持久的走行トレーニング初期段階における骨格筋の脂質代謝関連酵素活性の変化過程

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(1)Title. 持久的走行トレーニング初期段階における骨格筋の脂質代謝関連酵素活性の変化過程. Author(s). 鈴木, 淳一; 平塚, 勇介; 東浦, 拓郎. Citation. 冬季スポーツ研究, 7(1): 9-14. Issue Date. 2004-10. URL. http://s-ir.sap.hokkyodai.ac.jp/dspace/handle/123456789/6775. Rights. Hokkaido University of Education.

(2) 冬季スポーツ研究第 7 巻 1 号 9-14, 2004 （北海道教育大学冬季スポーツ教育研究センター紀要）. 持久的走行トレーニング初期段階における骨格筋の脂質代謝関連酵素活性の変化過程鈴木淳一 1)、平塚勇介 2)、東浦拓郎 3) 北海道教育大学冬季スポーツ教育研究センター1)、北海道教育大学教育学研究科 2)、筑波大学大学院博士課程人間総合科学研究科 3) Time-course changes in citrate synthase and 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase activities in soleus muscle of young treadmill-trained rats Research and Education Center for Winter Sports1), Graduate School of Education2) Hokkaido University of Education, 5-3 Ainosato, Kita-ku, Sapporo, Hokkido 002-8502, Japan. Graduate School of Comprehensive Human Sciences, University of Tsukuba, Tennodai, Ibaraki 305-8577, Japan Abstract This study was designed to examine the time-course changes in citrate synthase (CS) and 3hydroxyacyl-CoA dehydrogenase (HAD) activities during endurance training by running in young female Wistar rats. Exercise training by running started at the age of 5 weeks and lasted for 5 weeks at 25 m/min on a 25% grade, 10-60 min/day. Enzyme activities were observed in the soleus muscle. The soleus muscle weight and its weight-to-body weight ratio were significantly greater in the training group than in the sedentary control group at Week 5 and Weeks 3 and 5, respectively. Training significantly increased the HAD activity by 30%, 29% and 37%, respectively, at Weeks 3, 4, 5. The CS activity was significantly increased in training groups by 35%, 47% and 47%, respectively, at Weeks 3, 4, 5. The HAD-to-CS ratio (HAD/CS) remained unchanged throughout the experimental period. These results suggest that it takes at least 3 weeks of intensive training to cause adaptive changes in fatty acid utilization in slow twitch muscle. Similar time-course changes in CS and HAD may contribute to effective fatty acid utilization in muscle cells. Key words: citrate synthase; endurance training; 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase; skeletal muscle. 緒言有酸素運動時では、エネルギー基質として主に血中グルコース、筋グリコーゲン及び脂肪酸が利用される。近年、その優れた効率性や有用性の高さから、脂質代謝能力が持久力の指標としてが注目されている。ヒトの研究では、脂肪酸のエネルギー貢献率は低強度運動時では約 90 ％、中等度運動時では約 65 ％であることが知られている。また、長期間の持久的トレーニング後に、エネルギー基質として脂肪酸の動員が増大することが知られている [3,6,9-11]。脂肪酸のβ酸化はミトコンドリア内で行われ、その後有酸素的に ATP が生成される。この脂. 肪酸β酸化系の律速酵素である 3-ヒドロキシアシル-CoA 脱水素酵素（HAD）の活性は、長期間の持久的トレーニング後に増大することがこれまで多くの研究で報告されている [3,6,9-11]。しかし、トレーニング初期段階における HAD 活性の変化過程に関してはほとんど研究されていない。Cheng ら[4]は、Long-Evans 系雄ラットを用いて高脂肪食摂取と自発走運動を 6 週間行い、ヒラメ筋の HAD 活性の変化過程を観察した。その結果、高脂肪食摂取群では HAD 活性が漸増したが、通常食摂取群では HAD 活性にほとんど変化がみられなかったと報告している。Henriksson ら [7]は、New Zealand White. 9.

(3) 鈴木淳一、平塚勇介、東浦拓郎. Rabbit を用いて速筋である前脛骨筋に 10Hz、 24h/day の条件で電気刺激を 10 週間行い、HAD 活性の変化過程を観察した。電気刺激開始 1、 2、3、5、8、10 週後、それぞれ HAD 活性の値を測定した結果、いずれも 0 週時（電気刺激開始前）より高い値を示し、3 週後が最高値であったと報告している。しかしながら、高強度の持久的走行トレーニングを行うと、その初期段階でどのように脂質代謝能力が改善されていくのか、その変化過程を観察した研究はこれまで報告されていない。そこで本研究では、ラットに高強度の持久的走行トレーニングを 5 週間負荷し、1 週間毎の骨格筋 HAD 活性の変化過程について明らかにすることを目的とした。実験方法 1.実験動物実験には 3 週齢の Wistar 系雌ラット 54 匹を用いた。2 週間飼育室の環境に慣らした後、 5 週齢時に安静コントロール（Cnt）群 25 匹、トレーニング（Tr）群 29 匹の 2 グループに分けた。すべてのラットは室温 24±1 ℃、相対湿度約 50 ％、12 時間の明暗周期の環境下で飼育し、飼料（日本クレア／CE-2）と水道水を共に自由摂取させた。 2.運動負荷 Tr 群のラットには、ラット用トレッドミル（KN-73／夏目製作所）による持久的走運動を負荷した。トレーニングは 5 週齢時に 25 m/min、10 min、勾配 25 ％の条件で開始し、60 min になるまで 3 min/day の割合で運動時間を漸増させ、週 5 日の頻度で 5 週間負荷した。 3.筋標本トレーニング開始 1、2、3、4、5 週後、それぞれペントバルビタール麻酔下（50 mg/kg）のラットからヒラメ筋を摘出し、湿重量を秤量した。筋のサンプルは、液体窒素で瞬間凍結後、 −80 ℃で冷凍保存した。 4.酵素溶液の調製筋のサンプルは−25 ℃下で微粉状にし、5 mM β-mercaptoethanol、0.5 mM EDTA、0.02 ％ bovine serum albumin（BSA）を含む 20 mM phos-. 10. phate buffer（pH7.4）を用い、ポリトロン型ホモジナイザーで氷冷下でホモジネート（15,000 rpm、15 sec×2）した。そして、0 ℃、13,000 g で 15 分間遠心分離した後、その上澄み液を酵素溶液として、酵素活性の測定まで−80 ℃で冷凍保存した。 5.酵素活性の測定 3-ヒドロキシアシル-CoA脱水素酵素（HAD, EC 1.1.1.35）活性の測定には Bass ら[1]の方法を用いた。酵素溶液に、5 mM EDTA、0.45 mM NADH を含む 100 mM triethanolamine-HCl buffer （pH 7.0）を加え、25 ℃の温水中に 10 分間静置し温度平衡に達した後、0.1 mM acetoacetylCoA を添加して反応を開始させた。反応開始後 5 分間にわたり分光光度計を用いて 340 nm にて吸光度の変化を測定した。 Citrate Synthase（CS, EC 4.1.3.7）活性の測定には Srere [13]の方法を用いた。酵素溶液に 1 mM DTNB、10 mM acetyl-CoA を含む 0.1 M Tris-HCl buffer（pH8.1）を加え、25 ℃の温水中に 10 分間静置し温度平衡に達した後、10 mM oxaloacetate を添加して反応を開始させた。反応開始後 5 分間にわたり分光光度計を用いて 412 nm にて吸光度の変化を測定した。 6.統計処理すべての値は平均値±標準誤差で示した。すべてのデータはまず、Kormogorov-Smirnov 検定によって正規性の検定を行ない、正規分布していることを確認した。2 群間の比較にはStudent の t 検定を用いた。また、各群の経時変化の検定には一元配置分散分析及び Fisher の post-hoc テストを用いた。検定結果は危険率 5 ％未満を有意水準とした。実験結果表 1 にトレーニング期間中の体重、ヒラメ筋重量及びヒラメ筋重量/体重比の値を示した。体重は、第 3 週において Tr 群の値が Cnt 群より有意に低い値を示したが（P<0.05）、他の週では変化がみられなかった。経時変化では、両群ともに週毎に増加が認められた。ヒラメ筋重量は、第 5 週において Tr 群の値が Cnt 群より有意に高い値を示した（P<0.05）。経時変化で.

(4) トレーニングによる HAD 活性の変化過程. 高い値を示した（P<0.05）。考察. は、両群ともに漸増していた。ヒラメ筋重量/ 体重比は、第 3、5 週において TR 群は Cnt 群より有意に高い値を示した（P<0.05）。経時変化では、両群ともに 5 週間通してほぼ一定の値を示した。図 1 に、HAD 活性（U/g tissue）の変化過程を示した。HAD 活性は、第 3、第 4、第 5 週において、 Tr 群が Cnt 群よりもそれぞれ約 30 ％、 29 ％、37 ％有意に高い値を示した（P<0.05）。 TR 群の経時変化では、第 1 週に対して第 3 週以降有意に高い値を示した（P<0.05）。Cnt 群では、第 1 週から第 5 週まで緩やかに漸増したが、有意差は認められなかった。 CS 活性は Tr 群が Cnt 群より第 3 週で約 35 ％、第 4 週で 47 ％、第 5 週で 47 ％有意に高い値を示した（P<0.05；図 2）。Tr 群の経時変化では、第 1 週に対して第 3、4、5 週、第 2 週に対して第 3 週が有意に高い値を示した（P<0.05）。Cnt 群では、5 週間通して変化がみられなかった。図 3 に HAD/CS 比の変化過程を示した。 HAD/CS 比は脂肪酸のエネルギー貢献率を示すものである。すべての週において、両群間に有意差は認められなかった。Tr 群の経時変化では、 5 週間通してほぼ一定の値を示した。Cnt 群では、第 1 週に対して第 2、3、4、5 週が有意に. 本研究では、5 週齢の Wistar 系雌ラットを用いて、5 週間の持久的走行トレーニング期間中、ヒラメ筋における HAD 活性がどのように変化していくのか、その適応過程を観察した。トレーニング期間中、HAD 活性は第 3 週目以降に有意に増加していた（P<0.05；図 1）。これは、第 3 週目以降に脂肪酸のβ酸化が亢進され、脂質からのエネルギー供給量が増大したことを示唆している。エネルギー基質として脂肪酸の利用が増大すると、筋や肝臓のグリコーゲンが節約されるものと考えられている [8,11,12] 。Geor ら[5] は、持久的走行トレーニングを負荷した馬に高強度の持久的走運動を実施させたところ、筋グリコーゲン代謝率が減少し、トレーニング開始前よりも運動終了時の血中や筋中乳酸濃度が減少することを観察した。その結果、VO2max が増加し、疲労困憊に至るまでの時間が延長したことを報告している。こ. 11.

(5) 鈴木淳一、平塚勇介、東浦拓郎. の時間が延長したことを報告している。これらのことから、有酸素的運動能力が向上する際に、脂質代謝系の適応が密接に関与しているものと考えられる。本研究において、Tr 群の CS 活性は、HAD 活性と同様に第 3 週目以降に有意に増加していた（P<0.05；図 2）。この結果は、クエン酸回路の活発化と脂肪酸のβ酸化亢進が同時に起こったことを示唆している。β酸化によって生成されたアセチル-CoA は、クエン酸回路に入り、その後有酸素的にエネルギーが産生される。β 酸化だけが過剰に進行すると、アセチル-CoA の蓄積が生じ、細胞質からミトコンドリア内への脂肪酸の輸送が抑制されることから、脂質代謝の亢進には、クエン酸回路の活性化が不可欠であると考えられる。また、多くの先行研究で、持久的トレーニング後、HAD 活性と CS 活性が共に有意に増加していたことが観察されている [3,6,9-11]。. 12. Suzuki ら[14]は、持久的走行トレーニングを行うと、組織の酸素需要増大に対する適応として、まず毛細血管密度や C：F 比（筋線維 1 本当たりの毛細血管数）の増加が起こり、その後、酸化酵素活性（コハク酸脱水素酵素）が増加すると報告している。本研究においても、持久的走行トレーニングによって、第 1、第 2 週目に微小循環系の適応が起こり、その後第 3 週目以降に酸化酵素活性（HAD、CS）が増加したものと推察される。このことから、脂質代謝系の適応は、微小循環系の改善後に起こるものと考えられる。運動時には、血中から取り込まれた脂肪酸が内因性のものよりもより酸化されることから、毛細血管網の増加が脂質代謝の亢進に深く関与していると考えられる。 Tremblay [15]らは、ヒトを対象に、持続的走行トレーニングを負荷した群と高強度の間欠的走行トレーニングを負荷した群に分け、トレーニングが脂質代謝系に及ぼす効果を比較したところ、持続走群の運動中の総エネルギー消費量は間欠走群の約 2 倍であったにも関わらず、間欠走群の方が HAD 活性が増加し、皮下脂肪が顕著に減少していたことを観察した。この結.

(6) トレーニングによる HAD 活性の変化過程. 果から、持久的トレーニングでは、運動強度が高いほど脂質代謝系の適応を促進すると報告している。5 週齢の Wistar 系雄ラットに約 60 ％ VO2max 強度の持久的走行トレーニングを 6 週間負荷した先行研究では、ラスト 2 週間の運動時間は 120 分にも及んだが、トレーニング後、 HAD 活性の有意な増加は観察されなかった[16]。本研究では、第 1 週から第 3 週までの 1 日当たりの運動時間は 10∼52 分であった。また、本研究とほぼ同週齢で同系統のラットを用いた Brooks ら[2]の研究から、本研究の運動強度を推測すると、最大酸素摂取量の約 82 ％以上、最大心拍数の約 90 ％以上になるものと考えられる。これらのことから、運動時間は短くても高い運動強度であれば脂質代謝系の適応を引き起こすと考えられる。本研究の安静対象群では、有意差は認められなかったが、5 週間の実験期間中 HAD 活性は緩やかに漸増していた（図 1）。しかし、CS 活性にはほとんど変化はみられなかった（図 2）。また、HAD/CS 比は第２週目以降、第 1 週目に対して有意に高い値を示していた（P<0.05；図 3）。これらの結果は、通常の成長過程では、有酸素的エネルギー代謝量はほとんど変化しないが、脂質のエネルギー貢献率は成長とともに増大することを示唆するものである。本研究と同週齢で同系統のラットを用いた先行研究で、持久的トレーニング後、type IIa fiber の横断面積が増大することが観察されている[14]。この研究では、本研究と同じ運動強度のトレーニングを負荷したことから、高強度の持久的トレーニングが type IIa fiber の肥大を促進したものと考えられる。本研究では、Tr 群のヒラメ筋重量が第 5 週目に有意に増加していた。（P<0.05；表 1）また、ヒラメ筋重量/体重比も第 3、第 5 週目に有意に増加していた（P<0.05；表 1）。この結果は、本研究の持久的走行トレーニングによって、type IIa fiber 組成が約 20 ％であるヒラメ筋が肥大したことを示しており、上述した報告を支持するものと考えられる。一方、安静対象群では、5 週間通してヒラメ筋重量は緩やかに漸増していたが、ヒラメ筋重量/ 体重比には変化がみられなかった（表 1）。こ. の結果から、対象群のヒラメ筋重量の増加は、成長過程に伴う体重の増加に比例して起こったものと考えられる。本研究では、持久的走行トレーニングの初期段階において、HAD 活性がどのように変化するのか、その適応過程を明らかにすることを目的とした。その結果、第 3 週目以降に HAD 活性が有意に増加したことを観察した。このことから、本研究で用いた高強度の持久的トレーニングでは、第 3 週目以降に脂質からのエネルギー供給量が増大することが示唆された。また、 β酸化の亢進とクエン酸回路の活発化が同時に観察され、これはエネルギー基質としてより多くの脂肪酸を動員するために不可欠な適応性変化と考えられる。参考文献 1. Bass A, Brdiczka D, Eyer P, Hofer S & Pette D. 1969. Metabolic differentiation of distinct muscle types at the level of enzymatic organization. Europian J Biochem, 10, 198-206. 2. Brooks GA & White TP. 1978. Determination of metabolic and heart rate responses of rats to treadmill exercise. J Appl Physiol. , 45(6), 1009-1015. 3. Carter SL, Rennie CD, Hamilton SJ & Tarnopolsky. 2001. Changes in skeletal muscle in males and females following endurance training. Can J Physiol Pharmacol, 79(5), 386-392. 4. Cheng B, Karamizrak O, Noakes TD, Dennis SC & Lambert EV. 1997. Time course of the effects of a high-fat diet and voluntary exercise on muscle enzyme activity in long-evans rats. Physiology ＆ Behavior, 61(5), 701-705. 5. Geor RJ, McCutcheon LJ & Shen H. 1999. Muscular and metabolic responses to moderateintensity short-term training. Equine Vet Suppl, 30, 311-317. 6. Grinton S, Powers SK, Lawler J, Criswell D, Dodd S & Edwards W. 1992. Endurance training-induced increases in expiratory muscle oxidative capacity. Med Sci Sports Exerc, 24(5), 551-555. 7. Henriksson J, Chi MMY, Hintz CS, Young DA, Kenneth KK, Salmons S & Lowry OH. 1986. Chronic stimulation of mammalian muscle:. 13.

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