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論 文 内 容 の 要 旨
黄 色 ブ ド ウ 球 菌 ( S t a p h y l o c o c c u s a u r e u s ) は 、ヒ ト の 皮 膚 や 鼻 腔 内 の 常 在 菌 で あ り 、 成 人 の 2 0 ~ 3 0 % が 保 菌 し て い る 。 一 方 で 、 種 々 の 毒 素 を 産 生 し 、 食 中 毒 や 皮 膚 感 染 症 、 肺 炎 、 髄 膜 炎 な ど 様 々 な 感 染 症 を 引 き 起 こ す 代 表 的 な 病 原 菌 の 1 つ で も あ る 。 そ の 中 で も 、 ほ ぼ 全 て の β - l a c t a m s に 耐 性 を 示 す メ チ シ リ ン 耐 性 S . a u r e u s ( M R S A ) は 、 1 9 6 0 年 代 に 出 現 し 、 現 在 で は 院 内 感 染 の 主 要 な 原 因 菌 と し て 知 ら れ て い る 。 従 来 、M R S A は 病 院 内 か ら 分 離 さ れ 、 易 感 染 性 宿 主 に 対 す る 脅 威 と し て 認 知 さ れ て お り 、健 康 な ヒ ト に は 病 原 性 を 発 揮 し づ ら い と さ れ て き た 。 し か し 、1 9 8 0 ~ 1 9 9 0 年 代 に オ ー ス ト ラ リ ア や ア メ リ カ で 、 市 中 の 健 康 な 人 に 対 し て も 病 原 性 を 示 す M R S A が 出 現 し た 。病 院 内 で 分 離 さ れ る M R S A ( 院 内 型 M R S A ) と 市 中 で 分 離 さ れ る M R S A ( 市 中 型 M R S A ) は 、分 子 疫 学 的 特 徴 が 異 な る ( Ta b l e 1 ) 。 市 中 型 M R S A の 病 原 性 に 関 与 す る 代 表 的 な 毒 素 の 一 つ に P a n t o n - Va l e n t i n e l e u k o c i d i n ( P V L ) が 挙 げ ら れ る 。 P V L は 白 血 球 破 壊 毒 素 の 一 種 で あ り 、 皮 膚 軟 部 組 織 感 染 症 や M R S A 肺 炎 の 重 症 化 に 関 与 し て い る 。 P V L 陽 性 M R S A の 遺 た か だ ま し ゅ ん す け 氏 名 （ 本 籍 ） 髙 玉 駿 介 （ 北 海 道 ） 学 位 の 種 類 博 士 （ 薬 学 ） 学 位 記 番 号 博 第 3 0 2 号 学位授与の日付 令 和 2 年 3 月 1 9 日 学位授与の要件 学 位 規 則 第 4 条 第 1 項 該 当 学 位 論 文 題 目 P a n t o n - V a l e n t i n e l e u k o c i d i n 陽 性 メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 の 分 子 疫 学 研 究 論 文 審 査 委 員 （ 主 査 ） 教 授 野 口 雅 久 教 授 下 枝 貞 彦 教 授 田 野 中 浩 一Table 1. 院内型 MRSA と市中型 MRSA の違い
特徴 院内型 市中型
由来 入院患者
高齢者 新生児
外来患者 若年者 SCCmec type I, II, III IV, V 遺伝子型 (MLST) 5 8, 30, 59, 89, etc.
病原因子 TSST-1 ET, PVL
抗菌薬感受性 低 高
SCCmec, Staphylococcal cassette chromosome mec
MLST, Multilocus sequence typing ET, Exfoliative toxin
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伝 子 型 は い く つ か 知 ら れ て い る が 、 そ の 流 行 型 に は 地 域 性 が 見 ら れ る 。 そ の 中 で も 、U S A 3 0 0 と い う ク ロ ー ン は P V L の 他 に 、 皮 膚 へ の 定 着 な ど に 関 与 す る a r g i n i n e c a t a b o l i c m o b i l e e l e m e n t ( A C M E ) を 保 有 し て い る 特 徴 的 な ク ロ ー ン で あ り 、市 中 型 M R S A の 中 で も 特 に 病 原 性 が 高 い 。ア メ リ カ の M R S A に 関 す る 疫 学 研 究 で は 、 U S A 3 0 0 は 市 中 だ け で な く 、 一 部 の 病 院 に お い て も 主 要 な ク ロ ー ン で あ る こ と が 明 ら か と な っ て い る 。 一 方 、 本 邦 で は 、 P V L 陽 性 M R S A は 稀 で あ る と さ れ て お り 、 問 題 視 さ れ て こ な か っ た 。 し か し 、 M R S A は 、接 触 感 染 に よ っ て 伝 播 す る た め 、海 外 で 流 行 し て い る P V L 陽 性 M R S A が 本 邦 に 持 ち 込 ま れ る 可 能 性 が 極 め て 高 い 。そ の た め 、本 邦 に お け る P V L 陽 性 M R S A の 流 行 状 況 や そ の 分 子 疫 学 的 特 徴 を 明 ら か に す る こ と は 、 M R S A の 感 染 症 対 策 に 極 め て 重 要 な 情 報 と な る 。 そ こ で 、 本 研 究 で は 、 日 本 各 地 の 皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク ( 市 中 ) の 外 来 患 者 か ら 分 離 さ れ た M R S A と 東 京 都 多 摩 地 域 に 位 置 す る 複 数 の 総 合 病 院 で 分 離 さ れ た M R S A を 対 象 と し て 、P V L 陽 性 M R S A の 網 羅 的 な 分 子 疫 学 的 解 析 を 行 っ た 。 【 第 1 章 】 本 邦 の 市 中 に お け る P V L 陽 性 M R S A の 分 子 疫 学 的 解 析 本 章 で は 、日 本 各 地 の 皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク の 外 来 患 者 か ら 得 ら れ た S . a u r e u s を 用 い て 、 市 中 に お け る P V L 陽 性 M R S A の 流 行 状 況 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 日 本 各 地 （ 北 海 道 、 青 森 県 、 秋 田 県 、 新 潟 県 、 千 葉 県 、 神 奈 川 、 大 阪 府 、 香 川 県 、 熊 本 県 、 沖 縄 県 石 垣 島 ） に 位 置 す る 計 2 3 施 設 の 皮 膚 科 外 来 患 者 か ら 得 ら れ た S a u r e u s 8 5 4 株 を 解 析 し た と こ ろ 、 2 5 . 6 % ( 2 1 9 株 ) が M R S A で あ っ た 。 M R S A に お け る P V L の 陽 性 率 は 1 3 . 2 % で あ り 、 2 0 0 8 ~ 2 0 0 9 年 の 報 告 ( 0 . 7 % ) よ り も 有 意 に 高 か っ た ( P < 0 . 0 1 ) 。 M R S A が 分 離 さ れ た 患 者 の 疾 患 を 比 較 す る と 、P V L 陽 性 M R S A は 、 せ つ ・ よ う 、 蜂 窩 織 炎 な ど の 重 症 度 が 高 い 深 在 性 皮 膚 感 染 症 か ら 分 離 さ れ る 割 合 が 7 9 . 3 % で あ り 、P V L 陰 性 M R S A の 割 合 ( 2 0 . 0 % ) と 比 較 す る と 有 意 に 高 か っ た ( P < 0 . 0 1 ) 。 P V L 陽 性 M R S A の 遺 伝 子 型 を 決 定 す る た め に 、 s t a p h y l o c o c c a l c a s s e t t e c h r o m o s o m e ( S C C ) m e c t y p i n g 、p u l s e d - f i e l d g e l4
M R S A ク ロ ー ン が 、 本 邦 の 病 院 内 に も 流 入 し て い る こ と が 示 さ れ た 。 Table 2. Characteristics of PVL-positive MRSA clones in this study
LVFX, levofloxacin; CAM, clarithromycin; GM, gentamicin
【 第 3 章 】 本 邦 特 有 の P V L 陽 性 M R S A の ゲ ノ ム 解 析 第 1 章 に お い て 、 M L S T に よ る 遺 伝 子 型 が U S A 3 0 0 と 同 一 で あ る に も 関 わ ら ず 、A C M E が 陰 性 で 、 p u l s o t y p e お よ び S C C m e c の サ ブ タ イ プ が U S A 3 0 0 と は 異 な る U S A 3 0 0 類 似 株 が 沖 縄 由 来 株 か ら 検 出 さ れ た 。 さ ら に 、 第 1 章 お よ び 第 2 章 に お い て 、U S A 3 0 0 と 同 一 の p u l s o t y p e に 分 類 さ れ る が 、S C C m e c t y p e は 異 な る 株 が 計 1 3 株 検 出 さ れ た 。 こ れ ら 2 種 類 の ク ロ ー ン は 、 こ れ ま で に 報 告 が な い 。 そ こ で 、 本 章 で は 、 こ れ ら 2 種 の P V L 陽 性 M R S A ク ロ ー ン に つ い て ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た 。沖 縄 由 来 の U S A 3 0 0 類 似 株 で あ る T P S 3 1 5 6 株 の ゲ ノ ム 解 析 を 行 っ た 結 果 、こ の 株 は U S A 3 0 0 - LV ク ロ ー ン に 属 し て い た ( F i g . 2 ) 。 し か し 、 既 知 の U S A 3 0 0 - LV ( C A 1 2 株 ) に は 認 め ら れ な い 可 動 性 遺 伝 子 群 で あ る I C E 6 0 1 3 v a r i a n t を 保 有 し て い た 。 他 の U S A 3 0 0 類 似 株 も I C E 6 0 1 3 v a r i a n t を 同 一 の ゲ ノ ム 位 置 に 保 有 し て い た 。こ れ ら は 、本 邦 特 有 の 新 規 の 株 で あ る こ と か ら 、 U S A 3 0 0 - LV / J と 命 名 し た 。
Fig. 2. Genome comparison of USA300-LV/J (TPS3156), USA300 (FPR3757), and USA300-LV (CA12) with progressiveMauve.
次 に 、U S A 3 0 0 と 異 な る S C C m e c t y p e に 分 類 さ れ た 株 ( Ψ U S A 3 0 0 ) の 全 ゲ
COMER
COMER
ACME SaPI5 ICE6013 variant
(ICESauFPR3757) ICE6013 variant U S A 3 0 0 (F P R 3 7 5 7 ) U S A 3 0 0 -LV (C A 1 2 ) U S A 3 0 0 -LV /J (TP S 3 1 5 6 ) Clone Clonal Complex SCCmec type Endemic areas Isolated hospital % of isolates (n) Antimicrobial resisntace (%)
USA300 8 IVa USA
(worldwide)
A, B, C, D
E, F, G, I 65.6 (42)
LVFX (97.6), CAM (73.8) GM (64.3)
USA300-Like 8 IVc Okinawa
(Latin America) B 1.6 (1)
-EMRSA-15 22 IV Europe D, F, G 6.3 (4) LVFX (100), CAM (75.0) South West
Pacific clone 30 IV Pacific area
A, C, D,
E, G 15.6 (10)
LVFX (10.0), CAM (20.0) GM (10.0)
Taiwan clone 59 IV/V Asia A, D, H 4.7 (3) CAM (66.7)
ST80 80 II Mediterranean
area G 1.6 (1) CAM (100)
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ノ ム 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、S C C m e c t y p e I V の 構 成 遺 伝 子 で あ る c c r B 2 に 1 2 塩 基 の 欠 損 を 有 す る こ と が 明 ら か と な っ た 。こ の 欠 損 部 位 は 、S C C m e c t y p i n g で 用 い る プ ラ イ マ ー の 結 合 部 位 で あ っ た 。 し た が っ て 、Ψ U S A 3 0 0 の S C C m e c は 実 際 に は t y p e I Va の 構 造 を 保 有 し て い る が 、 P C R で は 正 し く t y p i n g が 出 来 て い な か っ た こ と が 明 ら か と な っ た 。 以 上 の 結 果 よ り 、U S A 3 0 0 - LV / J や Ψ U S A 3 0 0 は 、 そ れ ぞ れ 独 自 の 進 化 を 遂 げ 、 本 邦 の 各 地 に 定 着 し て い る P V L 陽 性 M R S A ク ロ ー ン で あ る こ と が 示 唆 さ れ た 。 【 総 括 】 現 在 、 薬 剤 耐 性 菌 は グ ロ ー バ ル な 問 題 と し て 、 世 界 各 国 で そ の 対 策 が 行 わ れ て い る 。 本 邦 に お い て も 、2 0 1 6 年 に A M R ( 薬 剤 耐 性 ) 対 策 ア ク シ ョ ン プ ラ ン が 策 定 さ れ た 。 そ の 中 で 、M R S A の 分 離 率 を 減 少 さ せ る こ と が 重 点 目 標 の １ つ と し て 掲 げ ら れ て い る 。 本 研 究 で は 、P V L 陽 性 M R S A が 市 中 ・ 院 内 と も に 増 加 し て い る こ と 、 ま た 、P V L 陽 性 M R S A の 中 で は U S A 3 0 0 が 主 流 で あ る が 、 そ の 他 複 数 の 海 外 流 行 ク ロ ー ン も 本 邦 に 存 在 す る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に 、 本 邦 特 有 の ク ロ ー ン で あ る U S A 3 0 0 - LV / J や Ψ U S A 3 0 0 の 存 在 を 見 出 し 、 日 本 各 地 に 分 布 し て い る こ と を 示 し た 。 本 邦 に お け る 高 病 原 性 M R S A の 詳 細 な 分 子 疫 学 的 特 徴 を 明 ら か し た 本 研 究 成 果 は 、今 後 の M R S A の 感 染 症 対 策 や A M R 対 策 ア ク シ ョ ン プ ラ ン の 実 施 に 貢 献 で き る と 考 え る 。 【 研 究 成 果 の 掲 載 雑 誌 】論文審査の結果の要旨
黄色ブドウ球菌はヒトの皮膚常在菌であると同時に、種々の毒素を産生する病原菌でもある。 特に、多剤耐性であるメチシリン耐性黄色ブドウ球菌 （MRSA）は院内感染の主要な原因菌（院 内型 MRSA）であり、AMR（薬剤耐性）対策アクションプランにおいても削減目標が掲げられて いる重要な菌である。ところが、近年、市中の健常者から市中型 MRSA が分離されており、欧米 においては、白血球破壊毒素 Panton-Valentine leukocidin （PVL）を産生する強毒性の市中型 MRSA （PVL 陽性 MRSA）が流行し、医療問題となっている。PVL 陽性 MRSA の遺伝子型はいくつか 知られており、その中で USA300 が主要な株となっている。一方、本邦では、PVL 陽性 MRSA は 稀であるとされ、問題視されてこなかった。しかしながら、MRSA は、接触感染によって伝播す るため、海外で流行している PVL 陽性 MRSA が日本に移入している可能性が極めて高い。そこ で、申請者は、日本各地の皮膚科クリニック （市中）の外来患者から分離された MRSA および 東京都多摩地域に位置する複数の総合病院で分離された MRSA を対象とし、PVL 陽性 MRSA の 網羅的な分子疫学的解析を行った。 第 1 章では、日本各地、23 施設の皮膚科クリニックの外来患者から得られた黄色ブドウ球菌 854 株を用いて、市中における PVL 陽性 MRSA の分子疫学的解析を行った。その結果、市中の 25.6% （219 株） が MRSA であり、PVL の陽性率は 13.2%で、増加傾向にあった。また、PVL 陽性 MRSA の多くは、せつ・よう、蜂窩織炎などの重症度が高い深在性皮膚感染症から分離されていた。さ らに、PVL 陽性 MRSA の遺伝子型は、USA300、USA300 類似株、Taiwan clone の 3 種に特定され、 特に USA300 が、日本各地に分布していることが明らかとなった。これらの薬剤感受性は遺伝子 型によって異なっていたが、USA300 は levofloxacin、fosfomycin、clarithromycin に耐性を示す多剤 耐性株であった。第 2 章では、2011～2015 年において多摩地域の総合病院入院患者から分離され た MRSA 3,433 株の分子疫学的特徴を解析した。PVL 陽性株の割合は、2009 年にはわずか 0.6%で あったが、2015 年には 3.1%と有意に増加していた。PVL 陽性 MRSA の遺伝子型を決定したとこ ろ、7 種の遺伝子型が認められ、USA300 が主要な株であった。PVL 陽性 MRSA は、遺伝子型毎 に薬剤感受性が異なっていたが、全ての PVL 陽性 MRSA が minocycline に感受性を示した。第 3 章では、第 1 章および第 2 章において分離された USA300 類似株であった TPS3156 株と USA300 と同一の遺伝子型であるが SCCmec type（type IV）が異なる ΨUSA300（type I）について全ゲノム の解析を行った。その結果、TPS3156 株は中南米で分離された USA300-LV に属しているが、可動 性遺伝子群 ICE6013 variant を保有する日本特有の新しい株であり、USA300-LV/J と命名した。一 方、ΨUSA300 は SCCmec type IV の構成遺伝子である ccrB2 の一部が欠損していた。そのため、 実際には SCCmec type IVa の構造を保有しているが、PCR では type I に分類されしまう株であった。 従って、USA300-LV/J や ΨUSA300 は、それぞれ独自の進化を遂げ、日本の各地に定着している PVL 陽性 MRSA であることが示された。
