4 8. 統計学的解析 ... 28 9. 倫理規定 ... 28 結果 ... 29 1. PVL 陽性 MRSA の分離率 ... 29 2. PVL 陽性 MRSA の分子疫学的解析 ... 30 3. PVL 陽性 MRSA の各種抗菌薬感受性 ... 34 考察 ... 37 第3 章：本邦特有の PVL 陽性 MRSA のゲノム解析 背景 ... 39 材料・方法 ... 40 1. 使用菌株 ... 40 2. 使用培地および培養条件 ... 40 3. ゲノム DNA の抽出 ... 40 4. 全ゲノムシークエンス ... 40 5. ゲノム解析 ... 41 6. ICE6013 の検出 ... 41 7. ΨUSA300 における ccrB2 のシーケンス解析 ... 42
8. ΨUSA300 の SCCmec typing ... 42
結果 ... 43 1. USA300 類似株 (TPS3156) の全ゲノム配列 ... 43 2. USA300 類似株 (TPS3156) の系統解析 ... 43 3. USA300 類似株の比較ゲノム解析 ... 43 4. USA300 類似株における ICE6013 の分布 ... 46 5. ΨUSA300 の全ゲノム解析 ... 46
6. ΨUSA300 の SCCmec を正しく typing するための ... 48
5
【 略 語 一 覧 】
ACME arginine catabolic mobile element AMR antimicrobial resistance
CC clonal complex
Ccr cassette chromosome recombinase
CLSI Clinical and Laboratory Standards Institute COMER copper and mercury resistance
DDH DNA-DNA hybridization ET exofoliative toxin
ICE integrative and conjugative element JANIS Japan Nosocomial Infections Surveillance MHA Mueller-Hinton agar
MHB Mueller-Hinton broth
MIC minimum inhibitory concentration MLST multilocus sequence typing
MRSA methicillin-resistant Staphylococcus aureus MSSA methicillin-susceptible Staphylococcus aureus MUSCLE multiple sequence comparison by log-expectation NT nontypeable
O.D. optical density
PBP penicillin binding protein PCR polymerase chain reaction PFGE pulsed-field gel electrophoreisis PVL Panton-Valentine leukocidin
SCC staphylococcal cassette chromosome SE staphylococcal enterotoxin
ST sequence type TSA tryptone soya agar TSB tryptone soya broth
1
【 序 論 】
黄 色 ブ ド ウ 球 菌 Staphylococcus aureus (S. aureus) は 、 Staphylococcaceae,
Staphylococcus 属 に 分 類 さ れ る 通 性 嫌 気 性 の グ ラ ム 陽 性 球 菌 で あ る 1-3)。 そ の 大 き さ は 0.5 μm~2.5 μm で 、 ぶ ど う の房 状 に 増 殖 す る 特 徴 を 持 つ 。 ま た 、 マ ン ニ ッ ト 分 解 性 を 示 し 、高 濃 度 の 食 塩 (5.8~25%) 存 在 下 に お い て も 増 殖 で き る 。本 菌 は 、ヒ ト の 手 指 や 鼻 腔 内 に 分 布 す る 常 在 菌 の 一 つ と し て 知 ら れ て お り 、 成 人 の 20~30% が 保 有 し て い る と さ れ て い る 4, 5)。 一 方 で 、 Staphylococcus 属 の 中 で も 病 原 性 が 高 い と さ れ て お り 、 食 中 毒 、 敗 血 症 、 髄 膜 炎 、皮 膚 軟 部 組 織 感 染 症 な ど 、様 々 な 感 染 症 の 原 因 菌 と な り 、重 症 化 し 死 亡 に 至 る 例 も 少 な く な い 4)。S. aureus は 1880 年 代 に 、Ogston に よ っ て 下 肢 の 膿 瘍 か ら 初 め て 分 離 さ れ た 6)。 そ の 直 後 に 、Rosenbach に よ っ て も 同 定 さ れ 、そ の 存 在 が 広 く 認 め ら れ た 。1928 年 に 、Fleming に よ っ て 、グ ラ ム 陽 性 菌 の 細 胞 壁 合 成 を 阻 害 す る 抗 菌 薬 penicillin が 発 見 さ れ 、 その 後 、 Florey と Chain が benzylpenicillin の 精 製 と 量 産 化に 成 功 し 、S. aureus 感 染 症 の 治 療 に 貢 献 し た 。 し か し 、 そ の 数 年 後 に は 、penicillin を 分 解 す る 酵 素 で あ る β-lactamase (penicillinase) を 産 生 す る penicillin 耐 性 S. aureus が 出 現 し た 。1945 年 に は 、分 離 さ れ る S. aureus の 80%が penicillin 耐 性 を示 し 、大 き な 問 題 と
な っ た 7, 8)。1960 年 に 、 penicillinase で 分 解 さ れ な い methicillin が 開 発 ・ 導
入 さ れ た が 、翌 年 の 1961 年 に は 、methicillin に も 耐 性 を 示 すメ チ シ リ ン 耐 性
S. aureus (methicillin-resistant S. aureus : MRSA) が 出 現 し た 9)。 こ れ ま で 、
MRSA は methicillin の 使 用 に 伴 っ て 出 現 し た と 考 え ら れ て い た が 、近 年 の ゲ ノ ム 解 析 に よ り 、methicillin の 使 用 以 前か ら MRSA が 存 在し て い た 可 能 性 が 指 摘 さ れ て い る 10)。MRSA は 最 初 の 分 離 か ら 数 十 年 の う ち に 世 界 中 に 広 が り 、現 在 、多 く の 先 進 国 に お い て 、医 療 関 連 感 染 症 の 主 要 な 原 因 菌 と な っ て い る 。本 邦 に お い て は 、1980 年 代 に 初 め て MRSA が 分 離 され て 以 降 、MRSA の 分 離 頻 度 は 急 激 に 増 加 し 、現 在 で も 院 内 感 染 対 策 に お い て 最 も 重 要 視 さ れ て い る 。
MRSA の methicillin 耐 性 を 担 う 遺 伝 子 mecA は 、 新 規 の 細 胞 壁 合 成 酵 素 (penicillin binding protein 2’: PBP2’) を コ ー ド す る 11-14)。β-lactams は 、 ペ プ
チ ド グ リ カ ン の 架 橋 反 応 を 担 う PBP に 結 合 し 、細 胞 壁 の 合 成 を 阻 害 す る 。し か し 、PBP2’は β-lactams に 対 す る 親 和 性 が 低 い た め 、 ほ ぼ 全 て の β-lactams へ の 耐 性 を 付 与 す る 。mecA は 、 staphylococcal cassette chromosome (SCC) と
2
recombinase (ccr) 複 合 体 の 組 み 合 わ せ の 違 い に よ り 、 現 在 、 type I~XIV に 分 類 さ れ て い る 15-17)。ヒ ト か ら 分 離 さ れ る MRSA は 、主 に type I~V の SCCmec を 保 有 し て い る 。
MRSA は 、分 離 さ れる 患 者 背 景 や そ の 分 子 疫 学 的 特 徴 か ら 、院 内 型 MRSA と 市 中 型 MRSA に分 類 さ れ る (Table 1)18)。 院 内 型 MRSA は 、 患 者 の 入 院 後
48 時 間 以 降 に 初 め て 分 離 さ れ た MRSA と 定 義 さ れ て い る 18)。 ま た 、 主 に
SCCmec type I、II、III を 保 有 す る と さ れ 、本 邦 で は 特 に type II が 多 い と さ れ て き た 19-21)。Type II の SCCmec は 、 pUB110 や Tn554 と い っ た 薬 剤 耐 性 遺
3 市 中 型 MRSA は 、 1980 年 か ら 1990 年 頃 に 出 現 し た 比 較 的 新 し い MRSA で あ る 。 市 中 型 MRSA に よ る 感 染 症 は 、 過 去 1 年 間 の 入 院 お よ び MRSA の 感 染 リ ス ク 因 子 (透 析 ・ 手 術 ・ カ テ ー テ ル の 留 置 ) が な い も の と さ れ て い る 18)。 市 中 型 MRSA の 報 告 は 、 1982 年 の デ ト ロ イ ト ・ ミ シ ガ ン 地 域 に お け る 複 数 の 患 者 に お け る 感 染 が 最 初 と さ れ て い る 22, 23)。 し か し 、 い ず れ の 患 者 も 、 入 院 歴 や 薬 物 の 乱 用 な ど の 感 染 リ ス ク を 有 し て い た 。 厳 密 な 市 中 型 MRSA に よ る 感 染症 例 と し て 報 告 さ れ た の は 、 1990 年 初 頭 の 西 オ ー ス ト ラ リ ア の キ ン バ リ ー 地 域 の 複 数 患 者 に お け る も の で あ る 24)。 こ れ ら の 患 者 は 人 口 の 少 な い 地 域 に 住 ん で お り 、都 市 部 の 大 規 模 な 医 療 セ ン タ ー の 患 者 と の 関 連 性 は 認 め ら れ な か っ た 。そ の 菌 株 は 非 多 剤 耐 性 で あ り 、オ ー ス ト ラ リ ア で そ れ ま で に 確 認 さ れ て い た MRSA とは 異 な る 特 徴 を 有 し て い た 。 市 中 型 MRSA は 院 内 型 MRSA と は 異 な り 、 健 康 な ヒ ト に 対 し て も 感 染 症 を 起 こ す こ と か ら 、病 原 性 が 高 い と さ れ て い る 7)。ま た 、そ の 増 殖 効 率 は 高 く 、院 内 型 MRSA に 比 べ 増 殖 速 度 が 高 い 特 徴 を 持 つ 25)。 そ の 一 方 で 、 抗 菌 薬 に 対 す る 感 受 性 は 良 好 で あ り 、β-lactams 以 外 の 抗 菌 薬 に は 感 受 性 を 示 す こ と が 多 く 、 耐 性 レ ベ ル は 低 い 2, 26)。 遺 伝 子 型 も 院 内 型 MRSA と は 大 き く 異 な り 、
SCCmec は type IV も し く は V が 主 流 で あ り 、 multilocus sequence typing (MLST) に よ る 分 類 で は 、 sequence type (ST) 8、 30、 59、 89 な ど 多 様 性 を示 す 27)。
市 中 型 MRSA に 高い 病 原 性 を 付 与 す る 因 子 の 一 つ と し て 、Panton-Valentine leukocidin (PVL) が 挙 げ ら れ る 28, 29)。PVL は 、プ ロ フ ァ ー ジ が 媒 介 す る 白 血
球 破 壊 毒 素 で あ り 、 皮 膚 軟 部 組 織 感 染 症 や MRSA 肺 炎 の重症 化 に 関 与 す る 。 PVL は lukS-PV と lukF-PV の 2 つ の 遺 伝 子 が コ ー ド す る タ ン パ ク (LukS-PV、 LukF-PV) で 構 成 さ れ る 8 量 体 の pore-forming toxin で あ る (Fig. 2) 28, 30, 31)。
4 面 に 発 現 し て い る C5a レ セ プ タ ー に 結 合 し 、 そ れ に 続 い て LukF-PV が 結 合 し 毒 性 を 発 揮 す る 30, 32)。 さ ら に 、PVL の 曝 露 量 に よ っ て 細 胞 の 反 応 が 変 化 し 、高 濃 度 で 暴 露 し た 場 合 は 好 中 球 の 細 胞 溶 解 (ネ ク ロ ー シ ス ) を 誘 発 す る。 さ ら に 、そ の 細 胞 溶 解 に よ っ て 放 出 さ れ る 炎 症 誘 発 因 子 が さ ら な る 炎 症 を 惹 起 し 、症 状 を 悪 化 さ せ る 。一 方 、低 濃 度 の 場 合 は 、ミ ト コ ン ド リ ア の caspase 経 路 (cytochrome c/caspase 9/caspase 3) を 介 し 、 細 胞 の ア ポ ト ー シ ス を 誘 発 す る 33)。 ま た 、PVL は 好 中 球 だ け で な く 、 ケ ラ チ ノ サ イ ト に 対 し て も ア ポ ト ー シ ス を 引 き 起 こ す 34)。PVL は 、 lukS-PV の 527 番 目 の 塩 基 の 違 い によ
り 、176 番 目 の ア ミ ノ 酸 が ア ル ギ ニ ン で あ る R variant と ヒ ス チ ジ ン で あ る H variant に 分 類 さ れ る 35)。R variant の PVL は 、ΦSa2USA と い う フ ァ ー ジ DNA
上 に 存 在 し て い る 。 一 方 で 、H variant は 、 複 数 の フ ァ ー ジ DNA 上 で そ の 存 在 が 確 認 さ れ て い る 。 PVL 陽 性 MRSA に は 、 い く つ か の 遺 伝 子 型 が 知 ら れ て お り 、 そ れ ら の 流 行 に は 地 域 性 が 見 ら れ る 2, 36-38)。そ の 中 で も 、特 に 注 目 さ れ て い る ク ロ ー ン と し て 、USA300 が挙 げ ら れ る 39-41)。USA300 は 、 ア メ リ カで 初 め て 確 認 さ れ た 株 で あ り 、PVL 陽 性 MRSA の 中 で も 特 に 病 原 性 が 高 い こ と で 知 ら れて い る 。そ の 流 行 は ア メ リ カ に と ど ま ら ず 、現 在 、先 進 国 を 中 心 と し て 世 界 各 地 で 報 告 さ れ て い る 。 ま た 、USA300 は市 中 型 MRSA で ある に も 関 わ ら ず 、 ア メ リ カ の 一 部 に お い て 、 病 院 内 の 主 要 な MRSA ク ロ ー ンに な り つ つ あ る 42-45)。
近 年 、 病 院 内 で 分 離 さ れ る MRSA が 、 院 内 型 MRSA か ら 市 中 型 MRSA に 置 き 換 わ り つ つ あ る こ と が 明 ら か と な っ て き た 37, 46-48)。MRSA は 接 触 感 染 に よ っ て 伝 播 す る た め 、 海 外 で 流 行 し て い る PVL 陽 性 MRSA が 本 邦 に 持ち 込 ま れ る 可 能 性 が 極 め て 高 い 。そ れ ら が 市 中 で 増 加・流 行 し た 場 合 、重 症 を 呈 し た 患 者 が 病 院 で 治 療 を 受 け る こ と も 考 え ら れ 、 病 院 内 へ の PVL 陽 性 MRSA の 持 ち 込 み が懸 念 さ れ る 。市 中 お よ び 病 院 内 に お け る PVL 陽 性 MRSA PVL-positive S. aureus PVL Neutrophil Release of proinflammatory factor
Epidermal cell necrosis Apoptosis Cell damage by proinflammatory factor
Small amount of PVL Large amount of PVL Cell lysis
Fig. 1. Mechanism of Panton-Valentine leukocidin
6
第
1 章
本邦の市中における
PVL 陽性 MRSA の分子疫学的解析
【 背 景 】
院 内 型 MRSA と 市 中 型 MRSA は 、 薬 剤 感 受 性 や 病 原 性 な ど 表 現 型 に よ る 分 類 だ け で な く 、PCR を 用 い た SCCmec typing や 保 有 す る 病 原 性 遺 伝 子 の 検 出 、MLST、pulsed-field gel electrophoresis (PFGE) な ど 遺 伝 子 型 に よ る 分 類 に よ っ て 区 別 さ れ る 49-52)。本 邦 で 分 離 さ れ る 院 内 型 MRSA は 、New York/Japanclone と 呼 ば れ る ST5、SCCmec type II (ST5-II) の 株 が 主 流 で あ る 19)。こ れ ら
は 、TSST-1 を コ ー ド す る tst 遺 伝 子 を高 頻 度 で 保 有 す る 53)。 一 方 、 市 中 型
MRSA の 遺 伝 子 型 には 多 様 性 が 見 ら れ 、 SCCmec は type IV も し く は type V で あ り 、ST8、30、59、89 な ど が 認 め ら れ る 2, 54)。市 中 型 MRSA の 出 現 と 流
行 が 報 告 さ れ た 1980 年 代 か ら 1990 年 代 の ア メ リ カ に お い て 流 行 し て い た の は 、MW2 (USA400) と 呼 ば れ る ST1-IV の PVL 陽 性 MRSA で あ っ た 51, 55, 56)。
し か し 、2000 年 代初 頭 に MRSA 感 染症 の リ ス ク の な い 受 刑 者 や 軍 人 、 ア ス リ ー ト 、 市 中 の 健 常 人 な ど 様 々 な 背 景 を 持 つ 集 団 に お い て 、USA300 と 呼ば れ る PVL 陽 性 MRSA に よ る 集 団 感 染 が相 次 い で 報 告 さ れ た 57-62)。USA300 は 、 そ れ ま で 主 流 で あ っ た MW2 と は大き く 異 な る ク ロ ー ン で あ り 、 そ の 遺 伝 子 型 は ST8-IV で あ る 。ま た 、そ の 出 現 以 降 、USA300 は 、ア メ リ カ の 市 中 に お い て 急 速 に 拡 大 し 、 そ れ ま で 流 行 し て い た MW2 に 置き換 わ り 、 そ の 流 行 範 囲 を 拡 大 さ せ て い っ た 63)。USA300 に 特 徴 的 な 因 子 の 1 つ と し て 、
arginine catabolic mobile element (ACME) が 挙 げ ら れ る 64)。ACME は 、arginine
7
【 材 料 ・ 方 法 】
1. 使 用 菌 株 使 用 菌 株 は 、2013 年 お よ び 2014 年 に、 日 本 各 地 (北 海 道 、 青 森 県 、 秋 田 県 、新 潟 県 、千 葉 県 、神 奈 川 県 、大 阪 府 、香 川 県 、熊 本 県 、沖 縄 県 石 垣 島) の 皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク 、 計 23 施 設 の 外 来 患 者 の 皮 膚 感 染 症 部 位 か ら 得 ら れ た 1,156 検 体 を 用 い た 。S. aureus の 薬 剤 感 受 性 標 準 株 と し て JCM2874 株 、MRSA の 標 準 株 と し て N315 株 を 使 用 し た 68)。PVL 陽 性 MRSA の コ ン ト ロ ー ル とし て 、JCSC6774 株 (USA300) を 使 用 し た 69)。SCCmec typing の コ ン ト ロ ー
ル 株 と し て 、 順 天 堂 大 学 よ り 分 与 を 受 け た NCTC10442 株 (type I)、 N315 株 (type II)、 85/2082 株 (type III)、 JCSC4744 株 (type IV)、 お よ び WIS 株 (type V) を 使 用 し た 70)。PFGE の 参 照 株 と し て 、 全 ゲ ノ ム 配 列 が 解 析 さ れ て い る
N315 株 (Accession No. BA000018) を 使 用 し た 71)。
2. 使 用 培 地 お よ び 培 養 条 件
S. aureus の 増 殖 に は 、 tryptone soya broth (TSB: Oxoid) に 、 Agar
bacteriological (Agar No.1) (Oxoid) を 1.5 %の 濃 度 で 加 え た tryptone soya agar (TSA) を 用 い た 。 菌 株 は 35°C 好 気 条 件下 で 培 養 し た 。
3. MRSA の 同 定
検 体 は 、mannitol salt agar (Oxoid) に 塗抹 し 、 増 殖 し た コ ロ ニ ー を TSA で 純 培 養 し た 。 純 培 養 し 得 ら れ た 菌 に 対 し 、 グ ラ ム 染 色 お よ び PS Latex (Eiken Chamical) を 用 い た コ ア グ ラ ー ゼ 試 験 を 行 い 、 グ ラ ム 陽 性 球 菌 、 コ ア グ ラ ー ゼ 陽 性 と 判 別 さ れ た も の を S. aureus とし た 。 ま た 、 後 述 す る PCR 法 に よ り
methicillin 耐 性 遺 伝子 mecA が 検 出 さ れ た 株 を MRSA、 検 出 さ れ な か っ た 株 を methicillin-susceptible S. aureus (MSSA) と し た 。
4 . P C R 法 に よ る 各 種 遺 伝 子 の 検 出 お よ び S C C m e c t y p i n g 4 - 1 . プ ラ イ マ ー の 合 成
8
typing は 、 Boye ら が 報 告 し た mltiplex PCR 法 で 使 用 さ れて い る 8 種 の プ ラ イ マ ー を 使 用 し た (Table 3) 78)。 ま た 、SCCmec type IV の サ ブ タ イ ピ ン グ に
は 、Kondo ら が 報 告 し た multiplex PCR 法 で 使 用 さ れ て い る 8 種 類 の プ ラ イ マ ー を 使 用 し た (Table 3)79)。各 プ ラ イ マ ー の 合 成 は 、Hokkaido System Science
社 に 依 頼 し た 。
4 - 2 . D N A の 増 幅
試 験 菌 液 に は 、S. aureus の シ ン グ ル コ ロ ニ ー を 滅 菌 超 純 水 100 µL に 懸 濁
し た も の を 用 い た 。8 連 PCR チ ュ ー ブ (Bio-Bik) に 、GoTaq® Green Master Mix
(Promega) 5 µL、 各 種 合 成 プ ラ イ マ ー を そ れ ぞ れ 10 pmol、 試 験 菌 液 1 µL を 加 え 、滅 菌 超 純 水 に て 全 量 10 µL と し た 。各 遺 伝 子 は 95°C、2 分 間 の 加 熱 に よ り DNA を 変 性 させ た 後 、 反 応 条 件 A は 58°C、 30 秒 間の ア ニ ー リ ン グ 、 72°C、 30 秒 間 の 伸長 反 応 、 反 応 条 件 B は 55°C、 30 秒 間の ア ニ ー リ ン グ 、 72°C、 30 秒 間 の 伸長 反 応 、 反 応 条 件 C は 55°C、 30 秒 間の ア ニ ー リ ン グ 、 72°C、 1 分 間 の 伸 長反 応 、 反 応 条 件 D は 、 60℃、 30 秒 間 の ア ニ ー リ ン グ 、 72℃、1 分 30 秒 間 の 伸 長 反 応 と し た (Table 2、3)。い ず れ の 反 応 条 件 に お い て も 、上 記 の 行 程 を 30 サ イ ク ル 行 い 、最 終 伸 長 反 応 を 、72℃、5 分 間 行 っ た 。 4-3. ア ガ ロ ー ス ゲ ル 電 気 泳 動 法 PCR 反 応 液 2 µL を 用 い て 電 気 泳 動 用 サ ン プ ル と し た 。 TAE buffer [40 mmol/L Tris-acetate (pH 8.2) 、 2 mmol/L EDTA 2Na] を 用 い 、 2% Agarose S (Nippon Gene) ゲ ル に て 100 V、 30 分 間の 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 電 気 泳 動 装 置 は 、水 平 サ ブ マ リ ン 型 電 気 泳 動 槽 Mupid®-2plus (Mupid) を 使 用 し た 。泳 動 後 、
9
Table 2. Oligonucleotide primers for detection of target genes
Target gene Primer Sequence (5'to 3') Product Condition length (bp) of reaction
mecA mecA-F GTGGAAGTTAGATTGGGATCATAGC 544 A mecA-R GTCAACGATTGTGACACGATAGC lukS/F-PV PVL-R ATGTCTGGACATGATCCAA 970 B PVL-R AACTATCTCTGCCATATGGT
arcA arcA-F GAGCCAGAAGTACGCGAG 671 B
arcA-R CACGTAACTTGCTAGAACGAG opp3 opp3-F GCAAATCTGTAAATGGTCTGTT 1183 B opp3-R GAAGATTGGCAGCACAAAGTG
tst tst-F GCTTGCGACAACTGCTACAG 559 B
tst-R TGGATCCGTCATTCATTGTTAT eta eta-F GTAGGAGCTAGTGCATTTGTTATTC 125 C eta-R GCATTGACACCATAGTACTTATTCC etb etb-F CACACATTACGGATAATGCAAG 604 C etb-R TCAACCGAATAGAGTGAACTTATCT etd etd-F CGCAAATACATATGAAGAATCTGA 452 C etd-R TGTCACCTTGTTGCAAATCTATAG sea sea-F GCAGGGAACAGCTTTAGGC 521 B sea-R GTTCTGTAGAAGTATGAAACACG seb seb-sec-F ACATGTAATTTTGATATTCGCACTG 667 B seb-sec-R TGCAGGCATCATGTCATACCA sec sec-F CTTGTATGTATGGAGGAATAACAA 284 B sec-R TGCAGGCATCATATCATACCA sed sed-F GTGGTGAAATAGATAGGACTGC 385 C sed-R ATATGAAGGTGCTCTGTGG see see-F TACCAATTAACTTGTGGATAGAC 171 C see-R CTCTTTGCACCTTACCGC seg seg-F CGTCTCCACCTGTTGAAGG 328 C seg-R CCAAGTGATTGTCTATTGTCG seh seh-F CAACTGCTGATTTAGCTCAG 359 B seh-R GTCGAATGAGTAATCTCTAGG sei sei-F CAACTCGAATTTTCAACAGGTACC 466 C sei-R CAGGCAGTCCATCTCCTG sej sej-F CATCAGAACTGTTGTTCCGCTAG 142 B sej-R CTGAATTTTACCATCAAAGGTAC fib fib-F CTACAACTACAATTGCCGTCAACAG 404 A
fib-R GCTCTTGTAAGACCATTTTCTTCAC
fnbA fnbA-F CATAAATTGGGAGCAGCATCA 127 A fnbA-R ATCAGCAGCTGAATTCCCATT
fnbB fnbB-F GTAACAGCTAATGGTCGAATTGATACT 524 A
fnbB-R CAAGTTCGATAGGAGTACTATGTTC
ermA ermA-F AGCGGTAAACCCCTCTGAG 457 A
10
Table 3. Oligonucleotide primers used for SCCmec typing and type IV subtyping
5 . P F G E に よ る 分 子 疫 学 的 解 析 5 0 )
5 - 1 . P F G E
DNA の 抽 出 、制 限 酵 素 に よ る 切 断 は GenePath® Enzyme Module Group
(Bio-Rad) と GenePath® Universal Module (Bio-Rad) に 記 載 さ れ た 方 法 を 用 い て 行
11
mmol/L EDTA 2Na、 10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 100 mmol/L sodium chloride] 300 µL を 分 注 し 、 作 成 し た プ ラ グ を 入 れ て 37°C で 1 時 間反 応 さ せ た 。 そ の 後 、lysis buffer を 除 去 し 、 TE buffer [10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 1 mmol/L EDTA 2Na] 600 µL で 2 回 洗 浄 し た 後 、 新 た な マ イ ク ロ 遠 心 チ ュ ー ブ に 20 mg/mL proteinase K (FUJIFILM Wako Pure Chemical) 12 µL 含 有 proteinase K buffer [1% sodium N-lauryl sarcosinate、 0.5 mmol/L EDTA 2Na] 300 µL を 分 注 し 、プ ラ グ を 加 え て 50°C、16~24 時 間 反応 さ せ た 。反 応 後 、proteinase K buffer を 除 去 し 、wash buffer [1 mmol/L phenylmethylsulfonyl fluoride、10 mmol/L Tris-HCl (pH 8.0)、 1 mmol/L EDTA (pH 8.0)] 600 µL で 3 回 、 TE buffer 600 µL で 2 回 、SmaI buffer [330 mmol/L Tris-acetate (pH 7.9) 、 100 mmol/L magnesium
acetate・ 4H2O、 660 mmol/L potassium acetate、 5 mmol/L (+) - dithiothreitol、
0.1% bovine serum albumin] 600 µL で 1 回 洗 浄 し た 。そ の 後 、25 U SmaI (Takara Bio) 含 有 SmaI buffer 300 µL に プ ラ グ を 加 え 、25°C、16~24 時 間 反 応 さ せ た 。 反 応 後 、SmaI buffer を 除 去 し 、 TE buffer 600 µL で 1 回 洗 浄 後 、 適 当 な 大 き
さ に 切 断 し た プ ラ グ を 1% pulsed field certified agarose (Bio-Rad) ゲ ル の ウ ェ ル に 挿 入 し 、TBE buffer [50 mmol/L Tris-HCl (pH 7.5)、 50 mmol/L boric acid、 0.5 mmol/L EDTA 2Na] を 用 い て 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 泳 動 は CHEF Mapper®
(Bio-Rad) で 行 っ た 。 泳 動 条 件 は initial switch time 5.3 秒 、 final switch time 34.9 秒 、 run time 20 時 間 、 angle 120°、 gradient 6.0 V/cm、 temperature 14°C、 ramping factor linear と し た 。泳 動 終 了 後、ゲ ル を 100 µg/mL ethidium bromide 溶 液 で 15 分 間 染 色 し 、45 分 間 精 製 水 中 で 脱 色 後 、305 nm の 紫 外 線 照 射 下で 写 真 撮 影 を 行 っ た 。
5 - 2 . 泳 動 パ タ ー ン の 解 析
得 ら れ た PFGE の DNA 泳 動 パ タ ー ン は Bio Numerics™ (Applied Math Ver. 7.6.3) を 用 い て 解 析 し た 。 Dice 係 数 を 用 い た 平 均 距 離 法 (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic average) に よ る 系 統 樹 を 作 成 し た (Band Tolerance 1.0%、Optimization 1.0%)。80%以 上 の 相 同 性 を 示 し た 場 合 、近 縁性 が 高 い 同 一 の グ ル ー プ (pulsotype) と し た 。
6. MLST に よ る 分 子 疫 学 的 解 析 6 - 1 . プ ラ イ マ ー の 合 成
S. aureus が 生 存 に 必 要 と す る housekeeping gene (arcC、aroE、glpF、gmk、 pta、tpi、yqiL) を 増幅 す る た め に 、各 遺伝 子 に 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 使 用 し
12 Table 4. Oligonucleotide primes for MLST
Target gene Primer Primer sequences (5’ to 3’) Product length (bp)
arcC arcC-F CGGTAATGCGATACAGACA 739
arcC-R TGCTACATCAATATCATCGATT
aroE aroE-F AGGACCAGGAGCTAAAGTAA 758
aroE-R GCGCTCTGCTTCCTCTA
glpF glpF-F GGAGGACATTTAATATGAATGTA 614
glpF-R TGGTAAAATCGCATGTCCAATTC
gmk gmk-F GGTCGTAAGGCATGGATA 705
gmk-R GCTGCAGTTGTTGCAAT
pta pta-F GGAGGACATTATGGCTGA 656
pta-R TTGTCACGTCGTCTGATT
tpi tpi-F GTGCGTTCACAGGTGAA 615
tpi-R GCATTACCATGTTCGCTT
yqiL yqiL-F GGCGTATTGGTTCATTAGA 769
yqiL-R GCTGGTCTTAAGCGACTTA
6-2. PCR 法 に よ る DNA の 増 幅
8 連 PCR チ ュ ー ブ に 、Q5® High-Fidelity 2×Master Mix (New England BioLabs)
5 μL、 2 種 類 の 合 成 プ ラ イ マ ー 各 々 25 pmol、 PCR 試 料 1 μL を 加 え 、 滅 菌 超 純 水 に て 全 量 が 10 μL と な る よ う に 混 合 し た 。 こ れ ら を DNA サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に セ ッ ト し た 。98°C、 30 秒 間 の 加 熱 に よ り DNA を 変 性 さ せ た 後 、 98°C、10 秒 間 の 変 性 、55°C、30 秒 間 の ア ニ ー リ ン グ 、72°C、45 秒 間 の 伸長 反 応 の 行 程 を 30 サ イ ク ル 行 っ た 。 6 - 3 . P C R 産 物 の 精 製
作 成 し た PCR 産 物は 、DNA ク リ ー ナ ー (FUJIFILM Wako Pure Chemical) を 用 い て 精 製 し た 。PCR 産 物 10 μL に DNA ク リ ー ナ ー を 等 量 加 え 、 室 温 で 10 分 間 以 上 静 置 し た 。 そ の 後 、14,000×g で 10 分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 を 取 り除 い た 後 、70% ethanol を 2 倍 量 添 加 し た。 14,000×g で 10 分 間 遠 心 分 離 し た 後 、上 清 を 除 去 し た 。20 分 間 の 放 置 に てペ レ ッ ト を 風 乾 し た 後 、滅 菌 超 純 水 20 μL 加 え た も の を PCR 精 製 物 と し た 。 6 - 4 . シ ー ケ ン ス 反 応
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る よ う に 混 合 し た 。こ れ ら を DNA サ ー マ ル サ イ ク ラ ー に セ ッ ト し た 。96°C、 5 分 間 の 加 熱 に よ り DNA を 変 性 さ せ た 後 、96°C、10 秒 間 の 変 性 、50°C、5 秒 間 の ア ニ ー リ ン グ 、60°C、4 分 間 の 伸 長 反 応 の 行 程 を 25 サ イ ク ル 行 っ た 。反 応 液 に 、 滅 菌 超 純 水 7.5 μL、 3M sodium acetate (pH 4.6) 1.5 μL、 95% ethanol 31.5 μL を 加 え よ く 混 合 し 、15 分 間 放 置 し た 。そ の 後 、遠 心 (室 温 、20,000 ×
g、 20 min) し 、 上 清を で き る 限 り 除 去 し た 。 さ ら に 70% ethanol 125 μL を 加
え 、遠 心 (室 温 、20,000 × g、10 分 間 ) し 、上 清 を で き る 限 り 除 去 し た 。真 空 乾 燥 に よ り ethanol を 完 全 に 除 去 し た 後 、 ペ レ ッ ト を Hi-Di ™ formamide (Thermo Fisher Scientific) 20 μL に 溶 解 し 、 電 気 泳 動 試 料 と し た 。
6-5. マ ル チ キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動
キ ャ ピ ラ リ ー 電 気 泳 動 に は 、 オ ー ト シ ー ケ ン サ ーABI PRISM™ 3130 DNA Sequencer (Thermo Fisher Scientific) を 用 い た 。10 × genetic analyzer buffer with EDTA (Thermo Fisher Scientific) を 超 純 水 で 10 倍 希 釈 し 、 陽 極 バ ッ フ ァ ー お よ び 陰 極 バ ッ フ ァ ー と し 、ポ ン プ ブ ロ ッ ク 及 び オ ー ト サ ン プ ラ ー に そ れ ぞ れ セ ッ ト し た 。 泳 動 用 試 料 を MicroAmp™ optical 96-well reaction plate (Thermo Fisher Scientific) に 移 し て 電 気 泳 動 を 行 い 、 塩 基 配 列 を 決 定 し た 。
6-6. ST、clonal complex (CC) の決定
得 ら れ た 塩 基 配 列 を も と に 、Bio Numerics™を 用 い て ST を 決定 し た 。 Web 上 の デ ー タ ベ ー ス と し て 、PubMLST (https://pubmlst.org/) を 用 い た 。 ま た 、 遺 伝 学 的 に 近 縁 性 の 高 い グ ル ー プ で あ る CC は PubMLST の デ ー タ ベ ー ス を 用 い て 決 定 し た 。
7 . 使 用 薬 剤
薬 剤 感 受 性 の 測 定 に は 、ampicillin (FUJIFILM Wako Pure Chemical)、oxacillin (FUJIFILM Wako Pure Chemical)、cefdinir (Sigma-Aldrich)、faropenem (Maruho)、 fosfomycin (Sigma-Aldrich) 、 levofloxacin (LKT Laboratories) 、 clarithromycin (Tokyo Chemical Industry)、 clindamycin (Tokyo Chemical Industry)、 gentamicin (FUJIFILM Wako Pure Chemical)、vancomycin (FUJIFILM Wako Pure Chemical)、 arbekacin (Meiji Seika Pharma)、 minocycline (Sigma-Aldrich) を 使 用 し た 。
8 . 薬 剤 感 受 性 の 測 定
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(bioMèrieux) 0.5 と 同 等 (約 1.5 × 108 cells/mL) に 懸 濁 さ せ 10 倍 希 釈 し 、薬 剤
を 含 有 し た MHA に 、 ミ ク ロ プ ラ ン タ ー MIT-P 型 (Sakuma) を 用 い て 接 種し た 。35°C で 18~24 時 間 培 養 後 、菌 の 生 育 を 判 定 し 、菌 の 発 育 を 阻 止 し た 薬 剤 の 最 小 濃 度 を そ の 菌 株 に 対 す る MIC (μg/mL) と し た 。そ れ ぞ れ の 薬 剤 に 対 す る 耐 性 の ブ レ イ ク ポ イ ン ト は 、CLSI に 準 じ て 、 ampicillin: 0.5 μg/mL 、 oxacillin: 4 μg/mL、cefdinir: 4 μg/mL、levofloxacin: 4 μg/mL、clarithromycin: 8 μg/mL、clindamycin: 4 μg/mL、 gentamicin: 16 μg/mL、 vancomycin: 16 μg/mL、minocycline: 16 μg/mL と し た 。Faropenem、fosfomycin、arbekacin の ブ レ イ ク ポ イ ン ト に つ い て は 、CLSI に よ り 定 義 さ れ て い な い た め 、 感 受 性 株 で あ る JCM2874 株 と の 比 較 に よ り 、faropenem: 8 μg/mL、fosfomycin: 64 μg/mL、 arbekacin: 8 μg/mL と し た 。
9 . 統 計 学 的 解 析
各 遺 伝 子 の 検 出 率 の 差 は 、JMP® software (SAS Institute) を 用 い て 、2検 定
も し く は Fisher の 正 確 確 率 検 定 に よ り 検 定 し 、 P <0.05 の と き に 統 計 学 的に 有 意 と し た 。
10. 倫 理 規 定
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【 結 果 】
1. 日 本 各 地 の 皮 膚 感 染 症 外 来 患 者 か ら 分 離 さ れ た MRSA の 割 合
日 本 各 地 の 皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク を 受 診 し た 外 来 患 者 か ら 採 取 し た 1,156 検 体 か ら 、854 株 の 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 を 分 離 し た 。こ の う ち 、219 株 (25.6%) が MRSA、 635 株 (74.4%) が MSSA と 同 定 さ れ た (Table 5)。 熊 本 と 沖 縄 の MRSA 検 出 率 は 、 全 国 平 均 よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.05)。 一 方 、 千 葉 の MRSA 検 出 率 は 、 全 国 平 均 よ り も 有 意 に 低 か っ た (P <0.05)。 MRSA に つ い て SCCmec typing を 行 っ た 結 果 、 全 国 平 均 で は SCCmec type V が 91 株 (41.6%) と 最 も 多 く 、 次 い で type IV が 78 株 (35.6%) で あ っ た (Table 6)。 沖 縄 由 来 MRSA は 、 全 て SCCmec type IV で あ っ た 。
Table 5. Isolation rates and PVL-positive rates of MRSA from outpatients with skin and soft tissue infections in Japan
District No. of No. of No. (%) of No. (%) of PVL-positive isolates medical facilities S. aureus MRSA MRSA MSSA
Hokkaido 1 16 4 (25.0) 0 0 Aomori 6 27 4 (14.8) 2 (50.0) 0 Akita 3 5 1 (20.0) 0 0 Niigata 1 36 12 (33.3) 0 0 Chiba 1 133 15 (11.3)a 5 (33.3) 2 (1.7) Kanagawa 1 14 5 (35.7) 1 (20.0) 0 Osaka 1 88 18 (20.5) 0 1 (1.4) Kagawa 7 473 127 (26.8) 6 (4.7) 0 Kumamoto 1 35 17 (48.6)b 0 0 Okinawa 1 27 16 (59.3)b 15 (93.8)c 3 (27.3) Total 23 854 219 (25.6) 29 (13.2)d 6 (0.9)
a, significantly lower than total (%) (P <0.05) b, significantly higher than total (%) (P <0.05)
c, significantly higher than Hokkaido, Niigata, Chiba, Kanagawa, Osaka, Kagawa, and
Kumamoto (%) (P <0.05)
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Table 6. SCCmec types of MRSA isolated from each district in Japan District (n)* No. (%) of SCCmec type
I II III IV V NT Hokkaido (4) 0 (0) 1 (25.0) 0 (0) 1 (25.0) 2 (50.0) 0 (0) Aomori (4) 0 (0) 2 (50.0) 0 (0) 2 (50.0) 0 (0) 0 (0) Akita (1) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 1 (100) 0 (0) Niigata (12) 2 (16.7) 1 (8.3) 0 (0) 2 (16.7) 3 (25.0) 4 (33.3) Chiba (15) 5 (33.3) 1 (6.7) 0 (0) 5 (33.3) 4 (26.7) 0 (0) Kanagawa (5) 0 (0) 2 (40.0) 0 (0) 3 (60.0) 0 (0) 0 (0) Osaka (18) 0 (0) 1 (5.6) 0 (0) 6 (33.3) 10 (55.6) 1 (5.6) Kagawa (127) 2 (1.6) 14 (11) 0 (0) 37 (29.1) 62 (48.8) 12 (9.4) Kumamoto (17) 1 (5.9) 1 (5.9) 0 (0) 6 (35.3) 9 (52.9) 0 (0) Okinawa (16) 0 (0) 0 (0) 0 (0) 16 (100) 0 (0) 0 (0) Total (219) 10 (4.6) 23 (0.5) 0 (0) 78 (35.6) 91 (41.6) 17 (7.8)
*,No. of MRSA isolates; NT, nontypeable
2. PVL 陽 性 株 の 検 出 と 患 者 の 特 徴
分 離 さ れ た 黄 色 ブ ド ウ 球 菌 に つ い て 、lukS/F-PV (PVL) の 検 出 を 行 っ た 。
そ の 結 果 、PVL の 陽 性 率 は MRSA で 13.2% (29 株 )、 MSSA で 0.9% (6 株 ) で あ り 、MRSA の 方 が有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。PVL 陽 性 株 と 陰 性 株 の SCCmec type を 比 較 し た と こ ろ 、 PVL 陽 性 株 の SCCmec は 、 type I (4 株 、 13.8%) と type IV (25 株 、 86.2%) で あ っ た (Fig. 3)。 一 方 、 PVL 陰 性 株 の SCCmec は 、 type I (6 株 、 3.2%)、 type II (23 株 、 12.1%)、 type IV (53 株 、 27.9%)、 type V (91 株 、 47.9%)、 type NT (17 株 、 8.9%) と 多 様 性 を 示 し 、 type V の 割 合 が 最 も 高 か っ た 。SCCmec type IV 株 の 割 合 は 、PVL 陽 性 株 の 方 が 陰 性 株 よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。
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Fig. 3. Comparison of SCCmec types between PVL-positive and -negative MRSA．
*, significantly higher than PVL-negative MRSA (P <0.01)
Fig. 4. Types of skin infections associated with PVL-positive and -negative MRSA and MSSA.
a, significantly higher than PVL-negative isolates (P <0.05) b, significantly higher than PVL-positive isolates (P <0.05)
3. PVL 陽 性 株 に お け る 他 の 病 原 性 因 子 の 検 出
PVL 以 外 の 病 原 性 因 子 の 検 出 を 行 い 、PVL 陽 性 MRSA と PVL 陰 性 MRSA で 比 較 し た (Table 7)。そ の 結 果 、PVL 陽 性 株 で は 伝 染 性 膿 痂 疹 の 原 因 と な る ET 遺 伝 子 は 検 出 さ れ な か っ た が 、 PVL 陰 性 株 の 42.6%か ら eta、 18.9%から
etb が 検 出 さ れ た 。SE 遺 伝 子 は 、PVL 陽 性 株 で は seb の み 伝 染 性 膿 痂 疹 由 来
の 3 株 か ら 検 出 さ れ 、 せ つ ・ よ う 由 来 株 か ら は 各 種 SE 遺 伝子 は 検 出 さ れ な か っ た 。一 方 、PVL 陰 性 株 で は sec、seg、sei の 検 出 率 が 有意 に 高 か っ た (P <0.05)。 ま た 、 tst の検 出 率 も 同 様 に 、 PVL 陰 性 株 の 方 が 有 意 に 高 か っ た が 、
tst を 保 有 す る PVL 陽 性 株 が 1 株 検 出 さ れ た 。フ ィ ブ ロ ネ クチ ン の 結 合 に 関
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が 、fnbB や フ ィ ブ リ ノ ー ゲ ン 結 合 タ ン パ ク を コ ー ド す る fib の 検 出 率 は 、
PVL 陽 性 MRSA の 方 が 有 意 に 高 か っ た ( P < 0 . 0 1 ) 。
Table 7. Comparison of the genetic features between PVL-positive and -negative MRSA
Target gene PVL-positive (%) PVL-negative (%) (n = 29) (n = 190) SCCmec type I 4 (13.8)b 6 (3.2) II 0 (0) 23 (12.1) III 0 (0) 0 (0) IV 25 (86.2)a 53 (27.9) V 0 (0) 91 (47.9) NT 0 (0) 17 (8.9) Virulence gene eta 0 (0) 81 (42.6)c etb 0 (0) 36 (18.9)d etd 0 (0) 1 (0.5) sea 0 (0) 4 (2.1) seb 3 (10.3) 37 (19.5) sec 0 (0) 35 (18.4)d sed 0 (0) 1 (0.5) see 0 (0) 0 (0) seg 0 (0) 81 (42.6)c seh 0 (0) 3 (1.6) sei 0 (0) 79 (41.6)c sej 0 (0) 2 (1.1) tst 1 (3.4) 34 (17.9)d fib 29 (100)a 135 (71.1) fnbA 29 (100) 189 (99.5) fnbB 26 (89.7)a 84 (44.2)
Antimicrobial resistance gene
ermA 0 (0) 44 (23.2)c
ermC 4 (13.8) 79 (41.6)c
msrA/B 11 (37.9)a 5 (2.6)
mphC 11 (37.9)a 2 (1.1)
aacA-aphD 5 (17.2) 172 (90.5)c
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4. PVL 陽 性 MRSA の 分 子 疫 学 的 解 析
PVL 陽 性 MRSA の 遺 伝 学 的 背 景 を 解 析 す る た め 、PFGE、MLST、ACME の 検 出 を 行 っ た (Fig. 5)。PFGE 解 析 の 結 果 、PVL 陽 性 MRSA は 5 つ の pulsotype (A~E) に 分 類 さ れ た 。 Pulsotype 毎 に 分 離 場 所 に 特 徴 が 見 ら れ 、 pulsotype A、 B の 株 は 、 全 て 沖 縄 の 石 垣 島 の 患 者 か ら 分 離 さ れ て い た 。 一 方 、 pulsotype C の 株 は 、複 数 の 県 (青 森 、千 葉 、神 奈 川 、香 川 ) か ら 分 離 さ れ て い た 。Pulsotype D、 E の 株 は い ず れも 香 川 か ら 分 離 さ れ て い た 。こ れ ら の 菌株 の MLST 解 析 を 行 っ た と こ ろ 、pulsotype A、B、C に 属 す る 菌 株 の ほ と ん ど が ST8 で あ り 、 pulsotype D、E に 属 す る 菌 株 は 全 て ST59 で あ っ た 。本 研 究 で 見 出 し た ST3276 (TPS3432) と ST3277 (TPS3517、 TPS3892) は 、 そ れ ぞ れ aroE と yqiL の 1 allele の み が 異 な る ST8 の single locus variants で あ り 、pulsotype A、B、C の 株 は す べ て CC8 であ っ た 。 ACME は pulsotype C に 属 す る 菌 株 の み か ら 検 出 さ れ 、全 て が type I で あ っ た 。USA300 の 参 照 株 で あ る JCSC6774 は 、pulsotype C に 属 し て い る た め 、 こ れ ら の 株 は USA300 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ こ で 、pulsotype A、B、C の 株 の う ち 、SCCmec type IV の 株 に つ い て 、SCCmec の サ ブ タ イ プ を 決 定 し た 。そ の 結 果 、pulsotype A、B の 株 は 全 て 、SCCmec type IVc で あ っ た 。一 方 、pulsotype C の SCCmec type IV の 株 で は 、い ず れ も type IVa で あ っ た 。そ れ ぞ れ の pulsotype に 属 す る 菌 株 が 関 与 し た 疾 患 は 明 確 に 異 な っ て お り 、pulsotype A、B、C に 属 す る 菌 株 は 、1 株 を 除く 全 て が せ つ・よ う な ど 深 在 性 皮 膚 感 染 症 由 来 で あ っ た 。さ ら に 、pulsotype A、B、C に 属 す る 菌 株 は 、全 て fnbB を 保 有 し て い た 。一 方 、pulsotype D、E に 属 す る 菌 株 は 、 い ず れ も 表 在 性 皮 膚 感 染 症 で あ る 伝 染 性 膿 痂 疹 由 来 で あ り 、 他 の PVL 保有 株 に は 認 め ら れ な か っ た seb を 保 有 し て い た 。以 上 の 結 果 は、本 研 究 で 見 出
し た pulsotype A、B に 属 す る PVL 陽 性 の 沖 縄 由 来 株 は 、USA300 と 類 似 し て い る も の の 、異 な る ク ロ ー ン で あ る こ と を 示 し て い る 。こ れ ら 、沖 縄 由 来 株 は 、SCCmec type IVc お よ び ACME 陰 性 で あ る 点 か ら 、 南 米 で 流 行 が 見 ら れ る USA300-Latin American Variant (USA300-LV) 38-41)で あ る 可 能 性 が 考 え ら れ
た 。
5. PVL 陽 性 MRSA の 各 種 抗 菌 薬 感 受 性 と 薬 剤 耐 性 遺 伝 子 の 保 有 率
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し た が っ て 、PVL 陽 性 MRSA の 抗 菌 薬 感 受 性 は 、 ク ロ ー ン 毎 に 異 な る こ と が 明 ら か と な っ た 。 一 方 で 、 全 て の PVL 陽 性 株 は 、 minocycline お よ び 抗 MRSA 薬 で あ る arbekacin、 vancomycin に 感 受 性 を 示 し た 。
次 に 、macrolides お よ び aminoglycosides 耐 性 遺 伝 子 の 検 出 を 行 っ た (Table 7)。Maclorides 耐 性 遺 伝 子 で あ る msrA/B お よ び mphC の 保 有 率 は 、PVL 陽性 株 の 方 が 、陰 性 株 よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。一 方 で 、ermA お よ び ermC の 保 有 率 は 、PVL 陰 性 株 の 方 が 陽 性 株 よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。 ま た 、aminoglycosides 耐 性 遺 伝 子 で あ る aacA-aphD の 保 有 率 は 、PVL 陰 性 株 の 方 が 陽 性 株 よ り も 高 か っ た 。 PCR の 結 果 と PFGE 解 析 の 結 果 を 照 ら し 合 わ せ る と 、 全 て の USA300 が
msrA/B お よ び mphC を 保 有 し て い た (Fig. 5)。一 方 で 、全 て の ST59 株 が aacA-aphD を 保 有 し て い た 。
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Table 8. Comparison of antimicrobial susceptibility between PVL-positive and -negative MRSA clones
MIC unit, µg/mL
MIC50/MIC90, the values indicate the MICs that inhibit the growth of 50%/90% of the strains: R, rate of resistant strains.
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【 考 察 】
本 章 で は 、 市 中 の 皮 膚 科 ク リ ニ ッ ク の 外 来 患 者 か ら 得 ら れ た S. aureus を 対 象 と し て 、PVL 陽 性 MRSA の 流 行 状況 と そ の 分 子 疫 学 的 特 徴 を 解 析 し た 。 PVL 陽 性 MRSA の 分 離 率 は 、対 象 と し た 2013~2014 年 の 2 年 間 で は 、13.2% で あ り 、2008~2009 年 の 全 国 の 医 療 機 関 を 対 象 と し た 過 去 の 研 究 (0.7%) 66) よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。 し た が っ て 、 本 邦 の 市 中 に お い て PVL 陽 性 MRSA が 増 加 して い る こ と が 明 ら か と な っ た 。PVL 陽 性 株 は 、MSSA よ り も MRSA の 方 が 多く 、PVL 陰 性 株 よ り も 重 症 度 の 高 い 疾 患 由 来 株 の 割 合 が 高 か っ た 。 さ ら に 、PVL 陽 性 MRSA が 分 離 さ れ た 患 者 の 平 均 年 齢 (30.6 歳 ) は 、PVL 陰 性 MRSA が 分 離 さ れ た 患 者 の 平 均 年 齢 (9.1 歳 ) よ り も 高 か っ た 。 こ れ ら の デ ー タ は 、PVL 陽 性 MRSA は 、免 疫 力 が 高 い 成 人 に 対 し て も 、重 症 感 染 症 を 引 き 起 こ す 病 原 性 を 有 し て い る こ と を 示 し て い る 。 分 子 疫 学 的 解 析 の 結 果 、USA300 は 本 邦の 広 い 範 囲 に 分 布 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。し か し 、同 一 pulsotype の 中 に 、USA300 と は 異 な る SCCmec type I に 分 類 さ れ る 株 が 4 株 認 め ら れ 、 こ れ ま で に 報 告 の な い ク ロ ー ン で あ っ た 。Pulsotype A、B の 株 は 全 て 沖 縄 由 来 株 で あ っ た 。こ れ ら の 株 は ST8 で あ り 、fib お よ び fnbB を 保 有 し て い る点 で USA300 と 類 似し て い た 。 一 方 、ACME を 保 有 し て い な い 点 、 お よ び SCCmec type IVc で あ る 点 で USA300 と 異 な っ て い た 。 こ れ ら の 結 果 よ り 、pulsotype A、 B の 株 は USA300 と 遺 伝 学 的 に 近 縁 で あ る USA300-LV で あ る こ と が 考 え ら れ た 38-40)。こ の 株 は 、南 米
で 2005 年 に 初 め て 報 告 さ れ た 株 で 、 急 速 に そ の 流 行 範 囲 を 拡 大 さ せ た 株 で あ る 。2013 年 、北 海道 の 病 院 に お い て 、こ れ と 類 似 し た 特 徴 を 持 つ 株 が 1 株 (SA1725) 分 離 さ れ て い る が 、 USA300-LV と し て の 言 及 は 本 研 究 が 国 内 で 初 で あ る 80)。
一 方 、pulsotype D と E の 3 株 は 、 CC59-IV の 株 で あ り 、 pulsotype A、 B、 C の 株 と は PFGE パ タ ー ン も 大 き く 異 な っ て い た 。ま た 、い ず れ も fib、fnbB は 保 有 し て お ら ず 、seb を 保 有 し 、表 在 性 皮 膚 感 染 症 の 伝 染 性 膿 痂 疹 か ら分
離 さ れ て い る 点 で も 他 の pulsotype の 株 と は 異 な っ て い た 。 こ れ ら の 特 徴 か ら 、pulsotype D、 E の 株 は 、 ア ジ ア で 分 離 頻 度 が 高 い 市 中 型 MRSA で あ り 、 本 邦 で も 過 去 に 分 離 例 が あ る Taiwan clone で あ る と 考 え ら れ た 81, 82)。
USA300 は 、他 の PVL 陽 性 株 よ り も clarithromycin と levofloxacin に 高 い 耐 性 率 を 示 し た 。現 在 、他 の 国 で 報 告 さ れ て い る USA300 は 、薬 剤 耐 性 プ ラス ミ ド の 獲 得 に よ り macrolides や aminoglycosides 耐 性 を 獲 得 し て い る 39)。 本
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【 材 料 ・ 方 法 】
1 . 使 用 菌 株 2 0 11 年 か ら 2 0 1 5 年 に 、東 京 都 の 多 摩 地 域 に 位 置 す る 9 つ の 総 合 病 院 ( A ~ H ) の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ た M R S A 3 , 4 3 3 株 を 使 用 し た 。 M R S A の 同 定 は 、 第 1 章 - 【 材 料 ・ 方 法 】 - 3 に 記 し た 方 法 に よ り 行 っ た 。 ま た 、 各 種 参 照 株 と し て 、 第 1 章 - 【 材 料 ・ 方 法 】 - 1 に 記 し た 菌 株 を 用 い た 。 2 . 使 用 培 地 お よ び 培 養 条 件 第 1 章 - 【 材 料 ・ 方 法 】 - 2 に 記 し た 方 法 に よ り 行 っ た 。 3 . P C R 法 に よ る 各 種 遺 伝 子 の 検 出 お よ び S C C m e c t y p i n g 第 1 章 -【 材 料・方 法 】- 4 に 記 し た 方 法 を 用 い て 行 っ た 。さ ら に 、 m a c r o l i d e s 耐 性 遺 伝 子 で あ る e r m B 、 a m i n o g l y c o s i d e s 耐 性 遺 伝 子 で あ る a p h ( 3 ’ ) - I I I お よ び a a d ( 4 ’ , 4 ’’ ) コ ラ ー ゲ ン 結 合 タ ン パ ク 遺 伝 子 c n a 、骨 シ ア ル タ ン パ ク 結 合 タ ン パ ク 遺 伝 子 b b p を P C R 法 で 検 出 す る た め に 、 特 異 的 な プ ラ イ マ ー を 使 用 し た ( Ta b l e 9 ) 。 こ れ ら の 遺 伝 子 は 、9 5 ℃ 、2 分 間 で D N A を 変 性 さ せ た 後 、9 5 ℃ 、3 0 秒 間 、 5 5 ℃ 、 3 0 秒 間 、 7 2 ℃ 、 3 0 秒 間 を 3 0 サ イ ク ル 行 い 、 最 終 伸 長 反 応 と し て 、 7 2 ℃ 、 5 分 間 の P C R に て 増 幅 さ せ た 。Table 9. Oligonucleotide primers for detection of target genes
Taget gene Primer Primer sequence (5’ to 3’) Product length
ermB ermB-F CCGTTTACGAAATTGGAACAGGTAAAGGGC 359 bp
ermB-R GAATCGAGACTTGAGTGTGC
aph(3’)-III aph(3’)-III-F CTGATCGAAAAATACCGCTGC 268 bp
aph(3’)-III-R TCATACTCTTCCGAGCAAAGG
aad(4’, 4’’) aad(4’, 4’’)-F CTGCTAAATCGGTAGAAGC 172 bp
aad(4’, 4’’)-R CTGCTAAATCGGTAGAAGC
cna cna-F GTCAAGCAGTTATTAACACCAGAC 423 bp
cna-R AATCAGTAATTGCACTTTGTCCACTG
bbp bbp-F AACTACATCTAGTACTCAACAACAG 574 bp
27 4 . P F G E お よ び M L S T に よ る 分 子 疫 学 的 解 析 第 １ 章- 【 材 料 ・ 方 法 】 - 5 ・ 6 に 記 し た 方 法 を 用 い て 行 っ た 。 5 . P V L v a r i a n t の 解 析 P V L v a r i a n t を 同 定 す る た め に 、 l u k S / F - P V の P C R お よ び 塩 基 配 列 の 解 析 を 行 っ た 。遺 伝 子 の 増 幅 に は 、Ta b l e 1 0 に 記 し た プ ラ イ マ ー を 使 用 し た 。プ ラ イ マ ー の 合 成 は 、H o k k a i d o S y s t e m S c i e n c e 社 に 依 頼 し た 。P C R に よ る 増 幅 反 応 は 、 9 8 ℃ 、 3 0 秒 間 で D N A の 変 性 を 行 っ た 後 、9 8 ℃ 、 1 0 秒 間 、 5 4 ℃ 、 3 0 秒 間 、 7 2 ℃ 、 1 分 2 0 秒 間 を 3 0 サ イ ク ル 行 っ た 。最 終 伸 長 反 応 と し て 7 2 ℃ 、2 分 間 行 っ た 。D N A シ ー ケ ン ス は 第 1 章 -【 材 料・方 法 】- 6 に 記 し た 方 法 を 用 い て 行 っ た 。 過 去 の 報 告 と 同 様 に 、 L u k S - P V の 1 7 6 番 目 の ア ミ ノ 酸 が h i s t i d i n e で あ る t y p e を H v a r i a n t 、 a r g i n i n e で あ る t y p e を R v a r i a n t と し た 3 5 )。
Table 10. Oligonucleotide primers to identify PVL variants
Primer name Primer sequence (5’ to 3’) Orientation
PVL-seqF1 AGATATTTTAAACTCGGTAAATCTTT Forward
PVL-seqF2 TAATGGTTCATTTAATTATTCAAAAAC Forward
PVL-seqF3 GTAAGTGAGAAAAAGGTTGATGATA Forward
PVL-seqF4 TTAGGCTCAAGACAAAGCAAC Forward
PVL-seqR1 CTGAAAAAATAACCACGTCAA Reverse
PVL-seqR2 GTCTCTGAAAAAGATTTTGAACC Reverse
PVL-seqR3 TAATTTCTGTTTACAAATGCGTT Reverse
PVL-seqR4 ACCAATATTGTATTGGAAAGGC Reverse
29
【 結 果 】
1 . P V L 陽 性 M R S A の 分 離 率 3,433 株 の MRSA に対 し 、PVL 遺 伝 子 の 検 出 を 行 っ た 結 果 、5 年 間 で 64 株 (1.9%) が PVL 陽 性 株 で あ り 、調 査 し た 9 つ の 病 院 全 て か ら 検 出 さ れ た (Table 11)。PVL 陽 性 株 の 検 出 率 は 年 々 増 加 し て お り 、2014 年 お よ び 2015 年 の 検 出 率 は 、2011 年 よ り も 有 意 に 高 か っ た (P <0.01)。 PVL 陽 性 株 が 検 出 さ れ た 診 療 科 は 、皮 膚 科 が 最 も 多 く 29.7%、つ い で 救 命 救 急 が 9.4%、外 科 お よ び 呼 吸 器 科 が 4.7%で あ っ た 。検 体 の 由 来 部 位 は 、多 い 順 に 膿 (37.5%)、喀 痰 (18.8%)、 皮 膚 表 面 (12.5%)、 血 液 (3.1%) で あ っ た (Fig. 6)。Table 11. Annual transition of PVL-positive MRSA isolates
*, significantly higher than 2011 (P <0.05); **, significantly higher than 2011 (P <0.01)
Fig. 6. Comparison of clinical department and specimen material associated with patients with PVL-positive MRSA infection
Specimen material Clinical department
Hospital
Hospital category PVL-positive MRSA / total MRSA (%) of isolates in year
30
2 . P V L 陽 性 M R S A の 分 子 疫 学 的 解 析
PVL 陽 性 MRSA 64 株 に つ い て 、 SCCmec typing、 MLST、 PFGE、 各 種 遺 伝 子 の 検 出 、PVL variants の 同 定 を 行 っ た。MLST お よ び PFGE の 結 果 、7 種 の ク ロ ー ン の 存 在 が 明 ら か と な っ た (Fig. 7, Table 12)。
Pulsotype A に 分 類 さ れ る 株 は 42 株 (65.6%) 存 在 し 、 9 病 院 中 8 病 院 で 検 出 さ れ た 。Pulsotype A の 菌 株 の 遺 伝 子 型 は 、CC 8 (ST8、ST3601、ST3606) で あ っ た 。こ れ ら の 株 は 、全 て type I の ACME を 保 有 し て おり 、参 照 株 で あ る USA300 (JCSC6774) と 同 一 の PFGE パ タ ー ン を 示 し た 。し た が っ て 、pulsotype A の 菌 株 は 全 て USA300 で あ り 、 病 院 内 で 分 離 さ れ る PVL 陽 性 MRSA の 主 要 な 遺 伝 子 型 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。PVL 陽 性 株 の う ち 、USA300 が 占 め る 割 合 は 、 年 々 増 加 し て い た (Fig. 8)。 USA300 の 中 に は 、 SCCmec type I の 株 が 9 株 存 在 し た 。さ ら に 、USA300 と 同 じ ST8 で あ るに も か か わ ら ず 、 USA300 と は 異 な る PFGE パ タ ー ン を 示 す 株 が 1 株 (OME51) 存 在 し た 。こ の 菌 株 は 、 第 1 章 の 沖 縄 由 来 の USA300 類 似 株 と 同 一 の pulsotype に 分 類 さ れ た (Fig. 9)。 し た が っ て 、 こ の 株 は 、 沖 縄 由 来 株 と 同 一 の ク ロ ー ン で ある こ と が 明 ら か と な っ た 。
Pulsotype B に 分 類 さ れ た 3 株は ST772 (CC1) で あ り 、 イ ン ド を 中 心 に 世 界 各 地 で の 流 行 が 報 告 さ れ て い る Bengal-Bay clone で あ っ た 89, 90)。Pulsotype
C に 分 類 さ れ た 4 株の 遺 伝 子 型 は ST22 で あ り 、 ヨ ー ロ ッ パ で 流 行 が 認 め ら れ て い る E-MRSA15 で あ る と 考 え ら れ た 91, 92)。Pulsotype は 構 成 し て い ない が 、ST80 株 が 1 株 検 出 さ れ た 。 こ の 株 は 、 遺 伝 子 型 か ら ヨ ー ロ ッ パ で の 分 離 が 報 告 さ れ て い る ク ロ ー ン で あ る と 考 え ら れ た 93, 94)。 こ の ク ロ ー ン の 分 離 例 は 、本 邦 に お い て 初 で あ る 。CC59 の 株 も 3 株 検 出 さ れ 、Taiwan clone で あ る と 考 え ら れ た 81, 82)。Pulsotype D は CC30 (ST30、ST642、ST3413、ST3607、 ST3618) の 株 で 構 成さ れ て お り 、 USA300 に 次 い で 分 離 数 の 多 い ク ロ ー ン で あ っ た 。 こ れ ら は 、 そ の 遺 伝 子 型 か ら 、 本 邦 で も 分 離 報 告 の 多 い Southwest Pacific clone で あ る と 考 え ら れ た 7, 95)。 そ れ ぞ れ の ク ロ ー ン で 、保 有 す る 病 原 性 因 子 に も 違 い が 見 ら れ た 。USA300 や USA300 類 似 株 、 E-MRSA15 で は 、 高 頻 度 で fnbB や fib を 保 有 し て い た 。 一 方 、CC30 の 株 は 、他 の ク ロ ー ン で は 見 ら れ な か っ た bbp を 保 有 し て い た 。 Bengal-Bay clone は sea や sec を 保 有 し て い る 点 で 他 の ク ロ ー ン と は 異 な っ て い た 。cna は 、 全 て の ST22 株 、 ST30 株 、 ST772 株 で 認 めら れ た 。
31
Fig. 7. Molecular epidemiological analysis of PVL-positive MRSA isolates.
-, No data. The colored box indicates positive for the genes and antimicrobial resistance. R, arginine variant; H, histidine variant; LVFX r, levofloxacin resistance; CAM r,
32 Table 12. Characteristics of PVL-positive MRSA clones in this study
33
Fig. 8. Annual transition of PVL-positive MRSA and USA300.
Fig. 9. Comparison of PFGE patterns in USA300-Like strain (OME51) and Okinawa USA300-Like strains (TPS3156 and TPS3298).
34 3 . P V L 陽 性 M R S A の 各 種 抗 菌 薬 感 受 性 PVL 陽 性 MRSA の 薬 剤 耐 性 率 の 年 次 推 移 を 調 査 し た (Fig. 10)。そ の 結 果 、 levofloxacin お よ び gentamicin の 耐 性 率 が 年 々 上 昇 し て い た 。 特 に 、 levofloxacin の 耐 性 率 は 、 2011 年 に は 40.0%で あ っ た の に 対 し 、 2015 年 で は 100%を 示 し た (P <0.05)。一 方 、clarithromycin の 耐 性 率 は 、2011 年 で は 80% で あ っ た が 、2015 年 で は 47.1%ま で 減 少 し て い た 。 同 じ macrolides で あ る spiramicin の 耐 性 率 も 20.0%か ら 5.9%ま で 減 少 し て い た 。Minocycline お よ び 抗 MRSA 薬 の 耐 性株 は 認 め ら れ な か っ た 。 PVL 陽 性 株 の 薬 剤 耐 性 率 を ク ロ ー ン 毎 に 比 較 し た と こ ろ (Fig. 7、Table 13)、 USA300 は levofloxacin、clarithromycin、gentamicin の 耐 性 率 が そ れ ぞ れ 97.6%、 73.8% 、 64.3% と 高 く 、 maclorides 耐 性 遺 伝 子 で あ る msrA/B や ermC 、 aminoglycosides 耐 性 遺 伝 子 で あ る aacA-aphD を 保 有 し て い た (Fig. 7) 。 USA300 類 似 株 は 、 β-lactams 以 外 の 全 て の 抗 菌 薬 に 感 受 性 を 示 し て お り 、 USA300 と は 異 な る 薬 剤 感 性 を 示 し た 。ST22 の EMRSA-15 は 、USA300 と 同 様 に 、levofloxacin、clarithromycin、gentamicin で 耐 性 株 が 認 め ら れ た 。ST30 の Southwest pacific clone は 、多 く の 薬 剤 に 感 受 性 を 示 し た 。ST59 の 株 で は 、 clarithromycin お よ び spiramycin 耐 性 株 が 認 め ら れ た 。 ST772 の Bengal-Bay clone で は 、 3 株 全 て が levofloxacin およ び gentamicin に 耐 性 を 示 し た 。
35
Fig. 10. Annual transition of antimicrobial resistance rates (%) of PVL-positive MRSA in this study. ND, not detected
36
Table 13. Comparison of antimicrobial susceptibility of PVL-positive MRSA clones
MIC unit: µg/mL
MIC50/MIC90, the values indicate the MICs that inhibit the growth of 50%/90% of the strains: R, rate of resistant strains.
3
37
【 考 察 】
本 章 で は 、東 京 都 多 摩 地 区 に 位 置 す る 9 つ の 総 合 病 院 の 入 院 患 者 か ら 得 ら れ た MRSA 3,433 株 を 用 い て 、PVL の 陽 性 率 と そ の 推 移 、PVL 陽 性 株 の 分 子 疫 学 的 特 徴 を 明 ら か に し た 。 こ れ ま で 、 本 邦 に お け る PVL 陽 性 MRSA を 対 象 と し た 研 究は 、 単 一 の 総 合 病 院 の 外 来 患 者 に 関 す る も の が 多 く 、 複 数 の 病 院 の 入 院 患 者 を 対 象 と し 、 長 期 に 渡 っ て 解 析 し た の は 本 研 究 が 初 め て で あ る 。2011 年 の PVL 陽 性 MRSA の 検 出 率 は 、わ ず か 0.6%で あ っ た が 、2015 年 で は 約 5 倍 の 3.1%と 有 意 に 増 加 し て い た 。 こ れ は 、 第 1 章 に お い て 明 ら か に な っ た 市 中 で の PVL 陽 性株 の 増 加 に 伴 っ て 、院 内 に 流 入 す る PVL 陽 性 株 が 増 加 し た た め と 考 え ら れ た 。 USA300 は 9 病 院中 8 病 院 で 分 離 され 、 本 邦 の 入 院 患 者 か ら 分 離 さ れ る PVL 陽 性 MRSA に お い て 最 も 主 流 で あ る こ と が 明 ら か と な っ た 。 そ の 他 、 イ ン ド 等 で の 報 告 が 多 い ST772-V の Bengal-Bay clone や ヨ ー ロ ッ パ で の 分 離 が 多 い ST22-IV の EMRSA-15 clone、 太 平 洋 地 域 で の 流 行 が 報 告 さ れ て い る ST30-IV の Southwest Pacific clone (USA1100)、 ST59-IV の Taiwan clone も 検 出 さ れ た 2, 37, 81, 82, 89-95)。Bengal-Bay clone や EMRSA-15 は 、本 邦 で は こ れ まで に あ ま り 報 告 の な い 稀 な ク ロ ー ン で あ る 。 本 研 究 で 1 株 見 出 さ れ た ST80 株 は 、本 邦 で の 初 め て の 分 離 例 で あ っ た 。ST80 clone は 地 中 海 地 方 で 流 行 し て い る ク ロ ー ン で あ り 、近 年 、ア ジ ア や 中 東 で も 検 出 頻 度 が 増 加 し て い る 7, 96)。現 在 、世 界 中 に お い て 、MRSA の 海 外か ら の 流 入 が 問 題 と な っ て い る 97)。 本 研 究 の デ ー タ は 、 本 邦 に お い て も USA300 を 含 む 様 々 な PVL 陽 性 株 が 海 外 か ら 流 入 し 、病 院 内 に 伝 播 し て い る 可 能 性 を 示 し て い る 。ま た 、本 研 究 で 分 離 さ れ た ST8 の PVL 陽 性 MRSA の 中 に 、USA300 類 似 株 が 1 株 (OME51) 検 出 さ れ た 。こ の 株 は 、第 1 章 に お け る 沖 縄 由 来 USA300 類 似 株 と 同 一 の ク ロ ー ン で あ っ た 。 し た が っ て 、 こ の 株 も USA300-LV で あ る と 考 え ら れ 、 本 邦 に USA300-LV が 広 く 分 布 し て い る こ と が 示 唆 さ れ た 。 さ ら に 、 第 1 章 に お い て も 認 め ら れ た SCCmec type I に 分 類 さ れ る USA300 も 9 株 検 出 さ れ た 。
各 種 病 原 性 因 子 の 保 有 パ タ ー ン は 、各 ク ロ ー ン に よ り 大 き く 異 な っ て い た 。 皮 膚 定 着 性 に 関 与 す る ACME は 、 USA300 の み が 保 有 し て い た 。 fnbB や fib は 、 第 1 章 と 同 様 に USA300 が 高 頻 度 で 保 有 し て い た 他 、 ST22 株 で も 保 有 が 認 め ら れ た 。一 方 で 、bone sialoprotein-binding protein を コ ー ド し 骨 表 面 へ の 接 着 に 関 与 す る bbp は 、 ST30 が 高 頻度 に 保 有 し て い た 。 コ ラ ー ゲ ン へ の
結 合 に 関 与 す る cna は 、 全 て の ST22 株 、 ST30 株 、 ST772 株 で 認 め ら れ た 。
39
第
3 章
本邦特有の
PVL 陽性 MRSA のゲノム解析
【 背 景 】
第 1 章 に お い て 、沖 縄 由 来 MRSA の中 に USA300 と 類 似し た 特 徴 を 持 つ PVL 陽 性 株 を 15 株 見 出 し た 。 ま た 、 第 2 章 に お い て も 、第 1 章 の 沖 縄 由 来 株 と 同 様 の 特 徴 を 持 つ USA300 類 似 株が 1 株 認 め ら れ た 。USA300 は 、SCCmec IVa で あ る の に 対 し 、USA300 類 似 株 は type IVc で あ る 。ま た 、USA300 類 似 株 で は 、USA300 に 特 徴 的 な 病 原 性 因 子 で あ る ACME は 認め ら れ な か っ た 。 こ れ ら の 特 徴 か ら 、USA300 類 似 株 は USA300-LV で あ る こ と が 考 え ら れ た38-41)。USA300-LV は 、 近 年 の ゲ ノ ム 解 析 よ り 、 USA300 と 共 通 し た 祖 先
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【 材 料 ・ 方 法 】
1 . 使 用 菌 株 第 1 章 と 第 2 章 に おい て 分 離 し た PVL 陽 性 、 ST8-IVc の USA300 類 似 株 、 計 16 株 を 使 用 し た 。 そ れ ら の う ち 、 TPS3156 株 に つ い て、 ゲ ノ ム シ ー ケ ン ス を 行 っ た 。ま た 、第 1 章 、第 2 章 に お い て 、pulsotype は USA300 と 同 一 だ が 、SCCmec が type I と 判 定 さ れ た 株 (ΨUSA300) 計 13 株 を 使 用 し た 。参 照 ゲ ノ ム と し て 、USA300_FPR3757 (Accession No.CP000255)、USA300_TCH1516 (NC_010079.1)、USA300-LV_CA12 (CP007672)、USA300-LV_M121 (CP007670)、 USA300-EB_CA15 (CP007674) 、 USA300-EB_HUV05 (CP007676) 、 N315 (BA000018)、 MW2 (NC_003923.1)、 Rosenbach 1884_DSM20231 (CP011526.1) を 使 用 し た 。 2 . 使 用 培 地 お よ び 培 養 条 件 第 1 章 - 【 材 料 ・ 方 法 】 - 2 に 記 し た 方 法 に よ り 行 っ た 。 3 . ゲ ノ ム D N A の 抽 出MRSA の ゲ ノ ム DNA は 、 DNeasy® Blood & Tissue Kit (Qiagen) を 用 い て 抽
出 し た 。TSA で 一 晩 培 養 し た S. aureus を 、TSB 10 mL で 一 晩 振 盪 培 養 し た 。 さ ら に 、TSB 10 mL に 培 養 液 50 μL を 加 え 、 O.D at 600 nm=1.0 ま で 振 盪 培 養 し た 。 そ の 培 養 液 2 mL を 遠 心 分 離 に て 集 菌 し 、 上 清 を 除 去 し た 。 TE buffer 150 μL、 10 mg/mL RNase (FUJIFILM Wako Pure Chemical) 10 μL を 添 加 し 懸 濁 し た 後 、1 mg/mL の lysostaphin を 30 μL 加 え 、 37℃、 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。25 µL の proteinase K お よ び 200 µL の Buffer AL を 加 え 、 ミ キ サ ー に よ り 攪 拌 し 、56℃で 30 分 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し た 。 200 µL の ethanol を 加 え 、 ミ キ サ ー に よ り 混 和 し 、DNeasy® Mini Spin Colum に 移し 、 6,000 × g で
1 分 間 遠 心 操 作 し た 。 さ ら に 、 Buffer AW1 を 500 µL 添 加 し 、 6,000 × g で 1 分 間 遠 心 操 作 し 、こ れ を 2 回 繰 り 返 し た 。Buffer AW2 も 同 様 に 行 っ た 。3 分 間 の 遠 心 操 作 に て フ ィ ル タ ー を 乾 燥 さ せ た 後 、Nuclease-Free water (Promega) 100 µL で ゲ ノ ム DNA を 溶 解 さ せ た 。
4 . 全 ゲ ノ ム シ ー ケ ン ス
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5 . ゲ ノ ム 解 析
ゲ ノ ム の 解 析 用 ソ フ ト と し て 、Geneious Prime ver. 2019.2.3 (Biomatters) を 使 用 し た 。 ゲ ノ ム を 用 い た 菌 株 の 系 統 解 析 に は 、Type (Strain) Genome Server (TYGS) を 使 用 し た 99)。 ゲ ノ ム DNA の配 列 比 較 を 行 う マ ル チ プ ル ア ラ イ メ ン ト プ ロ グ ラ ム と し て MUSCLE を 使 用 し た 100)。ま た 、遺 伝 子 の 挿 入・脱 離・ 再 構 築 を 解 析 す る プ ロ グ ラ ム と し て progressiveMauve を 使 用 し た 101)。 6 . I C E 6 0 1 3 の 検 出 全 て の USA300 類 似 株 が TPS3156 と 同 一 ゲ ノ ム 位 置 に ICE6013 を 保 有 し て い る か を 確 認 す る た め に 、ICE6013 の 両 端 の 外 側 と 内 側 に プ ラ イ マ ー を 設 計 し 、PCR を 行 っ た (Table 14、 Fig. 11)。 PCR に よ る 増 幅 がで き た 場 合 を 、 同 一 位 置 に 挿 入 さ れ て い る と 判 断 し た 。プ ラ イ マ ー の 合 成 は Hokkaido system science 社 に 依 頼 し た 。PCR は 、95℃、2 分 間 で DNA を 変 性 さ せ た 後 、95℃、 30 秒 間 、57℃、30 秒 間 、72、45 秒 間 を 30 サ イ ク ル 行 っ た 。ま た 、最 終 伸 長 反 応 と し て 、72℃、 5 分 間 行 っ た 。
Table 14. Olignucleotide primers for detection of insertion site of ICE6013
Primer Primer sequence (5’ to 3’) Primer position Product
on TPS3156 genome length
ICE6013-5F ATCCAACACGCCCTTTTTAG 2318472-2318491 642 bp
ICE6013-5R GCTGTTAAACAAATTAATGCACG 2319092-2319114
ICE6013-3F CAAACCTATCGGTTCATCAC 2331754-2331773 670 bp
ICE6013-3R ACACGAGGACTTACCCAAAA 2332405-2332424
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7. ΨUSA300 における ccrB2 のシーケンス解析
ccrB2 の 塩 基 配 列 を 確 認 す る た め に 、 プ ラ イ マ ー ccrB-seq を 設 計 し た
(Table 15)。 ccrB-seq と SCCmec typing で 用 い ら れ る 既 存 の プ ラ イ マ ー α2 を 用 い て 、PCR の 増幅 を 行 っ た の ち 、 DNA シ ー ケ ン ス に よ る 塩 基 配 列 の 解 析 を 行 っ た 。PCR の 増幅 、PCR 産 物 の 精 製お よ び DNA シ ー ケ ン ス に よ る 塩 基 配 列 の 解 析 は 、 第 1 章 -【 材 料 ・ 方 法 】 -6 に 記 載 し た 方 法 で行 っ た 。 PCR の 増 幅 は 、98℃、30 秒 間 で DNA を 変 性 さ せ た 後 、98℃、10 秒 間 、55℃、30 秒 間 、72℃、 30 秒 間 を 30 サ イ ク ル 行 い、 最 終 伸 長 反 応 と し て 72℃、 5 分 間 行 っ た 。
Table 15. Oligonucleotide primers for DNA sequence of ccrB2
Primer Prime sequence (5’ to 3’) Product length (bp)
α2 TAAAGGCATCAATGCACAAACACT 1,091*
ccrB-seq TGACATATCCTTTGTGATTCAATG
*This length shows the case when a strain having ccrB2 without any deletion is used.
8 . Ψ U S A 3 0 0 の S C C m e c t y p i n g
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【 結 果 】
1. USA300 類似株 (TPS3156) の全ゲノム配列 USA300 類似株の遺伝学的背景を明らかにするために、USA300 類似株である TPS3156 の全ゲノム配列を明らかにした。その結果、TPS3156 は、2,852,412 bp、GC 含量が32.8%の染色体を保有する MRSA であることが明らかとなった。また、25,058 bp、GC 含量 28.5%のプラスミドを保有していた。 2. USA300 類似株 (TPS3156) の系統解析 USA300 類似株 (TPS3156) と他のクローンのゲノム間の近縁性を比較するために、 TYGS を用いて系統樹を作成した (Fig. 12)。USA300 類似株は、第 1 章および第 2 章 より、USA300-LV であることが強く疑われたため、参照ゲノムとして、USA300-LV で あるCA12 および M121、USA300 の代表株である FPR3757 および TCH1516、USA300 とUSA300-LV の共通の祖先株である USA300-EB として CA15 および HUV05 を用い た。さらに、TYGS において、参照株として用いられており、最初に分離された S. aureus であるRosenbach1884_DSM20231、ST1-IV の PVL 陽性 MRSA である MW2、PVL 陰 性MRSA として N315 を用いた。上記のゲノムと比較すると、USA300-LV である CA12株および M121 株と同一のクラスターに分類された。したがって、TPS3156 は、
USA300-LV クローンに属することが明らかとなった。
3. USA300 類似株の比較ゲノム解析
TPS3156 における遺伝子の獲得、脱落、再構築などを詳細に解析するために、 progressiveMauve を用いて、既知の参照ゲノムとのマルチプルアライメントを行った (Fig. 13)。その結果、TPS3156 は、CA12 と非常に類似しており、USA300 が特異的に
保有する ACME を持たず、同位置に銅耐性および水銀耐性に関与するとされている
copper and mercury resistance (COMER) を 保 有 し て い た 。 USA300 が 保 有 す る pathogenicity island である SaPI5 を保有していない点においても、CA12 と共通してい た。一方、CA12 には認められない領域 (ICE6013 variant) の存在が明らかとなった。 この領域は、FPR3757 が保有している因子 (ICE6013 variant; ICESauFPR3757) と高い 相同性 (97.5%) を示したが、挿入されているゲノム位置が異なっていた。
また、TPS3156 が保有していたプラスミドを、CA12 が保有していたプラスミド
