11.修正_プレゼン資料（鹿児島大学_池田先生）0711

従来の薬剤探索法では

見出すことができなかった

新規抗

HCV剤グアンファシンの同定

鹿児島大学 大学院医歯学総合研究科

難治ウイルス病態制御研究センター

センター長

池田 正徳

従来技術とその問題点

C型肝炎ウイルス(HCV)に感受性のある唯一動物モデルはチンパン

ジーのみであるが、霊長類であるチンパンジーを使った研究は現在、

倫理的経済的問題からなされていない。

現在、すべての抗

HCV剤は、唯一HCVを高率良く増殖させることが

可能なヒト肝癌細胞由来の

HuH-7

細胞株のみを使って開発されてい

る。

HuH-7細胞株という特殊な細胞内環境でのみの、抗ウイルス活性の

評価を行っていると、

人体では無効な薬剤が過大評価されたり、人

体で有効な薬剤が過小評価されてしまう

可能性がある。

新技術の特徴・従来技術との比較

HuH-7

細胞株とは異なる、ヒト肝癌細胞株である

Li23

細胞株を

第２の

HCV感受性細胞株として樹立し、HuH-7細胞株では見い

だすことができなかった、抗

HCV活性を有するGuanfacineを見

出した。

現在開発されている、

Direct Acting Antivirals (DAAs)は驚異的

な治療成績を示す一方で、

1) ウイルス排除後の肝発癌、

従来技術

(DAAs)の問題点

１

. HuH-7細胞株のみによる評価

2. 薬価が高額で医療経済を圧迫

（１２週間の治療で約７００万円）

3. 薬剤耐性変異を有するHCVの出現

4. ウイルス排除後の肝発癌

5. ウイルス排除後にHBVが再活性化

想定される用途

HuH-7では見出すことのできなかった抗HCV剤の評価が可能

従来の

DAAsに対して耐性を示すHCVに対する薬剤候補

Drug repositioningにより見いだされた薬剤なので安全性が

保証されている

実用化に向けた課題

1. 前臨床試験におけるPOCの取得

1. 化合物の最適化

企業への期待

１．

Guanfacineをリード化合物とする類似化合物の合成

2. 薬剤ライブラリーの提供と、Li２３細胞株を用いた抗HCV剤

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：抗HCV活性を有する薬剤

• 出願番号 ：特願2016-048508

• 出願人

：国立大学法人鹿児島大学、

国立大学法人岡山大学

• 発明者

：池田正徳、武田緑、加藤宣之

A型肝炎ウイルス (HAV: Hepatitis A Virus) B型肝炎ウイルス (HBV: Hepatitis B Virus) C型肝炎ウイルス (HCV: Hepatitis C Virus) D型肝炎ウイルス (HDV: Hepatitis D Virus) E型肝炎ウイルス (HEV: Hepatitis E Virus)

肝炎ウイルスの種類

肝炎ウイルスには５種類ある

これ以外にTTV、HGV（=GBV-C)などが報告されたが現在では肝炎ウイルスからは 除外されている

C

B D

A

E

HBV（HDV）、HCV

慢性肝炎：６ヶ月以上肝臓に肝炎が持続している状態

HBVとHCVの感染者は世界人口の約８％と推定されており、

死に至る最大のウイルス感染症といえる。

慢性肝炎に進展する肝炎ウイルス

C B D

急性肝炎 _慢性肝炎 肝硬変

肝がん 70%

7%/年

HCV感染による肝疾患の疫学

慢性肝炎

肝硬変

肝癌

3.5万人/年

HCVｷｬﾘｱ

200万人

ｱﾙｺｰﾙ、NASHなど

肝不全

消化管出血

1.7万人/年

肝臓に関連した病気で年間5万人以上の方が死亡している

HBVｷｬﾘｱ

110万人

予

防

抗ウイルス療法

ウイルスの排除

PEG: PEG-IFN

RBV: Ribavirin TPV: TelaprevirSPV: Simeprevir

C型肝炎ウイルス治療成績

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 6% 34% 55% 75% 89% 1991 2000 2004 2011 2013

C型肝炎に対するDAA製剤の開発状況

2014 daclatasvir (NS5A) +asunaprevir (NS3) ledipasvir (NS5A) +sofosbuvir (NS5B) ombitasvir (NS5A) +paritaprevir (NS3) 2013 PR: PEG-IFN/RBV PR+simeprevir (NS3) ヤンセンファーマ社 PR+vaniprevir (NS3) MSD社 ブリストル・マイヤーズ社 アッヴィ社 ギリアド・サイエンシズ社 2015 2011 PR+telaprevir (NS3) 田辺三菱社

Sofosbuvir Ledipasvir 1. ハーボニー (2015年9月） NS5B阻害剤 _{NS5A阻害剤} Ombitasvir NS5A阻害剤 NS3/4A阻害剤 Paritaprevir + Ritonavir 2. ヴィキラックス (2015年11月）

C型慢性肝炎に対する新しい経口配合剤

+ +

Development of hepatocellular carcinoma in patients with hepatitis C virus infection who achieved sustained virological response following interferon therapy: A large-scale, long-term cohort study

(Nagaoki Y, Chayama K et al., J Gastroenterol Hepatol, 2015)

・36(3%) of 1094 patients developed HCC after SVR

・The cumurative rates of HCC at 5, 10, and 14 years were 4%, 6% and 12%,

respectively

最近の抗

HCV剤は驚異的な治療成績を達成しているが、

ウイルス排除後の肝発癌が新たな課題となっている

肝発癌予防に対する新たな戦略：

DAA時代のHCV研究の課題

1.SVR後HCC

2.DAA治療におけるHBVの再活性化

HCVとレプリコン

5’UTR Core E1 E2 NS2 NS3 4B NS5A NS5B 3’UTR IRES

構造領域

非構造

(NS)領域

HCV ゲノム RNA（9.6kb）

Hepatitis C Virus: HCV

フラビウイルス科ヘパシウイルス属

1本鎖、プラス鎖RNA

血液を介した感染 HCV感染者 日本：_{200万人以上} 世界：2億人以上 5’UTR ΔC _EMCV IRES 3’UTR NS3 4B NS5A NS5B NeoR

HCVレプリコン

（_{Lohmann et al. Science 1999）}

Con-1株

細胞

核

5’ _3’ 翻訳 5’ _3’ 5’ _3’ 3’ 5’ 3’ 5’ 5’ _3’ 5’ _3’ 5’ _3’ 5’ _3’ 複製

HCVの生活環

粒子形成 放出

RLアッセイシステム

0 1 10 100 0 20 40 60 80 100 120 140 H C V R N A (% ) IFN- (IU/mL) 添加24時間後 (LightCycler PCR) レニラルシフェラーゼ（RL)を発現する全長HCV RNA複製細胞に 薬剤を添加し、24〜72時間後にルシフェラーゼ活性を測定する 0 1 10 100 IFN- (IU/mL)添加24時間後 0 20 40 60 80 100 120 ルシフェラーゼ活性を測定

よ

く

一

致

す

る

全長12 kb RNA HCV HCV 外来性

RLアッセイシステム

RT-PCRによる従来法

5’ _{C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3’} ∆C EMCV IRES NeoR NS4A P7 RL

スタチン剤 高脂血症治療剤 臨床試験（全国） フルバスタチン （EC₅₀; 0.9 mM) 治癒率70%？

OR6アッセイシステムを用いて見出した抗HCV剤候補

生理活性物質

オンコスタチンM IL6ファミリー（肝分化誘導、抗腫瘍効果） 5-HETE アラキドン酸代謝産物

医薬品やサプリメント

論文発表 本来の薬効や機能 治療剤としての現状 Hepatology (‘06) テプレノン 抗潰瘍剤 臨床試験（岡山） ミゾリビン リウマチ治療剤 ビタミンD2 栄養補助剤 Liver Int (‘11) BBRC (‘05) AAC (‘07) 国内特許出願 FEBS Lett (‘09) ハイドロキシウレア Arch Virol (‘10) 臨床試験（横浜） Antiviral Ther (‘10) 国内外特許出願 (EC₅₀; 0.7 ng/ml) (EC₅₀; 5 mg/ml) （EC₅₀; 60 mM) （EC₅₀; 100 mM) （EC₅₀; 4 mM) （EC₅₀; 2 mM) 慢性骨髄性 白血病治療剤 ラロキシフェン （EC₅₀; １ mM) JGV(‘12) 骨粗鬆症治療剤

HuH-7細胞

・ 肝細胞がん

・ 日本人

・ 男性

・

_57歳

・ 岡山大学（

1982年）

・

IL28B SNP：rs8099917 T/G

（インターフェロン治療抵抗性）

・全長

HCV RNA複製細胞システム

OR6細胞

(Ikeda et al. BBRC 2005)

Li23細胞

・ 肝細胞がん

・ 日本人

・ 男性

・

56歳

・ 国立がんセンター（

1987年）

・

IL28B SNP：rs8099917 T/T

（インターフェロン治療感受性）

・ 全長

HCV RNA複製細胞システム

ORL8細胞

(Kato et al. Virus Res

2009)

2種類の肝細胞株における相違点

HuH-7細胞とLi23細胞は、リバビリンやメトトレキサートなどの抗HCV

年齢 57 56 性別 男 男 細胞株 HuH-7 Li23 人種 肝細胞癌 _T/G T/T 細胞の由来 rs8099917 日本人 日本人 _肝細胞癌 遺伝子型 1b 1b 臨床 1b ヘルシーキャリアー ヘルシーキャリアー 急性肝炎 HCV株 O 1B-4 KAH5 Core a.a. (70/91) ISDR R/L Q/L Q/L 1 0 0 HCV RNA 複製細胞 HuH-7 Li23 OR6 ORL8 1B-4R 1B-4RL KAH5R KAH5RL IL28B SNP rs12979860 C/T C/C

肝細胞およびウイルス株の背景

IL28B SNPでrs809917がT/TだとIFN感受性

rs12979860がC/CだとIFN感受性 ISDRの変異が2個以上だとIFN感受性_{Core aa70が野生型(R)だとIFN感受性} Core aa91が野性型(L)だとIFN感受性

HuH-7 Li23

OR6 1B-4R KAH5R ORL8 1B-4RL KAH5RL

IFN-α (IU/ml) 0.94 0.58 0.44 0.18 0.24 0.16 IFN-γ (IU/ml) 0.25 1.00 0.44 0.06 0.06 0.05 IFN-λ1 (ng/ml) >40.00 10.00 1.45 0.02 0.08 0.06 OSM (ng/ml) 1.13 2.25 0.80 0.18 0.38 2.00 CsA (μg/ml) 0.37 0.31 0.35 0.19 0.24 0.25 PTV (µM) 0.58 0.39 0.86 0.08 0.20 0.08 EC₅₀ IFN: Interferon OSM: Oncostatin M CsA: Cyclosporine A PTV: Pitavastatin 5’ _{C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3’} ∆C EMCV IRES NeoR NS4A P7 RL

全長

HCV増殖レポーターアッセイ系による薬剤感受性の評価

2種類の肝細胞株を用いた

メトトレキサート

に対する薬剤感受性の違い

Ueda et al. BBRC 2011

HuH-7細胞とLi23細胞は、メトトレキサートに対して異なる薬剤感受性を示

0 20 40 60 80 100 120 ORL8 OR6 R L U ( % ) IFN-λ1 (ng/mL) OR6 ORL8 IFN-λ1 (ng/mL) 0 _{0.2 2 20}

細胞株による

IFN-λ1に対する感受性

R LU ( % ) C el l nu m be r ( % ) b-actin NS5B Core

OR6

EC

₅₀

:

>100 mM

100 0 20 40 60 80 100 120 50 100 25 12.5 リバビリン (mM) 100 50 25 12.5 0

ORL6とORL8のリバビリンに対する感受性

ORL8

は患者血中濃度

(10-14mM)で抗HCV活性を示す

21 42 66 kDa

ORL8

EC

₅₀

:

8.7 mM

リバビリン (mM) 100 50 25 12.5 0 0 20 40 60 80 100 120 140 50 100 25 12.5

1 10 100 1000 RL U (% ) OR6 (-) 0.1 1 10 IFN-λ1 (ng/mL) (-) 0.1 1 10 IFN-λ1 (ng/mL) 0.1 1 10 100 1000 RL U (% ) ORL8 RBV (-) RBV 12.5µM RBV 25µM RBV 50µM

OR6およびORL8細胞におけるIFN-λ1とRBV併用効果

genotype 2a clinical condition Fulminant hepatitis HCV strain JFH−１ HCV permissive cells HuH-7 Li23 RSc D7

HuH-7およびLi23細胞由来のJFH-1 感受性細胞株

5’ _{C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3’} ∆C EMCV IRES NS4A P7 RL HCV JFH-1株は現在感染性HCV粒子産生が可能な唯一のHCV株

細胞株

HuH-7 Li23

HCV株 Sub full Sub full O sO OR6 ND ORL8

1B-4 s1B-4R 1B-4R ND 1B-4RL

KAH5RsKAH5R KAH5R ND KAH5RL

JFH1 RSc D7 NS3 NS4B NS5A NS5B 3’ NS4A 5’ ∆C EMCV IRES NeoR RL 5’ _{C E1 E2 NS2 NS3 NS4B NS5A NS5B 3’} ∆C EMCV IRES NeoR NS4A P7 RL

HCV培養細胞系

細胞 薬剤 0h -24h 解析 72h 0 20 40 60 80 100 120 (-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 10 Re la tiv e RL A ct iv ity (% ) Guanfacine-HCl (µM) EC₅₀: 0.768 µM 0 20 40 60 80 100 120 (-) 0.240.490.981.953.917.8115.631.362.5 125 250 Ce ll Vi av ili ty (% ) Guanfacine-HCl (µM) CC₅₀: 128 µM Core β-actin 21 kDa 42 kDa (-) 0.63 1.25 2.5 5 10 Guanfacine-HCl (µM)

Li23細胞でGuanfacine・HClは抗HCV活性を示す

0 20 40 60 80 100 120 140 (-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 Re la tiv e RL A ct iv ity (% ) Guanfacine-HCl (µM)

HCV JFH-1株においてもGuanfacine・HClは抗HCV活性を示す

EC₅₀: 1.23 µM 0 50 100 150 200 (-) 0.98 1.95 3.91 7.81 15.6 31.3 62.5 125 250 Ce ll Vi av ili ty (% ) Guanfacine-HCl (µM) CC₅₀: 139µM 細胞 薬剤 0h -24h 解析 72h

HuH-7系細胞ではGuanfacine・HClは抗HCV活性を示さない

0 20 40 60 80 100 120 (-) 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 10 Re la tiv e RL A ct iv ity (% ) Guanfacine-HCl (µM) OR6 0 20 40 60 80 100 120 (-) 0.08 0.16 0.31 0.63 1.25 2.5 5 Re la tiv e RL A ct iv ity (% ) Guanfacine-HCl (µM) RSc JRN/35B 細胞 薬剤 0h -24h 解析 72h

・降圧剤 _{(α2アドレナリン受容体作動薬)} アドレナリン受容体のうち、α2受容体のみが、抑制性のGタンパク(Gi) 共役型であり、セカンドメッセンジャーの_{cAMPを減少させる。} 2005年効果がないため販売中止となった。 製造：日本チバガイギー、発売：ノバルティス、販売：持田製薬 ・_{cAMPを抑制して作業記憶を改善。} 2013年より小児のADHDに対して治験開始。 塩野義/Shire（アイルランド）が日本で申請準備中（2015年8月）

Guanfacine (エスタリック)

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