ジャム及びマーマレード中のソルビン酸の高速液体クロマトグラフィーによる迅速定量

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(1)横浜国大環境研紀要11：47−51（1984）. ジャム及びマーマレード中のソルビン酸の高速液体. クロマトグラフィーによる迅速定量 A HighPerformance Liquid Chromatography fbr Rapid Determination Of Sorbic AcidinJam and Marmalade. 後藤由里＊・梁祖瑞＊＊・猪子正憲＊・松野武雄＊ YuriGoTO＊，Zu Yu LIANG＊＊，MasanoriINOKO＊. and Takeo MATSUNO＊. SynopsIS ArapidandsimplemethodfbrthedeterminationofthesorbicacidandsorbatesinJam andmarmaladewasstudiedbymeansofhighper払rmanceliquidchromatography．. Bythismethod，tediouspretreatmentssuchasextractionandfiltrationwereomittedso that the time required for analysis could be within30min．Halfofthe examined non− preservejamsandmarmaladescontainedlessthan500mg／kg ofsorbicacid，butpreserve. JamS did not containit．. 魚肉乾製品及び漬物等で1g／kg以下，ジャム，ケチャ 1・緒. 食品にほ悪変防止，加工改質，噂好増進，栄養強化などの目的で，食品製造の過程で食品添加物が混入さ. ップ等でほ0．5g／kgと規制されている。ところで食品中の食品添加物を分析するにあたって. は，いかに迅速簡易に分析するかが問題となる。ソル. れることがある。悪変防止の目的で添加されるもの. ビン酸及びその塩類の分析法は，従来から数多く報告. ほ，防虫剤，殺菌剤，保存料及び酸化防止剤がある。. されており，“衛生試験法”や“0疏cialMethods of. このうち抗生物作用を有し，微生物の繁殖を抑制する. Analysis”などでは，次のような方法が述べられてい. ため使用される保存料として，ソルビン酸，安息香酸，. る。. プロピオン酸，デヒドロ酢酸が許可されているが，ソ. ① 薄層クロマトグラフィーによる定性分析. ルビン酸ほ微生物阻止作用が強く，安全性も高いため. ② 紫外部吸収スペクトルによる定性及び定量分析. 多くの食品に使用されている。. ③ ガスクロマトグラフィーによる定性及び定量分. わが国では，ソルビン酸のほかその塩類であるソルビン酸カリウムの使用も許可されている。なお，わが. 析. いずれの場合も煩雑な前処理が必要であり，分析に. 国のソルビン酸及びソルビン酸カリウムの使用基準. 時間がかかるほか，多量の溶媒の使用，誘導体化など. は，何れもソルビン酸として表示されており，魚肉ね. 問題点が多い。これに比べ，Nelson等1）によって報告. り製品等は2g／kg以下，くん製品で1．5g／kg以下，. された高速液体クロマトグラフィー（High Perfbr− manceLiquidChromatography，以下HPLCと略記. ＊横浜国立大学環境科学研究センター環境計測工学研究室. する）を用いた甘きつ類中のソルビン酸の分析ほ，分. DepartmentofEnvironmentalMonitoringTech−. 析の簡易化の点で大きな前進をもたらした。また上田. nology，InstituteofEnvironmentalScience and. 等2）は，固形試料や懸濁試料をpH9．2緩衝溶液で抽. Technology，Yokohama NationalUniverslty，. 240 Yokohama ＊＊現在：中国軽工業省食品発酵研究所 atpresent：FoodandFermentInstitute，Minis−. tryofLightIndustry，China．（1984年6月 30日受領）. 出した後に，グラスファイバーフィルターでろ過あるいは遠心分離したろ液あるいほ上澄液をさらにメンブ. ランフィルターでろ過し，HPLCで定量した。簡易な物理的操作ではあるが，やはり抽出操作を必要として. いる。以上述べたように，固形物あるいは懸濁状物質.

(2) 48. については何らかの形で前処理を必要としている。そ. 3A型，検出器：紫外分光光度計SPD−2A型，記録. こで筆者等は，固形物試料中のソルビン酸及びその塩. 計：クロマトパックCR−1A型，ホモジナイザー：（株）. 類の迅速分析法を検討することにした。分析対象試料. 国産遠心器H−100−D型，シェーカー：（株）常盤製作. としては，下記に示す理由からジャム及びマーマレー. 所製TS式. 2．4．HPLC条件. ドを選んだ。. ① ジャムは果実の果肉に砂糖を加えて煮沸，濃縮. 分析カラム：ZORBAX ODS（5FL，150×4・6mm），. したものである。主としてリンゴ，アンズ，イチゴ及. 移動層：水（pH＝2．2リン酸）一メタノール＝1：1・76，流. びブドウ等が材料となるが，これら果実中に含まれて. 速：0．8ml／min，検出波長：258nm，感度：0・08∼0・16. いるペクチンと，酸及び糖質によりゼリー化されたも. AUFS，カラム温度：室温. のである。したがって，糖度も60∼70％と高く，pH. 2．5．試験溶液の調製. も 3．4∼3．8 とそのままで保存性はかなり高い。. しかし価格を安くするため製品中の果実分を低く. 1）non preserveスタイルのジャム：試料5・Og. を50mりと色管に正確にはかり取り，600C，40mJ温. し，寒天を添加したり，糖分を少なくしたものもあり，. 水を加えシェーカーで15分間振とうした。試料が常. それらには多くソルビン酸及びその塩類が保存料とし. 温になったところで蒸留水を加え全量を50mJとし，. て添加されている。一方，マーマレードも同様に果汁. 手でよく振り混ぜた後，10分間放置し，ジャム中に混. を絞ってゼリーをつくり，それに果肉または果皮の薄. 入している果皮，栗毛及び種子等を沈殿させた溶液を. 片を混入したものである。. 試験液とした。. ② 一方，ジャム及びマーマレード中のソルビン酸. 2）preserveスタイルのジャム及びマーマレード：. を定量する方法ほ，現在のところ見当らない。また固. 試料約40gを採取し，10，000r・p．m・でホモジナイザ. 形物中のソルビン酸を分析するには，前にも述べたよ. 一に5分間かけた後，ホモジナイズした試料5gを. うに煩雑な前処理を必要としている。. 50mJ比色管に正確にはかり取り，以下1）と同様の操. そこで，本報文でほ試料を抽出，ろ過，遠心分離等. の諸操作を行うことなく，直接分離定量する方法を新たに開発することを目的とした。. 作を行った。 3）回収率：試料1．00g当りソルビン酸カリウム. 500〃gを添加した場合の回収率は，前述の1）及び2）の操作での温水を20m＝旧え，シェーカーで15分間. 2．実. 験. 振とうした。冷後，蒸留水を加え全量を25mJとし，. 2．1．試薬及び試料. 標準液（ⅠⅠⅠ）25m仁を加え全量を50m仁にした後，十. 酸化防止剤としての試薬ほ，東京化成製試薬特級ソ. 分に振り混ぜた。以下1）と同様の操作を行った。試. ルビン酸，ソルビン酸カリウム及びソルビン酸ナトリ. 料1．00g当りソルビン酸カリウム100〃g添加した場. ウムの3種類を用いた。試料としてほ，国内及び外国. 合の回収率は，前述の1）及び2）の操作での温水を. で市販されている12種類のジャム（イチゴ，キウイ. 30mJ加え，シェーカーで15分間振とうした。試料が. 及びアンズ）及び5種類のオレンジマーマレードを用. 常温になったところで蒸留水を加え全量を45m7とし，標準液（ⅠⅠⅠ）5m仁を加え全量を50m7にした後，. いた。. 2．2．標準溶液の調製. ソルビン酸100mgを精秤し，1Jメスフラスコに移し，ついでメタノールで1000mJにメスアップした。以下この溶液を標準液（Ⅰ）とした。また，精秤したソ. 十分に振り混ぜた。以下1）と同様の操作を行った。 2．8．HPLC系におけるソルピン酸及びその塩類の最大吸収波長. 検出器の波長を2∼5nmずつ，200nmから300nm. ルビン酸カリウム100mgのそれぞれを2つの1Jメ. まで設定し，標準液（Ⅰ），（ⅠⅠ），（ⅠⅠⅠ）及び（IV）5〆. スフラスコに移し，1つはメタノールで，他は蒸留水. をHPLCに注入した。. でそれぞれ1000mJにメスアップした。ソルビン酸カリウムをメタノール中に溶解したものを標準液（ⅠⅠ），蒸留水中に溶解したものを標準液（ⅠⅠⅠ）と以下称す. る。ソルビン酸ナトリウムについても精秤した100 mgを1Jメスフラスコに移し蒸留水で1000mJにメスアップしたものを標準液（IV）とした。 2．3．装. 置. 高速液体クロマトグラフ：（株）島津製作所製LC一. 2．丁．HPLCによる定量. 2．4．に記した条件で分析した。なお，定量は標準液（ⅠⅠⅠ）とのピーク面積比により行った。. 2．8．ソルピン酸及びその塩類の定量ソルビン酸の含有が認められたジャム 5g を 2・5．. の方法で調製した。つぎにこの試料をイオン交換樹脂 IRA402を充填した内径10mm￠，長さ30cmのクロ. マト管中に通じ，この流出液5FLlをHPLCに注入し.

(3) 49. ︵ご空l吾巾︶巾聖句葛巴. L＿−∴− （1） ●＋¶. ⊂. 二：. パ. し＿J」＿＿＿＿（3）. 5min. 5 minn. Fig．2．Chromatograms of severalkinds of. jams and marmalade（In three kinds of 200. 250. SamPles except jam（L），SOrbic acid was. 300. WaVelength（nm）. COntained．）. −○−：SOrbicacid（inmethanol） −△−：POtaS9umsorbate（inwater）「▲−：匹）lasslum SOrbate （inmethanol） −ロー：SOdiumsorbdte（inwater） Fig．1．Absorption wavelength：わr sorbic. acid，POtaSSium sorbate and sodium sor−. （1）：StraWberryjam（D），（2）：kiwijam（H），. （3）：StraWberry jam（L），（4）：marmalade （P）．. −COOH：ス＝210nm付近の弱い吸収（3）. CH3（CH＝CH）2CHCOOH lmax＝258nm（4）（4）式に示されるようにソルビン酸は共役ジュン結. 合を持っているので少なくともス＝217nm以上の波. bate．. 長を呈すると考えられる。一方，（3）に示すようにカた。また，標準液（ⅠⅠⅠ）についても同様の操作を行っ. ルポキシル基の波長はス＝210nm 付近の弱い吸収で. た。. ある。そこで，本実験に用いた258nmの吸収波長ほジュン結合にカルポキシル基の簡素の打電子が共役. 3．結果及び考察. したことよりさらに長波長側にシフトしたことによっ. 3．1．HPLC測定条件の検討. て生じたものであると考えられる。このことは1，3−ブ. タジュンにさらにCH＝CHを共役した（2）に示され. 現在までに報告されたHPLCによる分析法でほ，. る化合物はスmax＝268nmに持っていることからも裏. カラムモードとして逆相分配クロマトグラフィーとゲルバーミ. ューシ. ョンクロマトグラフィー（GPC）があ. 付けられよう。. る。GPCは高価であり日常分析にほあまり適して. また，Fig．1に示したソルビン酸及びその塩類で. いないと考え，汎用性があり一般に用いられている. スmaxが異ならないのは，HPLCの移動相が酸性なの. ZORBAX ODS4．6mmIDx15cmを採用した。移. で，カラム入口部分で迅速にソルビン酸に移行してし. 動相の組成は蒸留水とメタノールからなり，その蒸留. まうと考えられる。また，このことはソルビン酸及び. 水に対する体積比を1．76 とし，リン酸を用いてpH. その塩頬の保持時間が3．1分で殆んど異ならないこと. を2．2に調製し移動相の速度を0．8mJ／minとした場. からも裏付けられよう。. 合，ソルビン酸のピークがシャープとなることが判っ. 3．2．市販ジャム及びマーマレードの定量. た。上述の条件におけるソルビン酸及びその塩類の保. 定量に先立ってnon−preSerVeスタイルのジャム. 持時間は3分前後で早くも遅くもないことから，上述. （A）を用いて，メチルアルコール，エチルアルコール，. の条件を分析条件として採用した。. ヘキサン，水及び600Cの温水に対する溶解能を調べ. つぎに，ソルビン酸及びその塩類の吸収波長をFig．. たが，ジャム中のペクチンほ上記の何れの有機溶媒に. 1に示す。Fig．1から判るように何れのソルビン酸及びその塩類の最大吸収波長は258nmに存在すること. も溶けなかった。また，ペクチンほ水に対しても難溶で，30分の振とう時間でも未溶解の部分が残ってい. が判った。この最大吸収波長が分子のどのような構造. たが，温水には容易に溶解した。そこで温水がジャム. から由来するかを以下の様に考察した。. の溶剤として最適であることが判り，以下本実験では. H（CH＝CH）2Hlmax＝217nm. （1）. H（CH＝CH）3H スmax＝268nm. （2）. 溶剤として600Cの温水を用いることにした。. ジャムを温水で処理した試験溶液をHPLCに注入.

(4) 50 TabIel．Concentration ofsorbic acid，pOtaS−. siumsorbateandsodiumsorbateinvarious jam and marmalade. malade. Concentration or. Sample. C，. PreSerVatives （％）. Recovery （％）. つJ つJ. 7. つJ 4. 4. 1. 0 1. つJ ‘U. l つJ. 2 0ノ l 1 7 2 つJ 00 1 4 7. 2 4 つJ. 値500mg／kg以下，または検出下限界以下であった。 Table3に示される10試料のCv値は1試料を除い. 2 2 5 ′ん U. 5. に供せると思われる。. 4. マーマレード5種いずれのソルビン酸含有量も許容. 7. 1. 1 2. ら判るように，国産ジャム6種，外国産ジャム6種，. であり，開発した分析法は迅速分析法として十分実用. 5. つJ. 酸含有量を求めた結果をTable3に示す。Table3か. 体を通して回収率は略々100％，Cvほ1∼7％の範囲. nフ. 108 98．2. 99．4. ∠U. 1. （Q）. 106. 試料1．00g当り100／Jg添加した場合の回収率が. 7. Orange. 5. （P）. つJ. （0）. Orange. 1. Orange. っJ. 5％，6試料が100％±10％以内，1試料が80％であ. 91．6. ′﹂U. （N）. 4. （M）. 99．7. Cv （％）. 2. ︵. ︶. Orange Orange. つぎに，市販ジャム及びマーマレード中のソルビン. ′﹂U. ︵. ︶. （K）. た Table2 において回収率は8試料について100±. 500〃g添加したそれと比較して余り良好でないが，全. 4. ︵. ︶. E二F. （J）. 準偏差Cv値は3試料を除いて5％以下であった。ま. った。Cv値は2試料を除いて5％以下であった。. つJ一〇ノ ▲qノ 0 q／ ∩フ ▲フ 1. ︵. ︶. H I. ︵. ︶. G. ︵. 102. D. 10％以内であった。また，同一試料5検体における標. 102 105 102 98．5 94．3 102 104 100 99．8. ︶. 5％以内であったが，その4試料についても100％±. StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry kiwi aprlCOt PreserveJam StraWberry StraWberry Marmalade. ︵. Tablelにおいて4試料を除いて回収率は100％±. Sけawberry. ︶. 合の回収率をTable2に示す。. NonpreserveJam StraWberry. ︵. を添加して回収率を求めた結果を Tablelに，試料 1g当り100／瑠のソルビソ酸カリウムを添加した場. 1. （％）. ︶. OアQ. つぎに，試料1g当りソルビン酸カリウム 500／増. 5. Recovery ︵. N. いて分析が十分にできることを示している。. 4 つJ. Sample. AおC. M. 温水でジャムを処理した試験液に対してHPLCを用. 4 0 1 1 1 5 2 1 1. つJ. malade. ︶. ︵. のについてほ，ピークほ生じていない。このことは，. 3 nフ 2 nフ l ′b 2 5 3 ‘U 007. l. 1. Table3．Recoveries（％）ofpreservatives ad− ded atlevels of500FLg／g tojam and mar−. 示されるように，保存料を含むものについては，ソルビン酸の保持時間にピークが生じており，含まないも. つJ. 1. ︶︶︶︶ I K L ︵︵︵︵. ．1．7一．8．4. 0. （M）（N）（0）（P）（Q）. 4. 1 0 1 0 0 1 1 1 1 1. 1. 一一一. Marmalade Orange Orange Orange Orange Orange. 102 80．6 4. 00つん05. ′h﹀ ∧U. aprlCOt. PreserveJam StraWberry（）） StraWberry（K）. 106 98．2 107 103 102 94．4 103 95．0 93．6. Cv （％）. ︵U 2 0 5 つJ Oノ 0 つJ 1 5 つJ. kiwi. A B C D E F G H I. NonpreserveJam StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry. ︵︵︵︵︵︵︵︵︵. 1 2. ︶. した場合のクロマトグラムをFig．2に示す。Fig．2に. 00ノーJnフ54 ．2．9一．〇．2一．4．9一. 2 2. ︶︶ G H I ′llヽ︵︵. ︶. D D D40月18 N N N 4031N2925. F. N．D．：nOt detected．. ・′LU 48。監267荒37．荒. E. Orange. D. Orange. C. Orange. ︵︵︵︵︵︵. Orange. ︶︶︶︶︶︶. Orange. ︶︶︶ A B ︵︵︵. StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry StraWberry kiwi aprlCOt Preserve Jam m StraWberry StraWberry StraWberry Marmalade. Sample ︶︶︶︶︶︶︶︶︶. （mg／kg）. NonpreserveJam. Table2．Recoveries（％）ofpreservatives ad− ded atlevelsoflOOFLg／g tojam and mar・.

(5) 51 ラム圧力が高くなった。しかしソルビソ酸の保持時間. は異ならなかった。そこで高圧によるカラムの劣化を防ぐという意味で，カラム圧力が180kg／cm2になったところで新しいフィルターと交換した。汚れたフィルターはメタノール中に浸漬し超音波洗浄して再使用. StraWberryjam（A）A） IRA 402 resin Fig．3．Identification ofsorbic acid by uslng ionexchangeresin．. できることも併せて確認した。. ヰ．総. 括. （1）ジャム及びマーマレード中に保存料として添加されるソルビン酸及びその塩類の定量分析ほ従来，. 抽出等の煩わしい前処理が必要であった。そこで本研. て何れもたかだか3％以下であったことから，分析値. 究では試料を直接分離定量する方法を検討・開発し. の再現性は良いと思われる。. た。. ソルビン酸及びその塩類の同定方法としてイオン交. 換樹脂IRA402を用いた結果をFig．3に示す。Fig．. （2）分離にはとくに高速液体クロマトグラフィー. （HPLC）を用い，検出器にほ紫外吸光光度計を用い. 3から判るように，ソルビン酸を含んだジャムの試験. た。HPLCの移動相には水とメタノールを1：1．76の. 液をIRA402陰イオン交換樹脂を貫流させて得た流. 体積比にし，PHを2．2に調節したものをZORBAX−. 出液からのクロマトグラム上にはソルビン酸のピーク. ODSカラムに0．8ml／minの流速で通じ258nmの波. は不検出であり，木方法はソルビソ酸の同定に用いる. 長で測定した。. ことが可能なことが判った。つぎに，ジャム中のソルビン酸ほ開封後どのような挙動を示すか調べた。ジャム（A）について開封直後. （3）試料の中，nOn−PreSerVeスタイルはそのまま，果実の残っている PreSerVeスタイル及びマーマレードについてはホモジナイザーで均一にした後用. 及び開封90日後のソルビン酸含有量は480mg／kgで. いた。試料の調製は溶剤に600C温水を用い，10倍に. あったものが90日後では431mg／kg迄に減少した。. 希釈，振とうした後，放置しその上澄液を採取し，. このことほジャム中に添加されているソルビン酸がジ. HPLCへ注入した。. ャムの劣化を防く、、ため消費されることによると考え. （4）定量にあたっては100mg／Jソルビン酸カリ. た。したがって，ソルビン酸含有量の測定は開封直後. ウム水溶液をHPLCへ注入して得たクロマトグラム. に測定することが望ましいことも判った。. のピーク面積と試料のピーク面積との比により添加さ. また，本分析法の定量下限界を明らかにするため以下の実験を行った。すなわちHPLCに注入できる. れているソルビン酸量を求めた。. （5）その結果，実測した市販ジャム及びマーマレ. 試料溶液ほ10〃Jで，また吸光光度計の最大感度を. ード中のソルビン酸含有量は何れも許容値の500mg／. 0．005AUFSに設定して，ノイズピークの3倍のピー. kg以下，または検出下限界以下であった。. クを定量下限界のピークと見なした場合，ジャム中のソルビン酸濃度 2．5mg／kg が検出下限界であると考. リウム，ソルビン酸ナトリウムの区別は不可能である. えた。. が，法的規制はソルビン酸量として示されているので. つぎに，本実験は何ら遠心分離や抽出操作等をしないで良好なHPLCのタロマトグラムを得ることがで. 区別の必要ほないと思われる。. きた。この原田ほ，本実験に使用したカラム入口に2. 範囲であり，木方法は実用に供せるものと思われる。. 〃mのフィルターが取りつけてある。実験にあたり試. （6）開発した方法でほソルビン酸，ソルビン酸カ. （7）回収率ほ略々100％でCv値は1．1∼7％のまた，開発した方法では分析所要時間は，諸操作を. 料中に不純物があることほ先に述べたが，これらの不. 含め30分以内であり，また分析下限界も2．5／瑠／gと. 純物は沈殿させ，上澄液をHPLCに注入した。しか. 比較的低く，迅速定量分析法として非常に有効である. し肉眼観察できない不純物はHPLCに注入されたが，. ことが判った。. 本実験では定量を簡略化するため，このカラムにある. 文. 献. フィルターを利用して不純物のカラム内への流入を防. いだ。この方法はクロマトグラムに対して何ら影響を及ぼさず，分析の迅速化に大きく寄与した。なお試料を多数注入した場合，次第にフィルターが日詰りしカ. 1）G．L．Park＆D．B．Nelson，JournalofFood Science，46，1629（1981）． 2）上田雅彦，間崎真典，食品衛生学雑誌，1＄，278 （1977）．.

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