マウス脾細胞におけるbeta-glucan応答性遺伝子の網羅的解析

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(1)Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51, 199 − 206, 2010 ISSN 0916 − 4804. 原. 著. マウス脾細胞における beta-glucan 応答性遺伝子の網羅的解析飛三. 田浦. 敏典. 江子. 川安. 南達. 裕禎. 美之. 石大. 橋野. 健尚. 一仁. 東京薬科大学薬学部免疫学教室〔受付：２月５日，2010 年，受理：８月 11 日，2010 年〕. 要. 旨. われわれは Sparassis crispa より可溶性のβ-glucan（BG）：SCG を精製し，その生物活性について検討してきた．BG の白血球への応答性にはマウス系統差が存在し，DBA/2 マウスは SCG に強く応答し，in vitro においてサイトカイン産生を誘導する．そこで本研究では，DBA/2 マウスにおける in vitro 培養の条件設定について精査し，SCG 添加の至適条件を設定したうえで DNA マイクロアレイを用いて，BG により誘導される因子を網羅的に解析した．まず，SCG の至適な刺激時間を検討したところ，培養開始直後に添加した場合のみならず，24 時間後または 30 時間後に添加しても有意なサイトカイン産生が認められた．遺伝子発現の解析においては最も短時間刺激することが夾雑刺激を示しにくいと考え，さらに前処理時間を延長し，36 時間目に SCG を添加し，その後４時間で RNA を調整することとした．この条件で得た検体を用いて網羅的解析を行ったところ，SCG により発現が２倍以上亢進する遺伝子は，サイトカインやケモカインに関する遺伝子をはじめ Edn1，Ptgs2 など 18 種類であった．さらに，発現産物のレベルでこれらの遺伝子を評価したところ，サイトカインに加え，prostaglandin E2 （PGE2）が検出された．以上の結果から，脾細胞は培養前半で BG に対する応答性が高まり，その後 SCG による様々な因子の発現誘導が起こるものと考えられた． Key words：beta-glucan（β-glucan），PGE2（PGE2），IFN-gamma（IFN-γ）. はじめに初期免疫応答の最も重要なステップは，病原因子の認識と非特異的な手段による排除である．微生物成分は分子構造が繰り返しパターンを持つ特徴があり，この分子パターン（pathogen-associated molecular patterns： PAMPs）を標的とする受容体は，しばしばパターン認識レセプター（pattern recognition receptor：PRR）と呼ばれ，病原体を直接認識し細胞応答を引き起こすシグナル 1）を与える．代表的な PRRs として，Toll-like receptor 2,3）（TLR）とレクチンが挙げられる．近年，C-type レクチンの一つである dectin-1 は真菌の認識，排除に重要 4,5）な役割を担っていると示唆されている． β1,3-/β1,6-Glucan（β-glucan：BG）はグルコースのみで構成されている多糖体で，β-（1 → 3）結合を主鎖に持ち，種類によっては規則的にβ-（1 → 6）結合の側鎖を有している物質である．自然界での分布は，真菌別刷請求先：大野尚仁〒 192-0392 東京都八王子市堀之内 1432-1 東京薬科大学薬学部免疫学教室. をはじめ，酵母，海藻，細菌，高等植物などであり，その由来や抽出法により構造，分子量，分岐，高次構造の 6）点で相違が認められる．BG は主に，マクロファージや単球，好中球，NK 細胞によるサイトカインやケモカイン産生を誘導することによって初期免疫を活性化し，宿主防御を亢進させる．PRR である BG 受容体の研究は，従来から Ross らにより精力的に進められており，補体受容体の一つ complement receptor type 3（CR3）がファゴサイトーシスにかかわる受容体であると報告されてい 7）る．また近年，dectin-1 が新たな BG 受容体として報告され，BG が PAMPs として挙動していることがさら 4,5）に強く示唆された．一方で BG は古くから非特異的免疫療法剤として用いられ，Schizophyllum commune 由 8）来の schizophyllan（SPG）や Lentinus edodes 由来の 9） lentinan（LTN）は，医療用医薬品として承認されている．BG は抗腫瘍効果の他にも様々な免疫薬理学的活性を有すると報告されており，その構造により異なった活 6）性を示す． Sparassis crispa の子実体はβ-1, 3-glucan を高濃度で含有する食用茸である．われわれは S. crispa を繰り返し抽出することにより可溶性の BG：S. crispa β-glucan.

(2) 200. 真菌誌. （SCG），を精製し，その生物活性について検討してきた． SCG は３残基に１つの割合で分岐を持つ６分岐β-1， 10,11） 3-glucan である．SCG は担癌モデルマウスにおける抗腫瘍効果や，cyclophosphamide で誘導された白血球減少症モデルマウスにおける造血機能促進効果を示 10,12） 13）す．in vitro において SCG は，ヒト末梢血単核球， 14） 15）マウス脾細胞や骨髄由来樹状細胞に作用し，サイトカイン産生を誘導する．BG は真菌の細胞壁主要構成成分であり，非常に多岐にわたる免疫調節作用を示す．しかしながら，このような様々な in vivo における生物活性の一方で，BG の in vitro における白血球への応答性は他の PAMPs と比較すると弱いとされ，その生物活性のメカニズムを探ることは困難である場合が多い．われわれは BG の応答性にはマウス系統差が存在し， DBA/1，DBA/2 マウスは高応答性を示す系統であるこ 14）とをすでに報告している．DBA/2 マウス脾細胞において SCG は interferon-γ（IFN-γ），interleukin-12p70 （IL-12p70），tumor necrosis factor-α（TNF-α），granulocyte macrophage−colony stimulating factor（GM16） CSF）産生を著しく誘導する．これらサイトカインの中でも GM-CSF は BG のサイトカイン産生誘導に重要な分子であり，且つ GM-CSF の産生誘導は DBA/2 マウスにおいて特異的な段階であると示唆された．また， DBA/1，および DBA/2 マウスの血清中には BG に対す 17）る抗体が高い力価で検出される．ヒト血清中には BG に対する抗体が検出され，その抗体価と深在性真菌症と 18）の関連が示唆されている．さらに，DBA/2 マウス由来の骨髄由来樹状細胞には，他の系統のマウスと比較す 15）ると高い割合で dectin-1 を発現している．われわれは，DBA/2 マウスの SCG への応答性を研究する過程において，BG の白血球への応答性は GM-CSF と dectin-1 により制御することができることを明らかにしつつある．従って BG の研究において DBA/2 マウスは非常に有用なモデルマウスであると考えられる．われわれは in vitro において BG により誘導される因子を，主にサイトカインに着目し探索を試みてきた．そこで今回は DBA/2 マウス脾細胞における BG の応答性をさらに検討するために，BG の応答性を高めた条件下において DNA マイクロアレイ解析を実施し，BG により誘導される因子を網羅的に解析した．材料および方法１．動物雄性 DBA/2 マウスは日本 SLC（Shizuoka, Japan）より購入した．マウスは specific pathogen free（SPF）環境下で飼育された．２．材料 Gentamycin sulfate，RPMI 1640 medium は Sigma Chemical Co.（St. Louis, MO）より購入した．Fetal calf serum（FCS）は Sanko Junyaku Co., Ltd.（Tokyo, Japan）より購入した． RPMI は RPMI 1640 medium に gentamycin sulfate. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. を 50 μg/ml 添加し，使用した．３．SCG の調製可溶性 BG：SCG は Sparassis crispa の冷アルカリ抽出 12）画分を精製することにより得た．乾燥粉末 S. crispa を冷アルカリ抽出し（10％ NaOH/5％ urea，４℃，２日間），抽出画分を 8M 尿素に溶解し，DEAE Sephadex − A-25（Cl ）column にアプライした．通過画分を回収し，透析後，凍結乾燥した（元素分析 C：H：N=40.06：6.77： 0.08）．SCG 溶液は 0.5 N の NaOH に溶解した後に生理食塩水で透析することで作製した．作製した溶液はオートクレーブ処理し，使用するまで凍結保存した．４．脾細胞の調製マウスを CO2により屠殺し，脾臓を摘出した．RPMI 中でメッシュを用いて細胞浮遊液を調製した後，1,200 rpm × 5 min で遠心分離した．得られた細胞を ACKlysing buffer（8.29 g/l；NK4 Cl，1 g/l；KHCO3，37.2 mg/l；EDTA・2Na）で処理し，RPMI で２回洗浄した． 6 その後，白血球数の計測により細胞濃度を 5 × 10 cells/ml に調製し，10％の非動化 FCS を含む RPMI （10％ FCS/RPMI）に懸濁して用いた．５．細胞培養 10％ FCS/RPMI に懸濁した細胞を，細胞培養用 24 穴プレートに１ ml ずつまき，37℃，５％ CO2インキュベータにて培養した．６．DNA マイクロアレイ培養後の脾細胞を複数の well から回収し，RNA サンプルを調整し，AgilentTechnologies のマイクロアレイにて網羅的な発現解析を行った．なお RNA の抽出からデータ解析まで北海道システム・サイエンス（Hokkaido, Japan）に依頼した．７．サイトカインおよび prostaglandin E2 の測定 TM IFN-γ，TNF-α，GM-CSF は OptEIA kit（BD Biosciences；San Diego, CA）を用いて測定した．また， prostaglandin E2（PGE2）は Parameter PGE2 Immunoassay（R ＆ D systems; Minneapolis, MN）を用い測定した．８．有意差検定本論文における有意差検定は，すべて Studentʼs t-test によって行い，p ＜ 0.05 のものを「有意差あり」と判定した．結. 果. １．SCG によるサイトカイン産生誘導の経時変化 DBA/2 マウス脾細胞培養系における SCG のサイトカイン産生誘導に必要な培養時間は，48 時間であり，24 時間後の培養上清中には SCG により誘導されるサイトカインがほとんど検出されないことがすでに判明してい 19）る．これは，細胞が SCG に応答し，サイトカイン産生誘導に関わるシグナルが伝達されるまでに 48 時間を必要とすることを示唆している．そこで，このことを確かめるために BG への応答性を高めた状態で，SCG のサイトカイン誘導に関する経時変化を検討した．まずわれわれは前培養した脾細胞を用いることで，.

(3) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. 201. Fig. 1. Cytokine induction of SCG in splenocytes fromDBA/2 mice in vitro. Splenocytes were isolated from DBA/2 mice and cell suspensions were adjusted to 5 × 106 cells/ml in 10% FCS/RPMI medium. Cells were stimulated with SCG（100 μ g/ml）at 0, 24 or 30 h, and incubated for 48 h. After incubation, the concentrations of IFN-γ, TNF-α and GM-CSF in the supernatant were determined by ELISA. Data were pooled from three identical experiments, with similar results, each evaluating at least two mice per group. Values represent the mean ± SD. Significant difference from the corresponding control, ＊ P ＜ 0.05, ＊＊ P ＜ 0.01, ＊＊＊ P ＜ 0.001.. SCG によるサイトカイン産生誘導の経時変化に影響を及ぼすか検討した．DBA/2 マウス脾細胞に培養開始後０時間後，24 時間後，または 30 時間後に SCG（100 μ g/ml）を添加した．培養開始 48 時間後に上清を回収し， IFN-γ，TNF-α，GM-CSF を ELISA にて測定した． SCG を０時間後に添加した群において，IFN-γ，TNFα，GM-CSF が有意に上昇した（Fig. 1）．SCG を 24 時間後に添加した群は，０時間後に添加した群と比較すると，GM-CSF 産生が減少していた．24 時間後に添加した群，０時間後に添加した群の SCG の刺激時間は，それぞれ 24 時間，48 時間である．従って，GM-CSF の減少は，SCG の刺激時間に依存したものであると推測される．一方，SCG による IFN-γ産生誘導は，24 時間後に添加した群において，０時間後に添加した群よりも有意な上昇が観察された．また，SCG による TNF-α産生誘導は，24 時間後と０時間後で有意な差はみられなかった．24 時間後に添加した群は０時間後に添加した群と比較すると SCG の刺激時間が 24 時間少ないにもかかわらず，サイトカイン産生量が増加，または同程度であることから，DBA/2 マウス脾細胞培養系は，培養 24 時間の間は BG に対する応答性を高める期間であり，SCG の直接的なサイトカイン産生誘導は行われていないと示唆される．次に，SCG による直接的なサイトカイン産生誘導に関. する経時変化を検討するために，BG に対する応答性を高めた条件下で検討した．DBA/2 マウス脾細胞を Fig.1 よりさらに長時間の 36 時間あらかじめ培養し，その後 SCG（100 μg/ml）を添加し，40 時間，42 時間，45 時間後に培養上清を回収した．IFN-γ，TNF-α，GM-CSF のいずれのサイトカイン産生誘導も培養 40 時間後，つまり SCG 添加後４時間ですでに観察され，その後経時的に上昇した（Fig. 2）．以上の結果から，脾細胞培養系の SCG 感受性が亢進し，サイトカイン産生誘導に必要な条件が整った状態であれば，SCG は４時間でサイトカイン産生を誘導できると示唆された．２．DNA マイクロアレイによる網羅的遺伝子発現解析われわれは，in vitro において BG により誘導される因子を，主にサイトカインに着目し，探索を試みてきた．しかしながら前述のとおり，SCG によるサイトカイン産生誘導はあらかじめ条件が整った状態を作ることが重要であると示唆され，それには複雑な因子が関与しているものと推測される．そこで in vitro において BG により誘導される現象をサイトカイン以外の視点から捉える目的で，SCG により発現誘導される遺伝子を DNA マイクロアレイにより網羅的に解析した．Fig.1 ならびに Fig.2 の結果に基づき，DBA/2 マウス脾細胞を 36 時間培養し，その後 saline または SCG（100 μg/ml）を添加し，更にその４時間後に RNA を調製し遺伝子発現を.

(4) 202. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Fig. 2. Kinetics of cytokine production induced by SCG in splenocytes from DBA/2 mice in vitro. Splenocytes were isolated from DBA/2 mice and cell suspensions were adjusted to 5 × 106 cells/ml in 10% FCS/RPMI medium. Cells were stimulated with SCG（100 μ g/ml）at 36 h, and incubated for 40, 42 or 45 h. After incubation, the concentrations of IFN-γ, TNF-α and GM-CSF in the supernatant were determined by ELISA. Data were pooled from three identical experiments, with similar results, each evaluating at least two mice per group. Values represent the mean ± SD. Significant difference from the corresponding control, ＊ P ＜ 0.05, ＊＊＊ P ＜ 0.001.. Fig. 3. Prostaglandin E2 induction of SCG in splenocytes from DBA/2 mice in vitro. Splenocytes were isolated from DBA/2 mice and cell suspensions were adjusted to 5 × 106 cells/ml in 10% FCS/RPMI medium. Cells were stimulated with SCG（100 μg/ml）at 0 h, and incubated for 46 h. After incubation, the concentrations of prostaglandin E2 in the supernatant were determined by ELISA. Data were pooled from three identical experiments, with similar results. Values represent the mean ± SD. Significant difference from the corresponding control, ＊＊＊ P ＜ 0.001.. DNA マイクロアレイにて解析した． Table 1 は，SCG により 1.75 倍以上亢進する遺伝子のリストである．SCG により発現が２倍以上亢進する遺伝子は 18 種類であった．これらの高発現遺伝子には，ケモカイン，サイトカインに関わる遺伝子群（Cxcl2， Ccl4，Il1a，Gm1960，Il1b，Ccl3，Il22），C-type レクチンに関わる遺伝子（Clec-4e），prostaglandin-endoperoxide synthase 2（Ptgs2），endothelin 1（Edn1）が見受けられた．また，やや発現増強した遺伝子（1.5 倍）まで含め，サイトカイン，ケモカインに関する遺伝子を抽出したところ，16 種類の遺伝子が発現亢進すると示唆された．その他，同解析において発現増強した遺伝子として， Hspa1a，Cd14，Ifit1，Ifit2，Cd69，Ifit3，Icam1，Cd9 なども含まれた．３．SCG による PGE2産生誘導次にわれわれは，SCG の刺激により上昇した遺伝子の中でも高発現した Ptgs2 に着目した．Ptgs2 が関与するアラキドン酸の環化経路における重要活性産物の一つに prostaglandin E2（PGE2）がある．そこでわれわれは SCG の刺激により PGE2が培養上清中に検出されるか検討した．DBA/2 マウス脾細胞培養系に SCG（0，10，100 μg/ml）を添加し，48 時間培養した．培養上清中の PGE2 は ELISA にて測定した．Fig. 3 に示すように，.

(5) Jpn. J. Med. Mycol. Vol. 51（No. 4）, 2010. Table 1.. 203. Top genes up-regulated in splenocytes stimulated with SCG. GeneName. Description. FoldChange. Cxcl2. chemokine (C-X-C motif) ligand 2. 4.16. Ptgs2. prostaglandin-endoperoxide synthase 2. 3.21. Edn1. endothelin 1. 3.19. Ptx3. pentaxin related gene. 2.52. Ccl4. chemokine (C-C motif) ligand 4. 2.51. Il1a. interleukin 1 alpha. 2.49. Gm1960. chemokine (C-X-C motif) ligand 3. 2.44. Olr1. oxidized low density lipoprotein (lectin-like) receptor. 2.44. F3. coagulation factor III. 2.34. Plk2. polo-like kinase 2 (Drosophila). 2.27. Il1b. interleukin 1 beta. 2.18. Rsad2. radical S-adenosyl methionine domain containing 2. 2.16. Ccl3. chemokine (C-C motif) ligand 3. 2.12. Clec4e. C-type lectin domain family 4, member e. 2.10. Slc2a3. glucose transporter type 3. 2.06. Inhba. inhibin beta-A. 2.04. Il22. interleukin 22. 2.03. Fosl2. fos-like antigen 2. 2.00. Il6. interleukin 6. 1.98. Ccrl2. chemokine (C-C motif) receptor-like 2. 1.95. Npn3. neoplastic progression 3 (Npn3). 1.93. Mx2. myxovirus (influenza virus) resistance 2. 1.92. Hspa1a. heat shock protein 1A. 1.92. Luc7l2. LUC7-like 2 (S. cerevisiae). 1.91. Atp5g3. ATP synthase, H + transporting, mitochondrial F0 complex subunit c (subunit 9), isoform 3 1.89. Paqr3. progestin and adipoQ receptor family member III. 1.88. Pkib. protein kinase inhibitor (testicular isoform). 1.88. Txnl1. thioredoxin-like 1. 1.83. Ifng. interferon gamma. 1.81. Hoxd13. homeo box D13. 1.78. Cxcl10. chemokine (C-X-C motif) ligand 10. 1.76. SCG の添加により PGE2の産生誘導が観察された．従って SCG はサイトカインだけでなく，PGE2のような分子を誘導することが明らかとなった．考. 察. 現在までの研究成果を基に推測されている DBA/2 マウス脾細胞における SCG のサイトカイン産生誘導メカニズムは，付着性細胞と CD4 陽性 T 細胞の細胞間接着による GM-CSF 産生誘導，受容体の発現による付着性細胞からの TNF-α産生誘導，誘導された TNF-αによる GM-CSF のさらなる誘導，付着性細胞からの IL-12p70 産生誘導，付着性細胞と成熟型 CD4 陽性 T 細. 胞の Inter-Cellular Adhesion Molecule 1（ICAM-1）と Lymphocyte Function-associated Antigen 1（LFA-1）を介した細胞間接着による IFN-γ産生誘導，といった一連の反応を経た結果として大量のサイトカイン産生が誘 19）導されるものと示唆されている．われわれはこのような一連の反応が起こるためには，培養時間として 48 時 14,19）間を要すると報告してきた．しかしながら本研究により，BG に対するより高感度な系を用いることにより SCG の刺激後４時間で様々な遺伝子発現が亢進し，サイトカイン類を検出できることが判明した（Fig. 2，Table 1）．SCG の白血球への応答性には，GM-CSF と同様に 20） dectin-1 が重要な役割を担っている．Willment らは，.

(6) 204. dectin-1 が GM-CSF 処理マクロファージにおいてその発現と機能を促進させると報告している．従って，脾細胞の前培養の間に，SCG 非依存的に産生誘導された GM-CSF により DBA/2 マウス脾細胞上に dectin-1 のような BG 受容体が高く発現されると考えられ，dectin-1 を介したシグナルが SCG によるサイトカイン産生を増強させると示唆される． SCG の GM-CSF と IFN-γ産生誘導は，付着性細胞と非付着性細胞の細胞間接着の阻害下では観察されないことから，T 細胞と付着性細胞の細胞間接着が必要であると考えられている．実際，代表的な接着分子である ICAM-1 や LFA-1 の中和により，SCG による GM-CSF 19）や IFN-γ産生誘導が抑制される．ICAM-1 は B 細胞や単球マクロファージなど血液系細胞のみならず，血管内皮細胞にも発現しており，そのリガンドである LFA-1 との結合を介して種々の細胞間接着にかかわり， 21）細胞白血球間相互作用に関与している．また，T 細胞と抗原提示細胞は ICAM-1 とそのリガンドとする細胞間での結合により，抗原非依存的に接着するとも報告さ 22）れている．以上の結果から，SCG による GM-CSF や IFN-γ産生誘導には，ICAM-1 を介した付着性細胞と T 細胞の結合が必要であると示唆されている．本研究により，SCG の添加により ICAM-1 の遺伝子発現が亢進していた（Table 1）．従って，SCG は ICAM-1 などの接着因子の発現を亢進させ，付着性細胞と T 細胞との細胞間接着を促進させる可能性が考えられる．われわれは，DBA/2 脾細胞培養系において SCG により誘導される因子を，主にサイトカイン産生に着目して検討を重ねてきた．しかしながら，SCG により亢進する遺伝子の網羅的解析により，ケモカイン，サイトカインにかかわる因子のみならず，PGE2 も上昇することが明らかとなった（Table 1）．また，SCG により Clec4 の遺伝子の発現亢進が観察された．Clec4e は Mincle とも呼ばれ，活性化マクロファージに発現している C-type レ 23,24）クチンである．Clec4e は遺伝子的に mouse chromosome 6 上に位置し，これらの cluster の中には，dectin-2 が含まれる．近年，Clec4e は，アトピー性皮膚炎と関連性がある Malassezia species の受容体であり，そ 25）の免疫応答に重要な役割を演じていると報告された． BG によるこのような受容体の発現増強は，感染防御の面からも重要かもしれない．エンドセリンは強力かつ持続性の血管収縮作用を有することから，高血圧や虚血性循環系疾患の病因あるいは 26）増悪因子としての役割が注目されている．エンドセリンには３種類のファミリーペプチド（ET-1，ET-2， ET-3）の存在が知られているが，血管系で産生されるのは主に ET-1 であり，その病態生理学的役割に対する関心が最も高い．また，ET-1 は食塩感受性高血圧や虚血性急性腎不全の発症・進展カスケードにおいて重要な因子であり，その受容体拮抗薬はこれらの病態に対する治療薬として有効であると示唆されている．このようにエンドセリンの生体制御に果たす影響は大きいものであ. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. り， SCG による Edn1 の発現上昇は， BG が示す生物活性の新たな機序の解明につながるものになると考えられる．プロスタグランジンはアラキドン酸の prostanoid fatty acid 誘導体である．アラキドン酸はホスホリパーゼにより膜リン脂質より遊離され，COX-1，COX-2 により PGG2 や PGH2 に代謝され，prostaglandin E synthetase（PGES）により PGE2に変換する．PGE2は発痛，血管透過性の亢進，発熱腫脹・浮腫，発熱など様々な作用を示す炎症起因物質である．これまでわれわれは，マウスに BG と PGE2の生成を阻害する非ステロイド性抗炎症薬（NSAIDs）を併用投与することによって，致死にい 27）たることを見いだし報告してきた．BG による PGE2 の誘導は，本活性のメカニズム解析の一部につながるものになると考えられる．今回，一部の遺伝子については，マイクロアレイ分析で初めて見いだされたものであり，メカニズム解析においては重要な意味を持つものが含まれている．これらについては今後タンパク質レベルでの解析を行い，さらに確証を得なければならないと考えている．われわれは，DBA/2 マウスへの SCG の反応を研究していく過程で，BG の白血球への応答性は GM-CSF と dectin-1 により制御することができることを明らかに 28）しつつある．cyclophosphamide の投与は内因性 29） GM-CSF を亢進させ，SCG の応答性を増強させる．一方 BG の in vivo における投与は内因性 GM-CSF を減少させ，in vitro において SCG により誘導されるサイト 30）カイン産生量を減少させる．本研究によりわれわれは，BG のより高感度な評価系を提示し，サイトカインを含め SCG で誘導される因子を多数見いだした．これらの結果は，BG の応答性の制御解明に役立つものになるであろうと考えられる．謝. 辞. 本研究は，イノベーション創出基礎的研究推進事業により行われたことを記し，感謝申し上げます．文. 献. 1）Gordon S: Pattern recognition receptors: doubling up for the innate immune response. Cell 111: 927-930, 2002. 2）Kumar H, Kawai T, Akira S: Toll-like receptors and innate immunity. Biochem Biophys Res Commun 388: 621-625, 2009. 3）van Vliet SJ, den Dunnen J, Gringhuis SI, Geijtenbeek TB, van Kooyk Y: Innate signaling and regulation of dendritic cell immunity. Curr Opin Immunol 19: 435-440, 2007. 4）Saijo S, Fujikado N, Furuta T, Chung SH, Kotaki H, Seki K, Sudo K, Akira S, Adachi Y, Ohno N, Kinjo T, Nakamura K, Kawakami K, Iwakura Y: Dectin-1 is required for host defense against Pneumocystis carinii but not against Candida albicans. Nat Immunol 8: 39-46, 2007..

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(8) 206. 真菌誌. 第 51 巻. 第４号. 平成 22 年. Gene Expression in Murine Splenocytes Induced by Soluble Beta-glucan 1. 1. 1. Toshie Hida , Hiromi Kawaminami , Ken-ichi Ishibashi 1 1 1 Noriko Miura , Yoshiyuki Adachi , Naohito Ohno. Laboratory for Immunopharmacology of Microbial Products, School of Pharmacy, Tokyo University of Pharmacy & Life Sciences SCG is a 6-branched 1,3-β-D-glucan, and is a major cell wall structural component in fungi. The leukocytes from DBA/1 and DBA/2 mice are highly sensitive to SCG, producing cytokines, such as GM-CSF, IFN-γ and TNF-α. GM-CSF plays a key biological role in this activity. We analyzed factors induced by SCG in splenocytes from DBA/2 mice by DNA microarray analysis on the condition of high sensitivity to β-glucan. Splenocytes were stimulated with SCG at 0, 24 or 30 h, and then supernatant was collected at 48 h to measure cytokines. SCG stimulated splenocytes to produce GM-CSF, IFN-γ and TNF-α in all the supernatants of 0, 24, and 30h. The amount of IFN-γ production thus stimulated at 24 h was comparable to that at 0 h. Cytokine induction was observed at 4 h after SCG-stimulation even in the splenocytes pre-cultured for 36 h. The gene expression induced by SCG was analyzed with DNA microarray in the splenocytes in this condition. SCG up-regulated the expression of genes including Edn1 and Ptgs2 as well as genes associated with cytokine and chemokine. PGE2 was detected in the medium of splenocytes stimulated with SCG. Taken together, these results indicated that splenocytes enhanced the sensitivity to SCG in earlier culture periods, and then responded to SCG to induce not only the cytokines but also various other factors..

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