン の拡 散 率は， D．C ha．内 外のイ ン スリン量 を そ れ ぞ れ il．i2と し i2ノ11＋izの式で求め た．
工工I．
ハム スタ ー ． ラ氏島の糖尿病ラッ トヘの異種 移
植 1 ． 実験 動 物
do エーO r ラ氏 島は， 8 へ10 週 令の体重100 g 前後の雄
ゴ ー ルデンハ ム スタ ーの膵よ り 分離し，r e Cipie nt には 体重 3 0 0g 前 後のウ イス タ ー 系雄ラッ ト を 用いた． ラ 氏 島分離は無 菌 的に前述のコラ ゲ ナ ー ゼ消 化 法に準じ て行っ た．
2 ■S T Z 糖 尿 病ラッ トの作 成
糖 尿 病ラッ ト は ウ イスタ ー 系雄ラッ トの尾 静脈よ り S T Z 50 旬6 5 m gノkg を静 注し て作 成し た．r e cipie nt に は， 空腹 時血糖が 4 0 0 句5 0 0mg佃 と なっ た ものを使 用 し た．
3 ． 門 脈 内お よ び腹 腔 内直 接移 植群
異 種で あ るゴ ー ルデンハム スター と ウ イスタ ー ラッ ト間の移 植で は拒絶反応の発 現が 予想さ れ るの で， ラ 成 島を門 脈 内お よ び腹 腔 内に直 接 移植し た も の を， 工．
C ha．移植の対 照群と し た．
い 門脈 内移 植
門脈 内移 植は， 糖 尿病ラット をエ ー テル麻 酔 下で開 腹し，1 ml のD−M IE．M ．に浮遊さ せ た 1 5 0 0 個のゴ ー ル デンハム スター ーラ氏 島を， 2 3 G 注射 針で露 出し た門 脈 内に注入 す ることによ り行なっ た．
2ユ 腹 腔 内 直接 移植
腹 腔 内 移植で は， 糖 尿 病ラッ ト をエ ー テル麻 酔 後 開 腹し，D．M ．E 此 1 mlに浮遊し た 1 5 0 0個のゴー ルデン
ハ ム スタ ー ． ラ氏 島を腹 腔 内に直 接 注入散 布し て行 なっ た．
4 ．工．C ba，の腹 腔 内移 植 群
11 D．C ha■お よ び D．C ha．内培 地の滅菌 法
D．C ba．は 1 0％エチレ ンオ キ サ イ ド ガスで 5 時 間 滅 菌し た もの を使 用し た． M b．F．は S．T．圧 よ る グル
コ ー ス およ び イン スリン の透 過性の成績な ど か ら， ポ リ カ ー ボ ネー ト製の M b．F． くBio−Rad 社 乳 孔 径0．4 小河 を使用 し た． 培 地は D．M 且 M ．に0．2％年 血 清ア ルブ ミン， ペニ シリン G l O O単 位 血1，ストレ プトマイ シ ン 10 0 声g 仙 を添 加し た ものをミリ ポ アフ ィ ル タ ーで濾過 滅 菌し て使用 し た．
2 う封入ラ氏 島数
D．C h 内に封入 し たラ氏 島 数は1，50 0 個およ び 6，0 0 0 個の2群と し，6−0 0 0 個移 植 群は 3，0 00 個づつ 2
偶のI■C ba．に分けて移植し た． 対照と してラ氏 島を含 ま ず培 地の み をし1 れ た DIC ha．を作 製し， e m p t y Cha m be rくE．C haJ 移 植群． と し た．
3 J エーC ba．の移 植 方 法
そ れ ぞ れの工■C ha■はエ ー テ ル麻 酔 下の糖 尿 病ラット の腹 腱 内に静 置し た． なお抗生剤の投 与は行な わ な かっ た．
5 ■ 移植 後の測 定 項目
移 植ラット は， 術後1 週 間は代 謝ケ ー ジ内で飼 育し た． 体重， 尿 量， 尿 糖を， 移 植 当日， お よ び移 植 後1，
3 ， 5， 7， 1 0ナ 1 4 日目に測定し た． 血 糖 値お よ び 血 中イン スリン値は， 8 時 間の絶 食 後ラット尾 を切 断す ることによ り採血し て測定し た．
血糖値は グルコ ー スオ キシダ ー ゼ法1 1J， 血 中イン ス
