研究会 だ よ り
第
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回岡山夷鹸動物研究会
平成12年12月8日(金)午後 1時30か ら5時 30分 まで メル パ ル ク 0RAYAMA(岡 山郵 便貯 金 会 鰭) で､ 岡山県産 業振 興財 団 (旧､ 岡山県 新技術 振 興財 団) の後援 で 開催 され た｡ 特別 講 演 (1)は ｢機 能 性 食 品業 界 の最 近 の動 向｣ と超 して備 前化成㈱研 究 開発 部 の井 上良計氏が講 演 され た｡ この 司会 は河 田哲 典 先 生 (岡 山大 ･教 育学 部)が担 当された｡ 休 憩 を取 った後 ,事務 局か ら会務報告 が あった｡ (丑平成12年度 の研 究会活 動 は､研 究会 の開催 ､ 研究 会報 の発行 ､投 稿規 定 の制定 ､理事 会 ･常務 理事 会 の 開催 が あ った ｡研 究 会 の 開催 は､第 39 回が7月 8日岡山大学 文学部 で三谷憲 一先生 のお 世話 で ､第 40回が本 日 12月 8日メルパ ル ク oKAYAMAで ､ いずれ も岡山県産 業振興財 団の後援 で 開催 されて いる こと､第 17号会報 の発行 は 9 月で､会員 に 10月 に送付 した こと､投 稿規定 の 制定 を行 い､第 17号会報 に掲 載 した こと､理事 会 は7月8日､12月8日の2回､常務理事会 は5 月31日､9月26日､11月21日の3回開催 した こと､② 平成13､14年度 の役員 の選任 を会則 (第 7条 ､第9条)に則 って行 い､役員 は全員留任 し､ 会 長 に倉 林譲 先生 (岡山大 医学 部附属動物実験施 設)､新 た に常務 理事 に浅 田伸 彦 先 生 (岡山理 大 理学部) を推薦す る事務 局案 が提案 され ､ 了承 さ れた｡③ 平成 12年度 の会 計収支 中間報告 (平成 12年 1月1日∼12月5日) を行 い､収入総額 は 1,058,634円､支 出総額272,156円､残 高786,478 円で ある こと､④ 平成 13年度 の研 究会活動 とし て､ 2回の研 究会 (第41回､第42回) の開催 ､ 会 報 (第18号)の発行 ､理事 会 ･常務理事 会 (杏 2回)の開催 を計画 して いる こ と､な どであ った｡ 会務報 告後 ､直 ち に特 別 講 演(2)に移 った｡特 別 講 演 (2)は ｢無視 で きな い線 虫 の話｣と題 して ､ 岡山大学大学 院 自然科 学研 究科 の香川弘 昭先生が 講 演 され た｡ この 司会 は大森賓 先生 (岡山大 ･工学 部)が担 当された｡ 記念講演 は ｢実験動物研究 の 50年 を顧 みて｣と 題 して ､猪貴 義先 生 (本研 究 会 名巻会員 ､ 岡山大 学 名書 教 授) が講 演 され た｡ この 司会 は佐藤 (岡 山大 ･農学部)が担 当 した｡ 記念講演終 了後 ､同会場 で懇 親会 が 開催 された｡ 特 別講 演 ･記念講演 要 旨は以 下 の通 りです｡ なお､特別講演 要 旨は本誌 21-28貢 ､記念講 演要 旨は本誌 3-8貢 に掲載 され て います ので､ ご参 照下 さい｡ 特別 講漬 (1) 機能 性食 品業界 の最近 の研 究動 向 井上 良計 (備 前化 成株 式会社 研 究 開発部) 機能性 食 品 を基本 とす る健康 食品 ､サ プ リメ ン トの業界 は この数 年 ､他 の業界 が低 迷す る中で順 調 に市場 を拡 大 して きた｡ しか しなが ら､ この業 界 に内在す る問題 点 は多 く､ また最 近で は参 入す る企 業が多 く業者 の選別 が始 まって いる｡以下演 者 らの研 究 開発 の動 向 とこの業界 の今後 の課題及 び あ るべ き姿 につ いて述 べ る こととす る｡ ① 素材 開発 につ いて a)脂質成分 今後 の栄養成分 の研 究課題 の 中で最 も可能性 が ある事項 と して高度不飽和脂肪酸 (HUFA)が挙 げ られ る｡ 当然 これ まで の食 品成分 と して糖 質 ､ タ ンパ ク､ ビタ ミン､ ミネ ラル の研 究 は継続 され る で あ ろ うが HUFAにつ いて は未 知 の部分 も多 くそ の構 造 による様 々の生理機 能が期待 され る｡HUFA は生理機能成分 とな るばか りで な く他 の機能成分 が運 ばれ る過程 のカイ ロミク ロンや HDL･LDLで の関わ りが期待 出来 る｡ また各臓器 にお ける生体 膜 の構 成脂 質 中の脂肪酸 が これ らの HUFAに変わ る ことによ り様 々の機能 に影 響 して い くもの と推 測 され る｡HUFAにつ いて は DHA､EPA､DPA､AA ばか りでな く これ らの共役化 された ものが 生体膜 の リン脂 質 の酸化 に拘わ って いる ことが指摘 され て いる｡ また リン脂質 につ いて は DHAを含 む PC が多 い食材 と してイ クラや イカ リン脂質 な どが あ る｡ リン脂質 は他 の脂 質 と吸収過 程 が異 な り直接 リンパ に吸収 され る と言われてお り､筆者 らの研 究 の 中で も トリグ リセ リ ドと異 な った機 能 を示 し て いる｡ サ ラ ミ ドな どの ス フィ ンゴ脂 質 ､SQDGな どの 糖脂 質等 もそ の機 能 は未 だ十分 に解 明 されて居 ら ず HUFAを含有す る ものの濃縮 物 を中心 に これ ら の製 品化 また は これ らを含 む一般食 品で の製 品の 開発 が今後 の研 究課題 で あ ろ う｡ b)抗酸化 成分 :抗 老化 酸化 ス トレス による各種障害 につ いて は最近 と み に問題視 され て いる｡生存 上必要で あ る酵 素が 体 内 にお いて過酸 化 を受 け過酸 化物 を形成す る｡ 体 内で これ らの過酸化 物が免疫 系 の低 下やLDLを 酸化 しアテ ロー ム性 の動脈硬化 を起 こして いる｡ 酸化LDLが 平滑筋 を通 ってマ ク ロフ ァー ジに取 り 込 まれ泡沫化 を起 こす過程 を どの様 に抗酸化 成分 が抑 制 して い くのかが検 討 され て いる｡ これ らの 抗酸化 物 質 と して代表 され るカ テキ ン､ ケルセチン (ルチ ン､イチ ョウ葉､プロポ リスな どに含有)､ 各種ポ リフェノール (縮合型タンニ ン､エラグ型 タンニ ン) ビタミン類な どの吸収 と性能比較が消 費者向けに必要か と思います｡体内の抗酸化 は各 種疾病 を予防す る上で重要な要因であ り循環器系 ばか りでな く､発ガ ンに関わる機構や痴呆 に関与 している過酸化 を抑制す る上で重要な要因である｡ C)その他 :最近の話題 備前化成にて検討 してきた抗腰癌性 のある と言 われ るアガ リクス茸､牡蛸 に多 く含 まれ る有機亜 鉛な どについて時間があれ ばふれてみたい｡ ② 業界のあ り方 と今後のあ り方 この業界の抱 えている問題点 と対応法 につ いて 多少の私見 を加えて概括 してみたい｡ a)粗悪品の販売､b)医薬 ゾロメーカーの参入､ C)通常食品 との競合､d)業界のあ り方 :配合物 の機能評価 ､e)はや り廃 り､∫)販売の方法 特別講漉 く2) 無視できない線虫の鈷 香川弘昭 (岡山大学院 ･自然科学 ･分子生命科学 (理学部 ･生物学科)) 線虫C.エ レガ ンスは大腸菌 を餌 にして､20℃､ 3日で成虫になるので変生体の単離が容易です し､ 液体窒素で永久保存 出来 ます｡全細胞系譜､全神 経網 に続 いて全塩基配列 も 1998年末に決定 され ました｡9,700万塩基対 に､19,000遺伝子がコー ドされ､ ヒ トな どと相同な遺伝子が沢山見つかっ てお ります｡線虫は､細胞死､神経､発生等 の研 究 において先導的役割 を果 してお ります｡ 運動異常変異体 を用 いた筋肉タンパ ク質､特 に トロポニ ンCや トロポ ミオシンを用 いた筋肉遺伝 子の研究成果 を述べ ます｡線虫の筋肉は食餌 に使 われる咽頭筋､運動 に関わ る体壁筋が有 り､それ ぞれ､心筋 と骨格筋類似 と考 え られています｡ ミ オシン重鎖､パ ラミオ シン (無脊椎動物の太 い繊 維の芯)等の変異体 の運動不良の原因は太 い繊維 の形成不 良で した｡ トロポニ ンC変異の原因は､ カル シウム及び トロポニ ンⅠと結合出来ないこと です｡ トロポニ ン C変異体 は腔発生致死なので､ 虫は変異遺伝子 をヘテ ロにして生育 させ ます｡ ト ロポニ ンC変異体 の解析 は全動物で初めての解析 例です｡ トロポ ミオシン変異体 は レバ ミソール抵 抗性 を示 し､分子間相互作用が不良のよ うです｡ 遺伝 子操作 に加 えて､発現 プラス ミ ドを用いて 大腸菌でタンパク質 を生産 し､抗体 の作成や他 の タンパク質 との相互作用な どを調べ ます｡遺伝子 と1acZや gFpとの融合 プラス ミ ドを作成 して線 虫に微注入 し,形質転換線虫の β -ガラク トシダ ーゼ活性や蛍光タ ンパ ク質 の発光か ら遺伝子の発 現場所 を同定 します｡幾つかの融合遺伝子 を解析 して遺伝 子上流の発現調節領域 を明 らかに しまし た｡ 一つの遺伝子解析か らでは分か らなかった事が､ 多数を調べる と全体像が見えてきます｡遺伝子 と 細胞系譜が分かっているので､ どの遺伝子が どの 細胞で働 いているかを特定できます｡ トロポニ ン Cは二つの遺伝が咽頭筋 と体壁筋 において一つづ つ特異的に発現 していました｡ トロポミオシンは 一つの遺伝子が両組織で二つづつ､合計4つのア イ ソフォームがあ りま した｡ このよ うに､線虫は 遺伝子や タンパ ク質 の作用 を生物個体 レベルで調 べるには良いモデル生物です｡ 演 田智 代 ､ 寺 見 浩 美 ､ 香 川 弘 昭 ､ 生 物 物 産 (2000)40,13-19. T
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l,I.CellBL'01.(1999),146,193 -202. 妃念講演 実験動物研究の50年を席みて 猪 貴 義 (岡山大学名著教授) わが国にお ける実験動物研究 は､動物実験､実 験動物 に関係す る医学､生物学､薬学､獣医学､ 畜産学な ど少数 の有識者達 によって､1951年 に 設立 された実験動物研究会 (現､ 日本実験動物学 会) によって開始 された｡研究会の設立趣旨は､ 当時､系統､年令 ､病歴､飼料､飼育管理のな ど 不明の状況下 にあったわが国の実験用動物 を､遺 伝 コン トロール､病気 コン トロール､環境 コン ト ロールす ることによって､高品質の実験用動物の 開発 ･生産 ･供給 をはか り､内外の科学的批判 に たえる動物実験成績 の再現性 と精度 の向上をはか る ことにあった｡ 実験動物研究会 は､1957年 に 日本実験動物研 究会 ､1980年 に 日本実験動物学会 と名称 を変更 し､既 に 50年 を経過 しよ うと している｡ この時 にあた り､過去の歴史 をふ りかえ り､そ こで､ ど のよ うな重要な問題が と りあげ られ､解決 された のか､そ して､来 るべ き 21世紀 において､ どの よ うな問題が未解決のまま残 されて いるのか考え てみることは､わが国実験動物研究 の科学史的立 場か らみて も重要 とみ られ る｡ この度の講演 は､年代順 に従 って､重点的にと りあげ られた検討課題 とそ の成果 について解説する｡ (1.動 物実験 にお ける変動 要 因､2.変動要 因 の人為 的 コ ン トロール ､3.ヒ ト疾患 モデル動 物 の開発 ､4.動物実験法 の改善､5.医学 ･生物 学 ･薬学 の進歩 に伴 う対応 な ど)0 ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※ ※
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回岡山実験動物研究会
平成 13年6月 22日(金)午後1時 30分か ら5 時 まで㈱ 林原 生物化学研究所 ･藤 崎研究所 の栗本 雅 司所長 のお世話で 当研究所 を会場 に して､岡山 県産業振興財 団の後援で開催 された｡ は じめ に､会長の倉林譲先生 (岡山大 ･医学部) か ら開会 の挨拶があ り､そ の後 ､一般講演 に移 っ た｡一般講 演 (1)は｢
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J組換 え依存 性 の蛍光 標識法 によるRAG遺伝子発現細胞 の検 出 と解析｣ と題 して 岡山大学 ･工学部 の西川恵美子女史 が講 演 された｡ この司会 は浅 田伸彦先生 (岡山理大 ･ 理学部)が担 当された｡ 一般講演(2)は｢プ リオ ン蛋 白ペ プチ ド(PrPIO6 -126)によって ラッ ト下垂体 由来細胞株GH3に誘導 され る細胞死 の形態学 的お よび生化学的検 討｣ と 超 して 山下摂氏が講演 された｡ この司会 は新井成 之先生 (㈱林原生物化学研究所 ･藤 崎研 究所)が 担 当されたC 一般講演 (3)は ｢トレハ ラーゼ ノックア ウ トマ ウスの作 出 と表現型解析｣ と題 して㈱林原生物化 学研究所 ･藤崎研究所 の平 田京子女史が講演 され た｡ この司会 は辻 岡克彦先生 (川崎医科大)が担 当された｡ 一般講 演 (4)は ｢これか らの動物実験 施設 を考 える｣と超 して㈱夏 目製作所 の代表取締役の夏 目 克彦氏が講演 された｡ この司会 は倉 林譲 先生 (岡 山大 ･医学部)が担 当された｡ 一般講演終 了後､栗本雅 司所 長の ご好意 によ り 研 究所 の見学 をさせて いただいた｡見学 は4班 に 分かれて､研究所 のス タ ッフか ら詳 しい説明 を受 けた｡見学 は初めての方 も多 く､参加 された方 は 大変な興 味 と関心 を持たれ た様子 だ った｡ 見学会 ､休憩 の後､事務 局か ら会務報告が あっ た｡①平成 12年度の研究活動 として､2回の研 究会 (第 39回､第 40回) の開催 ､第 17号会報 の発行 ､平成 13､14年度役員 の選任 ､投稿規定 の制定 ､理事会 (2回)･常務理事会 (3回) の開 催 を行 った こと､② 平成 12年度 の会計収支決算 報告 として､収入1,116,134円､支 出487,024円､ 残高629,110円であ り､収支決算報告 に当た って 会計監査 を受 けて いる こと､③ 平成 13年度の研 究会活動計画 として､第41回､第42回研究会 (岡 山県産業振興財 団後援) の開催 ､第 18号会報 の 発行､理事会 ･常務理事会 (各2回)の開催 を予 定 して いる こと､な どであった｡ 会務報告後 ､直 ち に特別講演 に移 った｡ 特別講演 は ｢多 因子疾患原 因遺伝子Positional Cloningへの取 り組 み一肥満 ･高脂血症 ･高血糖 を支配す る遺伝子 の解 明- ｣ と題 して大塚製薬㈱ 大塚GEN研究所 の渡連武先生が講演 された｡ この 司会 は大森脊先生 (岡山大 ･工学部)が担 当され た｡ 特別講演終 了後 ､つ しま苑 に会場 を移 して懇親 会 (会費5,000円)が行われた｡懇親会 には講演 された先生方が全員参加 され､総勢 26名で盛大 な会 とな った｡倉林譲研究会会長の ご挨拶 に続 い て､本研究会名誉会員 の矢部芳郎先生か ら乾杯 の ご発声 をいただいた｡研究会 のお世話 をされ た㈱ 林原生物化学研究所 ･藤崎研究所 の栗本雅 司所長 か らご挨拶 をいただ き､講 師の先生方 と会員相互 の親睦 を深 めた.本研究会理事 の三谷恵一先生が 閉会 の ご挨拶 をされ､本研究会 の益 々の発展 を念 じて散会 した｡ 一般講漉 く1) r(D)J組換 え依存性 の蛍光模耕法 による RAG遺伝子発現細胞 の検 出と解析 西川恵美子l)､三木貴雄 l)､金 山直樹 1)､ 疋 田正喜1)2)､大森斉1) (1)岡山大学 工学部 生物機能工学科2
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[目的]骨髄 での幹細胞か ら成熟B細胞への分化 段 階 にお いて ､RecombinationActivatingGene(RAG)-1,2の遺伝子産物 が､抗体 の可変領域 を コー ドして いる
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(D)J遺伝子断片の再構成 を触媒 し､多様 な抗原 レセ プター を持つ莫大な数 のB細 胞 クロー ンが 生み 出され る｡RAGは骨髄 内でV
(D)I 遺伝子の再編成が行われ る段階で発現 し､再構成 を終 えたB細胞 にお いて は発現が抑制 され る と考 え られてきたが,近年､抗原で感作 された末梢 リ ンパ組織 中や L'tZVl'tTOで刺激 した末梢 B細胞で のRAG発現が示 されて いる｡ また､ リウマチの患 者 の関節 にRAG陽性細胞が存在 して いる ことや､ ある種の 自己免疫疾患 のモデルマウスにお いて も RAGが末梢で抗体 可変部 の再組換 えを行 って いる ことが明 らか とな って いる｡このよ うな ことか ら､ これ らの疾患 の発症原 因の一つ とされ る 自己抗体 を産 生す るBリンパ球 の生成 と末梢でのRAGの発 現 との関係が注 目されて いる｡ したが って､ どの よ うなB細胞 がRAGを発現す るのか､RAG陽性 に なった B細胞 は どのよ うな抗原特異性 を持つよ うに変化するのか､ とい うことを調べることは重要 である｡本研究では､異なる蛍光 を発する二種類 の蛍光タンパ クの遺伝子 を利用す る ことによ り､ RAGによる
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組換えが行われた細胞で発現す る蛍光タンパ クが変化す るよ うな人工基質を設計 し､それ らの細胞 を可視化する方法を確立す るこ とを試みた｡さらにこのよ うな人工基質 を利用 し､ 末梢で発現 したRAGの機能 と生理的意義 を解析す ることを目的 としている｡ [方法】 リンパ球細胞へのRAGの人工基質 となる 遺伝子 を高効率で導入す るために､本研究ではレ トロウイル ス法 を用 いて い る｡導入遺伝 子 は､V(
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J組換えにおいてRAGが認識す る配列 (RSS)､ EGFP､DsRED遺伝子 を レ トロウイルスベ クターに 挿入 して作製 した｡ この遺伝子では､RAGによる 組換え前には赤 い蛍光 タンパクであるDsREDの遺 伝子がプロモーターの読み取 り方向に対 して正方 向､緑の蛍光 タンパクである EGFPの遺伝子は逆 方向に挿入 されている ことか ら､細胞 に組み こま れた直後 にはDsRED遺伝子 のみが細胞内で発現 し､ ウイルスに感染 した細胞 を赤 い蛍光で検 出す るこ とができる｡ これ らの細胞 にお いて､RAGが導入 遺伝子中のRSSを認識 して組換 えを行 うと､DsRED 遺伝子はプロモーターの読み取 り方向に対 して逆 方向､EGFP遺伝子が正方向に逆転す る｡その結 果､RAGによるy(
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組換えが行われた細胞 にお いては､発現す る蛍光 タ ンパ クが赤色か ら緑色へ と変化す ることが期待できる｡そ こで､作製 した レ トロウイルスベ クターを種々の条件で細胞や組 織 に感染 させ､赤色蛍光か ら緑色蛍光への変化 を 共焦点 レーザー顕微鏡で検 出 した｡ [括果】ウイルスベクターを リボフェクション法 によ り､パ ッケージング細胞 に導入 した結果､高 力価 のウイルス産生細胞 を6系統樹立す る事がで きた｡それぞれのクロー ンが産生す るウイルスを 細胞 に感染させ､さらに RAG-1､RAG-2をそれ ら の感染細胞 に一過性 に導入 した ところ､ウイルス 感染細胞 の発現するタ ンパ クが､DsREDか らEGFP に変化す るクロー ンを2系統選択す ることができ た｡ また､ ビプラ トームを用いて作製 した胸腺 の 組織断片 に､ウイルスを感染 させた場合､赤色蛍 光 を発す る細胞 と共 に緑色蛍光 を発す る細胞 も検 出す る ことができた｡今後 は作製 したウイルスベ クターを用いて､)'nvI'voや 1.nyI'tTOにおいてRAG 発現細胞 の検 出 ･単離や抗原特異性 の解析等 を行 って いく予定である｡ 一般講演 (2) プ リオ ン窯 自ペプチ ド(PrplO6-126)によって ラッ ト下垂体 由来細胞株GH3に誘導 され る 細胞死の形態学的および生化学的検討 山下摂1･2)､久保正法2)､横 山隆2)､三浦克洋2) (I)元科学技術振興 事業団 .･科技特研究員､岡山 大学農学部 2)農林水産省 ･家畜衛生試験場 (覗 特別行政法人 ･動物衛 生研究所)) [目的】 ヒツジやヤギのス ク レイ ピー､ウシの海 綿状脳症 (BSE)および ヒ トの Creutzfeldt-Jakob 柄 (CJD)な どのプ リオ ン病 は､共通 の脳症 をき た して死 に至 る伝達性の神経変性疾患である｡本 病は､正常型 プ リオ ン蛋 白 (PrPC)が､異常型 プ リオ ン蛋 白へ と構造変換 を起 こす ことが原因 とさ れ､異常型の蓄積やアミロイ ド様変性および空胞 変性や グリオ- シスな どによって特徴づ けられるO 近年 ､ス ク レイ ピー プ リオ ン蛋 白 (PRPSC) を用 いた実験 において､1'D YJ'voおよび 1'D VL'lI･0で ともにアポ トー シス様細胞死が誘導 されると報告 されている｡ この ことは､プ リオ ン病 における神 経細胞死 にアポ トーシスが関与する ことを示唆 し ている｡ さ らに､ ヒ トPrPCのアミノ酸残基 106 か ら 126番 目に相 当す る配 列 の合 成 ペ プチ ド (PrPIO6-126)は､)'L7VL'tl･0にお いて神経細胞 に対 し毒性 を有 し､この商域が プリオ ン病発症 に 深 く関与す る ことが示唆 されている｡そ こで本研 究では,合成ペプチ ドPrPIO6-126によって神経 系の細胞 に誘導 される細胞死の特徴 を明 らかにす るため､ ラッ トおよび ヒ トの PrPIO6-126を合成 し､GH3細胞 に誘導 され るアポ トー シス様の細胞 死 におけるDNA断片化､形態学的および生化学変 化 について検討 した｡ [材料 と方法 】 ペ プチ ドには ラ ッ トお よび ヒ ト のPrPIO6-126(RatPrP106-126)､HuPrPIO6-126) および HuPrPIO6-126のアミノ酸配列 を無作為 に 並べ替えたペプチ ド(SCR)の 3種類 を合成 し用い たO また､HuPrPIO6-126 と同様 の機序 で細胞死 を誘導す ると報告 されているカル シウムイオ ンチ ャンネル ブロッカーの nicardipine､およびアポ トー シス誘導剤 として トリコテセ ン系マイ コ トキ シンのフゼ レノン‡(
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を用 いた｡株下細胞 に は､成長ホルモ ン分泌 ラッ ト下垂体腺腫細胞 由来 のGH3細胞 を実験時に無血清培地で培養す ること で用いた｡DNA断片化 はアガロースゲル電気泳動 で検 出 し､アポ トー シスの指標 とした｡形態学的 観察 は､光学および電子顕微鏡 を用 いてお こなっ た.生化学的検討 は､カスバ-ゼ活性 の測定およ びカスパーゼ阻害実験 によってお こなった｡カス パーゼ活性は､caspase-3､-8および-9について 測定 した｡カスバ-ゼ阻害実験 は､カスパーゼ フ ァ ミ リー を広 く阻害す るZ-VaトAla-Asp-(owe) -CH2F(Z-VAD-fmk)お よ び ZIAsp-CH2-DCB(Z-Asp)を用 いてお こな った｡
【抵果】RatPrP106-126は､ ラッ ト由来の GH3細 胞 に DNA断片化 を誘導 し､HuPrPIO6-126の DNA 断片化 誘導能 と違 いのな い ことが確 認 された｡ prplO6-126および nicardipine処理 による GH3 細胞 の DNA断片化 は､24時間か ら 96時間の曝露 まできわめて緩慢 に進行 した｡ しか し､アポ トー シス誘導剤である F‡処理では､8時間か ら 16時 間の短 い曝露時間で DNAの断片化が強 く認め られ た｡光学および電子顕微鏡 による観察 において､ prplO6-126で処理 した細胞 には核 の濃縮 が高頻 度 に出現 したが､核 の断片化 は認め られなか った｡
これ に対 し､nicardipine処理では核の濃縮 と低 頻度 な核 の断片化 ､F‡処理で は高頻度な核 の断 片化 のみが認め られた｡生化学的検討 において､ PrPIO6-126処理で､GH3細胞 の caspase-3､-8お よび-9は活性化 が認 め られ なか った｡ また､カ スバ-ゼ阻害剤 も､PrPIO6-126処理 による GH3 細胞 の DNA断片化 を全 く阻止 しなか った｡一方､ nicardipineおよびF‡処理は､GH3細胞 にカスパ ーゼ活性 の上昇 を誘導 した｡PrPIO6-126ペプチ ドは､nicardipineおよび F‡とは異な り､GH3細 胞 にカスパーゼ非依存症のアポ トー シス様細胞死 を引き起 こし､細胞 の形態 にも違 いが認め られた｡ 一般講演 (3) トレハ ラーゼノ ックアウ トマウスの作出と 表現型解析 平田京子､紙谷隆志､松本修二､有安利夫､ 新井千加子､京野文代､吉賓知代､栗本雅 司 (秩)林原生物化学研究所 ･藤崎研究所 [日的]二糖類 トレハース (TH)は､大量製造法 が確立 して以来､様 々の分野で研究が行われ るよ うにな り､その機能性が明 らか にな りつつある｡ 食物成分 に対する安定化や保護作用は食品分野で､ 保湿作用等 は化粧品分野で注 目され､それ らの分 野で TH は広 く使用 されている｡我 々は､従来よ り TH の生理的作用 について興味を持ち､骨粗髭 症モデル動物 に対 して TH が骨減少抑制 を示す こ とを明 らかに した｡ しか しなが ら､そのメカニズ ムについては未だ解 明できていない部分が残 され ているO通常 の実験動物では､THをグル コース2 分子 に分解す る酵 素､ トレハ ラーゼ (THase)が 小腸 な どで発現 されて いるため､TH の生理的影 響 は限 られた範囲で しか観察できない｡そ こで､ 我 々は､THaseノックアウ トマウス (KOマウス) を作製 し､TH の生理 的作用 の研究 に役立てる こ ととした｡ [方法]マウス THaseのゲ ノム DNA配列 を解読 し, その情報を基 に構築 した targetingvectorを用 い､腫性幹細胞 (ES細胞) の相 同組み換 え体 を 得た｡凝集法 によ りキメラマウスを作製 し､その 後 2回の交配 を経て､homozygous(-/-)Ⅹ0マウス を取得 した｡定法 に従 い mRNAおよび THase酵素 活性 の検 出 を行 った｡形態 学的な観察 と して ､ THaseの主な発現部位である小腸および腎臓 の抗 THase抗体 による組織染色および電子顕微鏡での 組織細胞学的比較 を行 った｡ また､TH 負荷試験 では､THlg/kg を経 口投与 し､30､90､180分後 の血糖値 を測定 した｡
【括果】マウス THaseのゲ ノム DNAは､15個の exon と 14個の intronか ら成る ことが分かった｡THase の酵素活性 中心は exon5-exon7にコー ドされて お り､ この領域 を欠失 させ るよ うに KOマウスを 作製 した｡KO マ ウスでは､酵素活性 中心 を内在 する mRNAおよび THaseの酵素活性 はまった く検 出されなかった｡ また､成長､生殖 ､および各種 組織 の形態 に関す る異常 はみ られ なか った｡抗 THase抗体 による組織染色では､野生型マウスの 小腸上皮刷 子縁および腎臓近位尿細管上皮が強 く 染色 され るのに対 して､KO マ ウスのそれ らの部 位 は染色 されなか った｡THの経 口負荷試験では､ ヘテ ロ
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-)および野生型マウスが ともに 30分 を ピー クとした血糖値の上昇 を示 したのに対 して､ KOマウスは血糖値 の変化 を示 さなかった｡ [考蕪]THの経 口負荷で KOマウスの血糖値が変 化 しない ことは､少な くとも消化器系で TH分解 酵素 としての THaseの機能を代替す る他の分子は 発現 されていない ことを示す｡THaseの主な発現 部位である小腸や腎臓 の組織形態の観察結果 は､ THaseがそれ らの分化や発達 には影響 していない ことを示唆す るoTHaseKO マウスは､成長や生殖 には異常がな いことか ら､系統 の維持 も容易であ ると考 え られ る｡ このマウスを利用する ことで､ THの生理的作用の解 明が期待 される｡ 一般講漉 く4) これか らの動物実験施設を考える 夏 目克彦 ((秩)夏 目製作所) これか らの動物実験施設 を考 えるとき､重要 に なるであろうキー ワー ドを3つ挙 げたい｡その第 一は､ますます多様化 して行 くであろう実験内容 や実験方法 に対応す る為の､フ レキ シイビリティ 二 であろうC2つ 目としては動物福祉 にどこまで 配慮できるかであろう｡さ らに､3つ 目には､広い意味での､環境衛生 という言葉 を挙 げておきた い｡ ◎ フ レキ シイビリティ まず､動物種の変化 に､ どう対応す るかが､問 題 になって来 るだろう｡ある時はマウスがやた ら と増え､またある時はラッ トが多 くなる というよ うな事態は､今 まで以 上に増えるのではないか と 思われ る｡ また､ブタを始め､今 まであま り使われなかっ た新たな動物が使われるよ うになる可能性 も大い にある｡ 次 に微 生物学的 レベルへの対応が考 え られる｡ 多 くの施設が信頼できるブ リー ダーか らの
