HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT GenomONE - Si 浮遊系免疫細胞へのsiRNA/miRNA導入データ集

(1)

浮遊系免疫細胞へのsiRNA/miRNA導入

フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

石原産業株式会社

1808GS3

GenomONE ---- Si

Si

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

(2)

GenomONE-Si

_{は、HVJ Envelope（HVJ-E:不活化センダイウイルス）を}

用いたsiRNA/miRNA専用のトランスフェクションキットで、初代培養免

疫細胞にも高効率な導入が可能です。

＜特長＞

□

□ 合成オリゴ型の

合成オリゴ型の

_{合成オリゴ型のsiRNA/miRNAの導入に最適}

合成オリゴ型の

の導入に最適

□

□ 簡便な

簡便な

簡便な操作性（

簡便な

操作性（

操作性（5

5 5～

5 ～10

～

10

10 10分で導入

分で導入

分で導入が完了）

が完了）

□

□ 導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

□

□ 多検体

多検体

多検体の迅速

多検体

の迅速

の迅速スクリーニング

の迅速

スクリーニング(HTS)

スクリーニング

(HTS)

(HTS)に

(HTS)

に

に最適

に

最適

□

□ 低細胞毒性と高い安全性

低細胞毒性と高い安全性

GenomONE ---- Si

Si

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

・基本プロトコルは、5ステップで完了。（インキュベーションの必要もありません。）・High-Throuhput Screening(HTS)用のプロトコルもご用意

製品仕様

①～④の操作は、必ず氷上で行ってください。

①

②

③

④

⑤

封入剤 _miRNAsiRNA HVJ-E 懸濁液導入エンハ_ンサー

基本プロトコル

細胞に添加

製品コード Freeze-dried _HVJ-E_（本）使用回数assays (wells) 税別価格_(円）（消費税8％）税込価格 (円） 6-well plate 24-well plate 96-well plate GS001 1 100 400 2,000

28,000

30,240

GS004 4 400 1,600 8,000

75,000

81,000

GS016 16 1,600 6,400 32,000

280,000

302,400

GS040 40 4,000 16,000 80,000

650,000

702,000

(3)

GenomONE-Si

_{のsiRNA導入原理}

①siRNAをHVJ Envelope（HVJ-E）に封入

②HVJ-Eが標的細胞のシアル酸に結合

③膜融合 ④細胞質内にsiRNAが_{導入される}

References (Review articles)

Kaneda Y. et al. : Hemagglutinating virus of Japan (HVJ) envelope vector as a versatile gene delivery system.

Molecular Therapy, 6, 219-226 (2002).

Kaneda Y. : New vector innovation for drug delivery: development of fusigenic non-viral particles.

Curr. Drug Targets, 4(8), 599-602 (2003).

Kaneda Y. : Applications of Hemagglutinating Virus of Japan in therapeutic delivery systems.

Expert Opin. Drug Deliv., 5(2),221-233 (2008).

Zhang Q. et al. : HVJ envelope vector, a versatile delivery system: its development, application and perspectives.

Biochem. Biophys. Res. Commun., 373, 345-349 (2008).

Kato F. et al. : Hemagglutinating Virus of Japan Envelope Vectors as High-Performance Vehicles for Delivery of Small RNAs. J. Genet. Syndr. Gene Ther., in press (2013).

GenomONE-Si

_{(HVJ-E siRNA/miRNA transfection KIT）}

HVJ-E （不活化センダイウイルス）とは？

HVJ-Eの膜融合能を利用した細胞への導入

Hemagglutinating virus of Japan（HVJ）Envelope （HVJ-E）は, センダイウイルスのゲノムRNAを完全に不活化した後, 精製した平均直径が約300nmの非増殖性・非感染性vesicleです。

HVJ-Eの外膜（エンベロープ）に分布する F proteinは, liveウイルスと同レベルの強い膜融合活性を保持していることから, HVJ-Eそのものを細胞間融合剤として用いたり, HVJ-Eに遺伝子, タンパク質, siRNA, miRNAなどを封入して細胞内に導入し, その機能を解析する研究に応用することが可能です。

HVJ(Hemagglutinating virus of Japan）は, Sendai virus(SeV)または Mouse Parainfluenza virus type 1とも呼ばれます

不活化

精製

HVJ

(Sendai Virus)

HVJ Envelope (HVJ-E)

HN protein

(4)

細胞株（

細胞株（U937, Raji, THP-1, Jurkat, HL-60））））

への

(5)

U937

siRNA transfection

U937への

への

へのEg5 siRNAの導入

の導入

Eg5 siRNA(50nM) transfection → 2days → WST-8（細胞数測定, A₄₅₀）

①～④の操作は、氷上で実施

Step 手順試薬量（96-well plate）

① HVJ-E懸濁液をマイクロテストチューブに採取 HVJ-E： 2.5μL

② Reagent Dを添加・混合（タッピング） Reagent D： 0.5μL

③ siRNA溶液を添加・混合（タッピング）（10μM） siRNA： 10μL

④ Reagent Eを添加・混合（タッピング） Reagent E： 5μL

⑤ HVJ-E₃₇_℃・5%COベクター懸濁液をwell 中の細胞培養液に添加し、

2下で細胞に処理、48時間培養

HVJ-Eベクター： 0.9μL/well 【Cell】： U-937(Human leukemic monocytic lymphoma cell line, ATCC：CRL-1593.2)

【Culture condition】：4×103_{cells/well/100μL, 10%FBS-RPMI-1640}

【Culture plate】：96-well plate(IWAKI 3860-096)

【siRNA】：Silencer KIF11(Eg5) siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

No.GS-S-001

GenomONE-Si

の取扱説明書

の取扱説明書プロトコル（１）

プロトコル（１）

プロトコル（１）で実施

プロトコル（１）

で実施

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9 Control(PBS)

ProductX

ProductR

GenomONE si

A

b

so

rb

a

n

ce

(

4

5

0 n

m

)

Negative control siRNA

Eg5 siRNA

94%

Eg5(KIF 11)はキネシン様モータータンパク質として、細胞分裂する際の紡錘体微小管を形成するために必須であり、その機能が阻害されると細胞分裂の停止とアポトーシスが誘導される。その現象を利用してsiRNAの導入効果をWST-8法（生細胞数測定法）にて定量的に評価。

GenomONE-Si _{を用いてU937にEg5 siRNAを導入したところ、94%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬}

を用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。} フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

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(6)

Raji

siRNA transfection

Rajiへの

への

へのCDC2 siRNAの導入

の導入

CDC2 siRNA(50nM) transfection → 2days → RT-PCR(mRNA定量)

①～④の操作は、氷上で実施。

HVJ-Eベクター：4.5μL/well 【Cell】： Raji(Human Burkitt lymphoma cell line, ATCC:CCL-86)

【Culture condition】：1.25×105_{cells/well/500μL, 10%FBS-RPMI-1640}

【Culture plate】：24-well plate(FALCON 3047)

【siRNA】：Very High Potency Hs_CDC2 siRNA (QIAGEN Cat. No. 1027273) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

No.GS-S-002

CDC2は、サイクリンBと複合体を形成し、細胞周期 M期を制御するが、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。

GenomONE-Si _{を用いてRajiにCDC2 siRNAを導入したところ、75%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬}

を用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。}

GenomONE-Si

の取扱説明書

の取扱説明書プロトコル（１）

プロトコル（１）

プロトコル（１）で実施

プロトコル（１）

で実施

0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2

Control(PBS) Product X Product R GenomONE-si

R e la ti v e q u a n ti ty (n o rm a li ze d 1 8 S r R N A )

Negative control siRNA CDC2 siRNA

74%

Relative Quantity; qRT-PCR assays (n=3)

石原産業株式会社

(7)

THP-1

siRNA transfection

THP-1への

への

へのEg5 siRNAの導入

の導入

HVJ-Eベクター：0.9μL/well 【Cell】： THP-1(Human acute monocytic leukemia cell line, ATCC：TIB-202)

【Culture condition】：2.5×104_{cells/well/100μL, 10%FBS-RPMI-1640}

【siRNA】：Silencer KIF11(Eg5) siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

No.GS-S-003

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4 Control(PBS)

ProductX

ProductR

GenomONE si

A

b

so

rb

a

n

ce

(4

5

0 n

m

)

Negative control siRNA

Eg5 siRNA

94%

GenomONE-Si

の取扱説明書

の取扱説明書プロトコル（１）

プロトコル（１）

プロトコル（１）で実施

プロトコル（１）

で実施

GenomONE-Si _{を用いてTHP-1にEg5 siRNAを導入したところ、94%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬}

を用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。} フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

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(8)

Jurkat

siRNA transfection

Jurkatへの

への

へのEg5 siRNAの導入

の導入

HVJ-Eベクター： 0.9μL/well 【Cell】： Jurkat clone E6-1(Human T cell leukemia cell line, ATCC：TIB-152)

【Culture condition】：2×104_{cells/well/100μL, 10%FBS-RPMI-1640}

【siRNA】：Silencer KIF11(Eg5) siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639) ) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

No.GS-S-004

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4 Control(PBS)

ProductX

ProductR

GenomONE si

A

b

so

rb

a

n

ce

(4

5

0 n

m

)

Negative control siRNA

Eg5 siRNA

73%

GenomONE-Si _{を用いてJurkatにEg5 siRNAを導入したところ、73%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬を}

用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。}

GenomONE-Si

の取扱説明書

の取扱説明書プロトコル（１）

プロトコル（１）

プロトコル（１）で実施

プロトコル（１）

で実施

石原産業株式会社

(9)

HL-60

siRNA transfection

HL-60への

への

へのCDC2 siRNAの導入

の導入

CDC2 siRNA(50nM) transfection → 2days → RT-PCR(mRNA定量)

【Cell】： HL-60(Human promyelocytic leukemia cell line, ATCC:CCL-240) 【Culture condition】：1×105_{cells/well/500μL, 20%FBS-RPMI-1640}

【Culture plate】：24-well plate(FALCON 3047)

【siRNA】：Very High Potency Hs_CDC2 siRNA (QIAGEN Cat. No. 1027273) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

No.GS-S-005

GenomONE-Si

の取扱説明書

の取扱説明書プロトコル（１）

プロトコル（１）

プロトコル（１）で実施

で実施

GenomONE-Si _{を用いてHL-60にCDC2 siRNAを導入したところ、85%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬} を用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。} CDC2は、サイクリンBと複合体を形成し、細胞周期 M期を制御するが、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2

Control(PBS) Product X Product R GenomONE-si

R

e

la

ti

v

e

q

u

a

n

ti

ty

(n

o

rm

a

li

z

e

d

1

8 S

r

R

N

A

)

Negative control siRNA CDC2 siRNA

86%

石原産業株式会社

(10)

Mouse primary B cells, T cells への

への

(11)

③ siRNA/miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（10μM） siRNA/miRNA： 10μL

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well

No.GS-S/M-001

【Cell】： Mouse primary B cells [isolated from spleen of female BALB/c mouse (6 weeks old) ]

【Culture condition】： 5×106 _{cells/well/500μL, RPMI-1640 with 10% FBS, 10mM HEPES, 50μM 2-ME}

【Culture plate】：24-well plate

【siRNA】：siGENOME Cyclophilin B control siRNA (Dharmacon Cat No.D-001136-01-05) Negative control #1 siRNA(Thermo Fisher Scientific Code No.AM4639)

【miRNA】：Mimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)（Dharmacon Cat No.CP-002000-01-05) miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1(Dharmacon Cat No.CN-001000-01-05)

siRNA transfection

21%

66%

Relative Quantity; qRT-PCR assays (n=3) Cell Viability (%); PI staining assay

Mouse primary B cellsへの

への

へのCyclophilin B siRNA/miRNAの導入

への

の導入

B cells isolation & Transfection

No-stimulation

2 days RT-PCR (mRNA定量）

Cyclophilin B(PPIB:peptidylprolyl isomerase B )は、ハウスキーピング遺伝子の１種で、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

説明書プロトコル

（１）で実施

GenomONE-Si _{を用いて無刺激のmouse primary B cellsにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB) miRNAを}

導入したところ、66%のノックダウン効果が得られた。一方、 Cyclophilin B control siRNAを導入したところ、21%と十分な効果が得られなかった。

BALB/c mouse primary B cells

siRNA/miRNA transfection

miRNA transfection フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

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(12)

③ miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（2μM） miRNA： 10μL

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well

No.GS-M-001

BALB/c mouse primary B cells

miRNA transfection

② Anti-CD40 / IL4 stimulation

74%

76%

【Cell】： Mouse primary B cells [isolated from spleen of female BALB/c mouse (7 weeks old) ] 【Stimulation】： ① anti-CD40(1µg/mL)/LPS(1µg/mL), ② anti-CD40(1µg/mL)/IL4(34.5ng/mL)

【miRNA】：Mimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)（Dharmacon Cat No.CP-002000-01-05) miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1(Dharmacon Cat No.CN-001000-01-05) ① Anti-CD40 / LPS stimulation

Pre-stimulated mouse primary B cellsへの

への

へのCyclophilin B miRNAの導入

の導入

Isolated B cells No-stimulation

2 days RT-PCR (mRNA定量） Stimulation

1 day

Transfection

GenomONE-Si _{を用いて① Anti-CD40 / LPS, あるいは、②Anti-CD40 / IL4で刺激したmouse primary B cellsにMimic}

Housekeeping Positive Control #1 (PPIB) miRNAを導入したところ、いずれも70%以上のノックダウン効果が得られた。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

説明書プロトコル

（１）で実施

Cyclophilin B(PPIB:peptidylprolyl isomerase B )は、ハウスキーピング遺伝子の１種で、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

石原産業株式会社

(13)

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well 【Cell】： Mouse primary B cells [isolated from spleen of female BALB/c mouse (8 weeks old) ]

【Stimulation】： LPS (1µg/mL)

【miRNA】： Mimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)（Dharmacon Cat No.CP-002000-01-05) miRIDIAN microRNA Mimic Negative Control #1(Dharmacon Cat No.CN-001000-01-05)

No.GS-M-002

82%

BALB/c mouse primary B cells

miRNA transfection

Pre-stimulated mouse primary B cellsへの

への

へのCyclophilin B miRNAの導入

への

の導入

Isolated B cells 2 days RT-PCR(mRNA定量） Stimulation 1 day Transfection

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

GenomONE-Si _{を用いてLPS刺激したmouse primary B cellsにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)}

miRNAを導入したところ、82%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬を用いた場合は、十分な効果が

得られずGenomONE-Si _{の優位性が示された。LPSはトランスフェクションの前後も入れたままで行った。}

Cyclophilin B(PPIB:peptidylprolyl isomerase B )は、ハウスキーピング遺伝子の１種で、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。フリーダイヤルフリーダイヤルフリーダイヤル フリーダイヤル 0120-409-816 FAX : 06-6444-7183 E-mail : [email protected] URL : https://www.iskweb.co.jp/products/hvj-e/ 〒550-0002 大阪市西区江戸堀1丁目3番15号

石原産業株式会社

(14)

No.GS-M-003

Cell Viability (%); PI staining assay

③ miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（10~2μM） miRNA： 10μL

BALB/c mouse primary B cells

miRNA transfection

Pre-stimulated mouse primary B cellsへの

への

_{へのCyclophilin B miRNAの導入}

の導入

Isolated B cells

2 days Western blotting Stimulation

1 day

Transfection

GenomONE-Si _{を用いてLPSで刺激したmouse primary B cellsにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)}

miRNA(10, 50nM)を導入したところ、Western blotting法でノックダウン効果が確認された。 LPSはトランスフェクションの前後も入れたままで行った。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

a: Control (PBS) b: Mock

c: Negative control miRNA (50nM) d: Cyclophilin B miRNA (50nM) e: Cyclophilin B miRNA (10nM)

β-actin Cyclophilin B

a

b

c

d

e

Cyclophilin B(PPIB:peptidylprolyl isomerase B )は、ハウスキーピング遺伝子の１種で、そのノックダウン効果をWestern blotting法で評価。

石原産業株式会社

(15)

2下で細胞に処理、培養

No.GS-M-004

β-actin

Cyclophilin B

B cells isolation & Transfection

Stimulation

1～～～～3 days Western blotting

Mouse primary B cellへの

への

_{へのCyclophilin B miRNAの導入}

の導入

_{の導入(Post- stimulation)}

の導入

a, e: Control(PBS) b, f: Mock

c, g: Negative control miRNA(50nM) d, h: Cyclophilin B miRNA(50nM) Day 1 Day 2 Day 3

a

b c d

Day 1 Day 2 Day 3

e f g h

GenomONE-Si _{を用いて未刺激のmouse primary B cellsにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB) miRNAを導入}

し、LPSで1～3日間刺激した後に、Western blotting法でノックダウン効果が確認された。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

説明書プロトコル

（１）で実施

BALB/c mouse primary B cells

miRNA transfection

石原産業株式会社

(16)

③ siRNA/miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（30μM） siRNA/miRNA： 10μL

2下で細胞に処理、48時間培養 HVJ-Eベクター： 4.5μL/well

【Cell】： Mouse primary T cells [isolated from spleen of female BALB/c mouse (7 weeks old) ] 【Stimulation】： PMA(5nM) / ionomycin(1µg/mL)

【Culture condition】： 1×106 _{cells/well/500μL, RPMI-1640 with 10% FBS, 1% GlutaMAX™(100}×)

No.GS-S/M-002

BALB/c mouse primary T cells

siRNA/miRNA transfection

77%

96%

Relative Quantity; qRT-PCR assays (n=2~3) Cell Viability (%); PI staining assay

siRNA transfection miRNA transfection

T cells isolation & Transfection

No-stimulation

2days RT-PCR(mRNA定量）

Stimulation 1day

Splenocyte

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

へのCyclophilin B siRNA /miRNAの導入

の導入

Mouse spleen cellsにPMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いてCyclophilin B control}

siRNAを導入したところ、 77%のノックダウン効果が得られた。さらにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB)

miRNAを導入したところ、 96%のノックダウン効果が得られた。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

石原産業株式会社

(17)

③ siRNA溶液を添加・混合（タッピング）（30~1.1μM） siRNA： 10μL

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well 【Cell】： Mouse primary T cells [isolated from spleen of female BALB/c mouse (12 weeks old) ]

【Stimulation】： PMA(5nM) / ionomycin(1µg/mL)

No.GS-S-006

BALB/c mouse primary T cells

siRNA transfection

79%

86% 79%

67%

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

へのCyclophilin B siRNAの導入

への

の導入

Splenocyte No-stimulation

2 days RT-PCR(mRNA定量）

Stimulation 1 day

Mouse spleen cellsにPMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いてCyclophilin B control}

siRNAを導入後、RT-PCR法で70%以上のノックダウン効果が得られた。50nMのsiRNAを導入した時に、最大で86％の

ノックダウン効果が得られた。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

説明書プロトコル

（１）で実施

石原産業株式会社

(18)

③ miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（2~0.016μM） miRNA： 10μL

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well 【Cell】： Mouse primary T cells [isolated from spleen of female C57BL/6 mouse (6 weeks old) ]

No.GS-M-005

C57BL/6 mouse primary T cells

miRNA transfection

94%

85%

61%

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

へのCyclophilin B miRNAの導入

の導入

Mouse spleen cellsにPMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いて10nM Cyclophilin B}

control miRNAを導入したところ、RT-PCR法で最大94%のノックダウン効果が得られた。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

石原産業株式会社

(19)

③ miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（200~0.3nM） miRNA： 10μL

【Culture condition】： 2×106 _{cells/well/500μL, RPMI-1640 with 10% FBS, 1% GlutaMAX™(100}_×)

No.GS-M-006

a; Negative control miRNA (1000pM) b; Cyclophilin B miRNA (1000pM) c; Cyclophilin B miRNA (400pM) d; Cyclophilin B miRNA (100pM) e; Cyclophilin B miRNA (25pM) f; Cyclophilin B miRNA (6.3pM) β-actin Cyclophilin B a b c d e f

75%

56%

Splenocyte No-stimulation 2 days RT-PCR(mRNA定量） Western blotting Stimulation 1 day

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

_{へのCyclophilin B miRNAの導入}

の導入

Mouse spleen cellsに PMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いてCyclophilin B control}

miRNA(400pM)を導入後、RT-PCR法で75%のノックダウン効果が得られた。さらにWestern blotting法でもノックダウン効果が確認された。

Cyclophilin B(PPIB:peptidylprolyl isomerase B )は、ハウスキーピング遺伝子の１種で、そのノックダウン効果をReal-Time PCR法で定量的に評価。さらにWestern blotting法でも評価。

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

BALB/c mouse primary T cells

miRNA transfection

石原産業株式会社

(20)

BALB/c mouse primary T cells

miRNA transfection

No.GS-M-007

79%

HVJ-Eベクター： 4.5μL/well ①～④の操作は、氷上で実施。

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

へのCyclophilin B miRNAの導入

の導入

Mouse spleen cellsに PMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いてCyclophilin B control}

miRNAを導入したところRT-PCR法で79%のノックダウン効果が得られた。一方、他の導入試薬を用いた場合は、十分

な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。}

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

の取扱

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

石原産業株式会社

(21)

③ miRNA溶液を添加・混合（タッピング）（2~0.08μM） miRNA： 10μL

No.GS-M-008

BALB/c mouse primary T cells

miRNA transfection

Cyclophilin B

β-actin

GenomONE-si Product R Product X

Pre-stimulated mouse primary T cellsへの

への

_{へのCyclophilin B miRNAの導入}

の導入

a, f: Control(PBS)

b, g: Negative control miRNA(50nM) c, h: Cyclophilin B miRNA(50nM) d, i: Cyclophilin B miRNA(2nM) e, j: Cyclophilin B miRNA(0.4nM)

Mouse spleen cellsにPMA/ionomycinで1日間刺激後、T cellsを分離し、GenomONE-Si _{を用いてMimic Housekeeping}

Positive Control #1 (PPIB)(2, 50nM)を導入したところ、Western blotting法でノックダウン効果が確認された。一方、他

の導入試薬を用いた場合は、十分な効果が得られず、GenomONE-Si _{の優位性が示された。}

a

b c d e

f

g h

i

j

GenomONE-si Product R Product X

GenomONE-Si

の取扱

の取扱説明書プロトコル

説明書プロトコル

説明書プロトコル（１）で実施

（１）で実施

石原産業株式会社

2 days Western blotting Stimulation

1 day

(22)

【Culture condition】： 1×106 _{cells/well/500μL, RPMI-1640 with 10% FBS, 1% GlutaMAX™(100}_×)

No.GS-M-009

BALB/c mouse primary T cells

miRNA transfection

a, e: Control(PBS) b, f: Mock c, g: Negative control miRNA(50nM) d, h: Cyclophilin B miRNA(50nM)

β-actin

Cyclophilin B

12h 24h 48h 24h 48h *1/2量のGenomONE-siを使用 GenomONE-Si (×1)

a b c d

GenomONE-Si

(×1/2*)

e f g h

Stimulation

12～～～～48 h Western blotting

Mouse primary T cellsへの

への

へのCyclophilin B miRNAの導入

の導入

の導入(Post-stimulation)

の導入

GenomONE-Si _{を用いて未刺激のmouse primary T cellsにMimic Housekeeping Positive Control #1 (PPIB) miRNA}

を導入し、 PMA/ ionomycinで24 ～48時間刺激した後に、Western blotting法によりノックダウン効果が確認された。

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT GenomONE - Si 浮遊系免疫細胞へのsiRNA/miRNA導入 データ集

浮遊系免疫細胞へのsiRNA/miRNA導入

石原産業株式会社

GenomONE ---- Si

Si

Si

Si

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT

GenomONE-Si

は、HVJ Envelope（HVJ-E:不活化センダイウイルス）を

用いたsiRNA/miRNA専用のトランスフェクションキットで、初代培養免

疫細胞にも高効率な導入が可能です。

＜特長＞

＜特長＞

＜特長＞

＜特長＞

□

□

□

□ 合成オリゴ型の

合成オリゴ型の

合成オリゴ型のsiRNA/miRNAの導入に最適

合成オリゴ型の

の導入に最適

の導入に最適

の導入に最適

□

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□ 簡便な

簡便な

簡便な操作性（

簡便な

操作性（

操作性（

操作性（5

5

5～

5

～10

～

～

10

10

10分で導入

分で導入

分で導入

分で導入が完了）

が完了）

が完了）

が完了）

□

□

□

□ 導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

導入困難な浮遊系免疫細胞にも適用可能

□

□

□

□ 多検体

多検体

多検体の迅速

多検体

の迅速

の迅速スクリーニング

の迅速

スクリーニング(HTS)

スクリーニング

スクリーニング

(HTS)

(HTS)に

(HTS)

に

に最適

に

HVJ Envelope siRNA/miRNA transfection KIT GenomONE - Si 浮遊系免疫細胞へのsiRNA/miRNA導入データ集

_{は、HVJ Envelope（HVJ-E:不活化センダイウイルス）を}

_{合成オリゴ型のsiRNA/miRNAの導入に最適}

_{のsiRNA導入原理}

_{(HVJ-E siRNA/miRNA transfection KIT）}

HVJ-E （不活化センダイウイルス）とは？