RNAウ イル ス複 製機構解 明がもた らすもの センダイウイルスのリパースジエネティクスを 活用 した新規遺伝子治療用RNAベ クター 細胞質遺伝子治療の確立へ向けて 飯田章博 長谷川 護 センダイ ウイルス(SeV)の リバースジェネテ ィクスを活用 した新 しい 細胞質型RNAベ クター の

1371 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.10(2003)

RNAウ

イル ス複 製機構解 明がもた らすもの

センダイウイルスのリパースジエネティクスを

活用 した新規遺伝子治療用RNAベ

クター

細胞質遺伝子治療の確立へ向けて

飯田章博 ・長谷川 護

センダイ ウイルス(SeV)の リバースジェネテ ィクスを活用 した新 しい「細胞質型RNAベ クター」 の系 の構築 と応用研 究を行な っている,ウ イルスエ ンベ ロープ関連遺伝子 を欠失す ること によ り,非 伝播型 とす ることに成功 したが,こ のベクターはin vivo,in vitroで 既存の ベクター を 大 きく凌駕する きわめて優れた遺伝子導入能 と発現箪 を示 し,遺 伝子治療の臨床効 果を大き く 高め るもの と期待 された,ま た,マ トリックス蛋 白質遺伝子欠失 型ベクターは遺伝 子導入 細胞 を起点 とする周辺細胞の大規模 な融合を惹起 し,癌 遺伝子治 療に有力な手段を提供 すると考え られた,SeVベ クター による新 しい概 念の 「細胞 質遺伝子治療」 は遺伝子治療 の適 用を慢性疾 患を含む広範な疾病に広げ,治 療効果を劇 的に高め るもの と期待される. 遺 伝子治療 ベ クター パラ ミクソ ウイル ス セ ンダイ ウイル ス は じめ に:細 胞質遺 伝子治療 の提案 ポ ス トゲ ノ ム 時 代 に 入 り,塩 基 配 列 情 報 と基礎 医 学 の 研 究 成 果 が 融 合 し た高 度 な生 物 学 的 情 報 が 医 薬 品 の 開 発 に 中 心 的 役 割 を果 た す こ とが ます ます 現 実 化 して き た. これ らの 発 展 を背 景 に して,遺 伝 情 報 自体 を直接 的 に 治 療 製剤 とす る遺 伝 子 治 療 が 今 世 紀 の 重 要 な 先端 医療 技 術 の ひ とつ に な る と大 い に 期 待 され て い る.そ の た め に 最 も必 要 と され る技 術 は,安 全 で 治 療 用 遺 伝 情 報 を効 率 よ く体 内 に 運 搬 し,患 部 で 治 療 に 十 分 な レベ ル でそ れ を発 現 で きる 手 段,ベ ク ター の 開発 で あ る.現 在,こ の よ う な遺 伝 子 治 療 用 ベ ク ター の 開発 競 争 が 世 界 中 で熾 烈 に行 な わ れ て い るが,現 実 に 臨 床 応 用 に 至 っ て い る もの は き わ め て 少 な い.カ チ オ ン性 リ ボ ソー ム な どを用 い る非 ウ イ ル ス性 ベ ク タ ー の 遺 伝 子 導 入 効 率 は 依 然 と して大 幅 な 性 能 の 向 上 が 必 要 で あ る.一 方,現 在 臨 床 で使 われ て い る ウ イ ル ス ベ ク タ ー は,レ トロ ウ イル ス,ア デ ノ ウ イ ル ス,ア デ ノ随 伴 ウ イ ル ス な ど を 基 本 骨 格 と して い る が, そ れ らの 問 題 点 も明 らか に な っ て きた.レ トロ ウ イ ル ス ベ ク ター で は そ の 染 色 体 へ の ラ ン ダム な 組 込 み が もた ら す 危 険性 が 指 摘 され て い た が,現 実 に フ ラ ンス で の 小 児 の 重 症 複 合 免 疫 不 全 症(X-SCID)治 療 で,白 血 病 を ひ き起 こ す 副 作 用 が 昨 年 報 告 され て 大 きな 波 紋 を よん で い る1).ア デ ノ ウ イ ル ス ベ ク ター で は 遺 伝 子 の 発 現 持 続 性 や 抗 原 性,大 量 に 投 与 した場 合 の 低 頻 度 な が ら染 色 体 へ の 組 込 み の 危 険性 が 考 え られ,ア デ ノ随 伴 ウ イ ル ス ベ ク ター で は 挿 入 可 能 な遺 伝 子 の 大 き さの 制 限,染 色 体 へ 組 み 込 まれ た 場 合 の 染 色 体 の 部 分 欠 落 な どの 発 生 の 問 題 点 が 明 らか に な りつ つ あ る.こ れ ら の既 存 の ベ ク ター の 問 題 点 は,遺 伝 子 治 療 を 今後 他 の 治 療 法 に伍 して,あ る い は 優i位に 新 た な 治 療 法 と して 定 着 させ る こ と を妨 げ る も の と考 え られ る. こ れ ら に対 して,筆 者 らは 「細 胞 質 遺 伝 子 治 療 」 とい う新 しい 概 念 を セ ン ダ イ ウ イ ル ス(SeV)[→ 今 月 のKey Words (p.1339)]ベ ク タ ー を 用 い て 提 案 し て い る.SeV は1本 鎖 の マ イ ナ ス 鎖 非 分 節 型RNAゲ ノ ム(15,384塩 基)を も ち,げ っ 歯 類 を 宿 主 と す る 呼 吸 器 病 ウ イ ル ス で

Akihiro lida, Mamoru Hasegawa, (株)デ ィナ ベ ッ ク研 究 所 E-mail : [email protected]. [email protected]

Development of a novel cytoplasmic RNA vector based on the reverse genetics of Sendai virus : A breakthrough to the cytplas mic gene therapy

1372 蛋 白質 核 酸 酵素Vol.48No.10(2003) あ る2).SeVは 宿 主 細 胞 の細 胞 質 で の み 転 写,複 製 を行 な い,生 活 環 の 全 過 程 を通 じてDNA相 を経 な い とい う 特 徴 が あ る た め(図1),ウ イ ル ス 遺 伝 子 は 染 色 体 との 相 互作 用 を原 理 的 に生 じ ない.ま た,イ ン フ ルエ ンザ や 一 部 の プ ラ ス鎖RNAウ イ ル ス で知 られ て い る ポ リ メ ラ ー ゼ の 乗 り換 え に よ る ウ イル ス ど う しの組 換 え の現 象 も知 られ て い な い.さ らに,ヒ トへ の病 原 性 の 報 告 もな い こ とか ら,「 細 胞 質 型RNAベ ク ター 」 とい う新 た な概 念 の,安 全 性 の 高 い ベ ク ター の 骨 格 と な る と期 待 され た. 従 来SeVゲ ノ ム 全 長cDNAか らの 感 染 性 の ウ イ ル ス の 回収,お よ び 外 来 遺 伝 子 を野 生 型SeVゲ ノ ム に 組 み 込 ん だ組 換 え ウ イ ル ス の作 製 の 報 告 が さ れ て お り,外 来 遺 伝 子 の 高 発 現 能がin vitroで 示 さ れ て い る3). 筆 者 ら は こ のSeVの リバ ー ス ジ ェ ネ テ ィ ク ス の 成 果 を さ らに 拡 大 して,SeVを 「細 胞 質 型 遺 伝 子 治 療 用 ベ ク ター」 と して 仕 立 て上 げ る た め,技 術 的 に2つ の 内 容 の 検 討 を行 な っ て き た.ま ず,ヒ トへ の 投 与 に加 え て, ベ ク ター 製 造 お よ び前 臨床 試 験 過 程 で の 安 全 性 を 十分 確 保 す る た め,SeVゲ ノ ム の 一 部 を 欠 失 さ せ る こ と に よ り,導 入 細 胞 内 で はゲ ノ ム の 自律 複 製 が 可 能 で あ る が, 非 伝 播 性 とな る 新 規 のSeVベ ク ター を作 製 す る こ と を 試 み た.次 に,ウ イル スの エ ンベ ロー プ を構 成 す る蛋 白 質 の 遺 伝 子 操 作 に よ り,ウ イ ル ス 感 染 の トロ ピズ ム(宿 主 範 囲)を 変 更 させ,そ れ に よっ て 転 移 性 癌 細 胞 に 特 異 的 な遺 伝 子 導 入 を果 た す こ とが で きた.

Ⅰ.非伝播性細胞質型RNAベ

クターの構築

1.欠 失型SeVベ クター 骨格 ゲ ノムの デザ イ ン SeVのRNAゲ ノ ム の 両 端 に は リ ー ダ ー と トレー ラ ー と よ ばれ る構 造 が あ り,複 製 と転 写 は リー ダー 配 列 か ら 起 動 され る。 この 両 端 構 造 に挟 ま れ て 主 要 な6つ の ウ イ ル ス 遺 伝 子 が 図2に 示 す 順 に 並 ん で い る.そ れ らが コー ドす る蛋 白質 の う ち,ヌ ク レ オ カ プ シ ドN蛋 白 質(NP) お よびRNAポ リメ ラー ゼ を構 成 す るP蛋 白 質 とL蛋 白 質 の3種 類 の ウ イ ル ス 由来 蛋 白 質 は,ウ イ ル ス の ゲ ノ ム RNAと と も に,自 律 複 製 可 能 な レプ リ コ ン で あ る 複 合 体(ribonucleoprotein complex;RNP)を 形 成 す る.マ ト リ ッ ク ス 蛋 白 質(M)は エ ンベ ロ ー プ を 裏 打 ち して お り, ウ イ ル ス 粒 子 の ア セ ンブ リ ー と出 芽 に 関 与 す る.2種 類 の エ ンベ ロ ー プ 糖 蛋 白 質(HN,F)は ウ イ ル ス 粒 子 の 感 染 細 胞 へ の 接 着 お よ び 侵 入 に そ れ ぞ れ 関 与 し て い る.F 蛋 白 質 は 非 活 性 型 の 前 駆 体(Fo)と して 合 成 さ れ,ト リプ シ ン様 プ ロ テ ア ー ゼ に よ り,F1とF2に 開 裂,活 性 化 さ れ,標 的 細 胞 の 細 胞 膜 と膜 融 合 を ひ き 起 こす.そ の 開裂 部 位 は 高 等 動 物 の 気 道 に分 泌 され る トリ プ ター ゼ ク ラ ラ の よ い 基 質 で あ り,そ の た め に げ っ歯 類 の 気 道 に高 い感 図1 セ ン ダ イ ウ イル スの 構造 と感 染 様 式 (a)セ ン ダ イ ウ イ ル ス の 構 造(透 過 型 電 子 顕 微 鏡 写 真).(b)セ ン ダ イ ウイ ル ス の感 染 様 式.感 染 後 の ウイ ルス ゲ ノム の 複製,転 写 は すべ て 細 胞 質 で行 な われ る, NP、P,L,M,F,HNは ウイ ル ス 由来 蛋 白 質.

1373 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.48No.10(2003) 染 性 を 示 す4).筆 者 ら は 非 伝 播 性 の 欠 失 型SeVベ ク タ ー を 作 製 す る に あ た り,エ ン ベ ロ ー プ 関 連 蛋 白 質 に 注 目 し,弱 毒 株 で あ るZ株 由 来 の ウ イ ル ス ゲ ノ ムcDNAか ら こ れ ら の 遺 伝 子 を 欠 失 さ せ,外 来 遺 伝 子(レ ポ ー タ ー 遺 伝 子,治 療 用 遺 伝 子)を 導 入 し た.図2で はF欠 失 型 ベ ク タ ー ゲ ノ ム の 構 造 を 示 す が,初 期 の 検 討 に 際 し て は,緑 色 蛍 光 蛋 白 質 遺 伝 子(enhanced green nuorescence protein;BGFP)を 導 入 す る こ と で,欠 失 型SeVベ ク タ ー の 再 構 成 の 有 無 と 効 率 を 高 感 度 に 検 定 す る こ と が で き,ベ ク タ ー の 作 製 に 有 効 で あ っ た.こ れ ま でF,HN, F-HN,M-Fな ど 各 種 遺 伝 子 を 欠 失 さ せ た 非 伝 播 性 の ベ ク タ ー の 作 製 に 成 功 し て い る が,こ こ で は 最 も 開 発が 進 ん で い るF欠 失 型 ベ ク タ ー の 系 を 中 心 に 紹 介 す る. 2.パ ッ ケ ー ジ ン グ 細 胞 株 の 作 製 と 欠 失 型 ベ ク タ ー の cDNAか らの再構 成 欠 失 型SeV粒 子 を再 構 成 させ る た め に は,欠 失 遺 伝 子 産 物 を 自 ら生 産 す るパ ッ ケ ー ジ ング 細 胞 株(ベ ク ター 生 産 細 胞)の 樹 立 が 必 要 で あ る.F蛋 白 質 は 単 独 で は 細 胞 毒 性 が あ る の で,誘 導 発 現 に よ りF生 産 細 胞 を作 製 した.F遺 伝 子 と薬 剤 耐 性 マ ー カ ー 遺 伝 子 をCre/loxP 誘 導 発 現 型 プ ラ ス ミ ド5)に組 み 込 み,サ ル 腎 臓 由 来細 胞 LLC-MK2に 導 入 し,薬 剤 耐 性 と な っ た 細 胞 を 選 択 し た.得 られ た細 胞 株 にCreリ コ ン ビ ナ ー ゼ を発 現 す る 組 換 え ア デ ノ ウ イ ル ス を 感 染 さ せ てF蛋 白 質 の 発 現 レ ベ ル を 調 べ,最 も高 い 生 産 能 を 示 した 細 胞 株 をパ ッケ ー ジ ング細 胞 株 と して 選択 し た. 図2 F欠 失 型 セ ン ダ イ ウイル スベ ク タ ー の 作 製 法 (a)セ ン ダ イ ウ イ ル ス(上 段)とF欠 失 型ベ ク ター(下 段)の 基 本遺 伝 子構 造.ベ ク ター は外 来 遺 伝 子 と してEGFPをM とHN間 に 挿 入 した も の を 代表 と して 示 す,(b)F欠 失 型SeVベ ク タ ー の2 段 階 で の 回 収 法,第1段 階:T7RNA ポ リ メラ ー ゼ を 発 現 す る組 換 え ワ クシ ニ ア ウ イ ル ス(vTF7-3)を サ ル 腎 由 来 細 胞 株(LLC-MK2)に 感 染 後,T7プ ロ モ ー タ ー支 配 下 にNP _{,P,L蛋 白 質 を発 現 する} プ ラ ス ミ ド,お よ びF欠 失 型SeVの ア ンチ ゲ ノ ム(+鎖)を 発 現 す る プラ ス ミ ドの4種 類 を 導 入 す る と,導 入細 胞 の細 胞質 で のRNPの 形 成 の 後 に,ゲ ノ ムの 複 製,転 写 が 開 始 さ れ る.第2段 階: RNPを カ チ オ ン性 リ ボ ソー ム を 用 いて F蛋 白質 を発 現 す るパ ッケ ー ジ ン グ細 胞 に導 入 す る とF蛋 白 質 が トラ ン ス に供 給 さ れ 、F欠 失 型 ベ ク タ ー が 産 生 さ れ る. 図3 F欠 失 型SeVベ ク タ ー に よ る 各 種 細 胞 へ のEGFP遺 伝 子 の 導 入 と発 現 (a)∼(c)上 段 は 位 相 差 顕 微 鏡 に よ る 細 胞像.下 段 は ベ ク タ ー導 入 によるEGFP 発現 の 蛍 光像.い ず れの 細 胞 もin vitro でMOI=3の 条 件 で ベ ク タ ー を感 染 し て い る,(d)上 段 は ニ ュ ー ロ ンマ ー カー で あ るMAP2に 対 す る 抗 体 染色 像,下 段 は ベ ク タ ー 導 入 に よ るEGFP発 現 の 蛍 光像.

1374 蛋 白質 核 酸 酵 素Vol.48No.10(2003) 他 の マ イ ナ ス 鎖RNAウ イ ル ス と 同 様,全 長 ゲ ノ ム cDNAを 単 独 で 細 胞 に 導 入 し て も感 染 性 ウ イ ル ス 粒 子 を再 構 築 す る こ とが で きず,同 時 に ウ イ ル ス のRNPの 形 成 に必 要 なNP,P,L蛋 白 質 を 発 現 す る プ ラ ス ミ ド を細 胞 に 導 入 す る必 要 が あ っ た.ま ず,LLC-MK2細 胞 にT7RNAポ リ メ ラ ー ゼ を 発 現 す る 組 換 え ワ ク シ ニ ア ウ イ ル ス6)を感 染 後,F遺 伝 子 欠 失SeVcDNAお よ び NP,P,Lを そ れ ぞ れ 発 現 す る3種 の プ ラ ス ミ ド を導 入 した.SeVゲ ノ ム に 組 み 込 ん だEGFP遺 伝 子 が 発 現 して 蛍 光 を発 す る 細 胞 を観 察 す る こ と に よ り,機 能 的 な RNPが 再 構 成 さ れ た こ と を確 認 した.そ れ らの 細 胞 を 凍 結 融 解 して カ チ オ ン性 リボ ソ ー ム と混 合 し,上 記 パ ッ ケ ー ジ ン グ細 胞 に 導 入 す る と,そ の2∼3日 後 の 培 養 上 清 にF欠 失 型SeVベ ク タ ー が107cell infectious units

(CIU)/ml以 上 の濃 度 で 回 収 され た(図2). こ の ウ イル ス粒 子 の ゲ ノ ム構 造 は ノー ザ ンプ ロ ッ トと PCR解 析 で 確 認 され た.F遺 伝 子 の プ ロー ブ で は バ ン ドが 検 出 さ れ ず,F遺 伝 子 が ウ イ ル ス ゲ ノ ム 上 に 存 在 しな い こ と,さ らに ウ イ ル ス再 構 成 中 にゲ ノ ム の 再 編 成 は起 き て い な い こ とが 詳 細 なPCR解 析 に よ っ て 示 され た.電 子 顕 微 鏡 観 察 の 結 果,ス パ イ ク様 構 造 を もつ エ ン ベ ロ ー プ とそ の 内 部 に ひ も状 のRNP構 造 が 認 め られ, 形 態,サ イズ と も野 生 型 ウ イ ル ス とほ ぼ 同 じで あ っ た. さ らに,金 コ ロ イ ド標 識 モ ノ ク ロ ナ ー ル 抗 体 を 用 い た 免 疫 電 子 顕 微 鏡 観 察 に よ り,F欠 失 型SeVベ ク ター の エ ンベ ロ ー プ 表 面 にF蛋 白 質 とHN蛋 白 質 が 認 め られ, パ ッ ケ ー ジ ン グ 細 胞 由 来 のF蛋 白 質 が ベ ク タ ー 粒 子 に 取 り 込 ま れ て い る こ と が 証 明 さ れ た7). 3.欠 失 型SeVベ ク ター の性能 本 ベ ク タ ー のin vitroで の 遺 伝 子 導 入,発 現 能 を, EGFPの 発 現 に よ り調 べ た.そ の 結 果,肝 細 胞,肺 毛細 管 内 皮 細 胞,平 滑 筋 細 胞 な どの ヒ ト由 来 の 正 常 細 胞 や, ラ ッ ト大 脳 皮 質 由 来 初 代 培 養 細 胞 に低MOI(multiplicity of infection)で 既 存 ベ ク ター よ り高 効 率 で 遺 伝 子 導 入

し,EGFPの 強 い 発 現 が 認 め ら れ た(図3)7/.in vivoで の ベ ク ター 性 能 は す で に多 数 の 報 告 が あ り,気 道上 皮 組 織8),骨 格 筋9),血 管 上 皮 細 胞 と 平 滑 筋10),眼 球 網 膜 お よ び 角膜11)のほ か,脳 実 質 の 神 経 細 胞 お よ び脳 室 上 衣 細 胞 へ の 十 分 な 遺 伝 子 導 入 と発 現 が 認 め られ,F欠 失 型 SeVベ ク タ ー は 分 裂 ・非 分 裂 性 い ず れ の 細 胞 に も高 い 遺 伝 子 導 入,発 現 能 を も ち,広 い 組 織 適 応 範 囲 を もつ優 秀 なベ ク ター で あ る こ とが 示 され た. 4.遺 伝子発現量の調節 細 胞 質 型 で あ るSeVベ ク ター は,従 来 の ベ ク ター と 違 っ て プ ロモ ー ター ・エ ンハ ンサ ー に よ る遺 伝 子 発 現 量 の 調 節 は で き な い.し か し多 くの 場 合,既 存 の ベ ク ター の 性 能 の 限 界 が 遺 伝 子 発 現 の 低 さ に あ る こ と を考 え る と,実 は そ れ らベ ク タ ー で の プ ロ モ ー ター ・エ ンハ ンサ ー 利 用 の 効 果 は こ の 限 界 を解 決 した う えで の 将 来 的 な も の と考 え ら れ る.一 方,SeVベ ク ター で は そ の 抜 群 の 遺 伝 子 発 現 量 に よ り,治 療 用 遺 伝 子 発 現 量 の 有 効 域 と毒 性 域 を 前 臨床 試 験 で 確 認 で き る こ と が 示 さ れ て い る12). そ こで,前 臨 床 研 究 の 経 緯 を 見 なが ら,遺 伝 子 発 現 量 を 臨 床 目 的 に応 じて 多 段 階 に 選 択 で き る 系 の 構 築 を 試 み た.1本 鎖 の マ イナ ス鎖 非 分 節 型RNAウ イ ル ス で は,上 流 遺 伝 子 ほ どそ の 発 現 量 は 高 く,遺 伝 子発 現 の 極 性 効 果 (polar effect)が 報 告 され て い る13).筆 者 ら は こ の現 象 に 注 目 し,治 療 用 遺 伝 子 を 上 流(NP遺 伝 子 の 直 上)か ら下 流(L遺 伝 子 の直 下)ま で の7ヵ 所 にお の お の 搭 載 可 能 な ベ ク タ ー の セ ッ トを 作 製 し た(図4)14).こ れ を 利 用 し て,あ る細 胞 にお い て は,ア デ ノ ウ イ ルス ベ ク ター の遺 伝 子 発 現 レベ ル か ら,そ の 数 十 倍 の レベ ル ま で を得 る こ とが 可 能 とな った. 5.重 症虚血肢の遺伝子治療への応用 慢性動脈硬 化症 や糖 尿病 に よる下肢 の血行障 害は激 し 図4 遺 伝子 発現 の 極 性効 果 を 利 用 したSeVベ クタ ー の遺 伝 子 発 現 量 の 調 節 Not 1切 断 部 位 を ウ イ ル ス 遺 伝 子 の 各 間 隙 構 造 に設 置 した ベ ク タ ー そ れ ぞ れ に ,ヒ ト分泌 性 アル カ リ フォ ス フ ァター ゼ 遺伝 子 (SEAP)を 挿 入 して サル 腎 由 来CV-1細 胞 に 導 入 した,培 養 上 清 に分 泌 さ れたSEAP活 性 を 比 較 した.

1375 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.10(2003) い疼 痛,歩 行 困 難,下 肢 壊 死 を もた ら し,や が て 下 肢 切 断 を 余 儀 な く させ,そ の 予 後 も 多 くの場 合 不 良 で あ る. 有 効 な 治 療 方 法 が な い た め,血 行 の 再 開 を 目的 と した 遺 伝 子 治 療 に 期 待 が集 まっ て い る.筆 者 ら はFGF-2(nbro

blast growth factor 2:塩 基 性 線 維 芽 細 胞 増 殖 因 子)搭 載 SeVベ ク タ ー が 実 験 的 下 肢 虚 血 モ デ ル で き わ め て 優 秀 な 成 績 で 下 肢 脱 落 を 防 御 す る こ と を 見 い だ し た(図 5)15).し か も報 告 さ れ て い る他 の遺 伝 子 治 療 法 と比 較 し て,モ デ ル で 救 肢 率 が 大 き く上 回 る こ と,SeVベ ク タ ー の 高 発 現 能 を背 景 に毒 性 域 を十 分 把 握 し なが ら治 療 が 行 な え る こ と(こ の よ う な例 は こ れ ま で の 遺 伝 子 治 療 で は ほ とん ど不 可 能 で あ っ た),さ らに はFGF-2が 投 与 局 部 に お い て,他 の 血 管 新 生 因子 を誘 導 して 真 に機 能 的 な 血 管 の新 生 を促 す もの で あ る こ とが 判 明 し た16).こ れ ら の 知 見 に 基 づ い て,九 州 大 学 附属 病 院 で は 非伝 播 性 で あ るF欠 失 型 組 換 えSeVベ ク ター を 用 い た 臨 床 研 究 を計 画 し,現 在,厚 生 労働 省 で の 審 議 が 行 な わ れ て い る.こ れ が 実 現 す れ ば,日 本 の オ リ ジ ナ ル な 技 術 に よる 世 界 で 初 め て の細 胞 質 遺 伝 子 治療 と な る.

Ⅱ.癌治療を目指した細胞融合型ベクターの開発

1.M遺 伝子 欠 失型SeVベ ク ターの 作製 と その特徴 こ こ で はSeVベ ク タ ー 開 発 の も う1つ の 方 向,感 染 の メ カニ ズ ム 変 更 を利 用 した,癌 遺 伝 子 治 療 の新 戦 略 を 可 能 に す るベ ク ター の デザ イ ンに つ い て 解 説 す る. 筆 者 ら は,SeVエ ンベ ロ ー プ の 裏 打 ち 蛋 白 質 の 構 造 遺 伝 子 で あ るM遺 伝 子 をSeVゲ ノ ム か ら欠 失 した ベ ク タ ー の 作 製 に成 功 した17).も ち ろ ん,こ の 場 合 はMを 生 産 す る パ ッケ ー ジ ン グ細 胞 を使 用 す る.興 味 あ る こ と に,こ の ベ ク ター の 感 染 細 胞 は ト リプ シ ン存 在 下 で,近 隣 の 非 感 染 細 胞 と融 合 を開 始 しin vitroで の 実 験 で は 数 十 以 上 の 細 胞 が 融 合 した シ ン シ チ ウ ム(syncytium)を 形 成 した.こ れ は,感 染 細 胞 の 細 胞 質 に お い て,SeV ベ ク タ ー 由 来 のRNPか らFお よ びHN蛋 白 質 が発 現 さ れ,そ れ らが 細 胞 表 面 に提 示 され た 結 果,あ た か もSeV と細 胞 が 膜 融 合 を起 こす が ご と く隣 接 した細 胞 と融 合 し た もの と考 え ら れ た.そ の 結 果,RNPが 隣 接 細 胞 に 移 り,こ れ が 次 々 に く り返 し起 こ っ た 末 に 数 十 の 細胞 が 融 合 して しま っ た の で あ る 。 この 事 実 は,た とえ 初期 遺 伝 子 導 入 効 率 が 悪 くて も組 織 の 広 範 な 領 域 に 治療 用遺 伝 子 を発 現 させ うる こ と を意 味 して お り,癌 遺 伝 子 治療 な ど で,癌 細 胞 の取 りこ ぼ しの な い,あ る い は そ れ が きわ め て少 な い 治 療 が 可 能 に な る こ と を示 唆 して い た. 2.悪 性癌標的用SeVベ クターのデザイン そ こ で,転 移 性 癌 細 胞 特 異 的 な 感 染 を 起 こ すM欠 失 型SeVベ ク タ ー の 開 発 を 試 み た.SeVの げ っ 歯 類 の 気 道 感 染 性 は,気 道 に 分 泌 さ れ る ト リ プ タ ー ゼ ク ラ ラ の 基 質 特 異 性 に よ り,SeVのFo蛋 白 質 が 気 道 特 異 的 に 切 断, 活 性 化 さ れ る こ と に よ る.そ こ で,こ のFo切 断 を,転 移 性 癌 細 胞 が 特 異 的 に 分 泌 し て い る マ ト リ ッ ク ス メ タ ロ

プ ロ テ ア ー ゼ(matrix metallo proteinase ； MMP)依 存 性

図5 重 症 虚 血 肢 モ デ ル に お け る SeV-FGF-2の 救 肢 効 果 左:各 モ デル にお け る生 存 曲 線,FGF-2 導 入 群 の み が 有 意 に 高 い 生 存 率 を 示 し た. 右:虚 血 手術 後10日 目 にお け る 下 肢 の 肉 眼 的所 見,luciferase(コ ン トロ ー ル) 群,VEGF165群 で は下 肢 の 脱 落 を 認 め た が,FGF-2群 で は 劇 的 な 救 肢 効 果 が 認 め られ た.VEGF165は ス プ ラ イ シ ン グ の違 い によ り生 じる血 管 内皮 増 殖 因子 (VEGF)サ ブ タ イ プ の1つ.

1376 蛋 白 質 核 酸 酵 素Vol.48No.10(2003) に変 更す る こ とを 試 み た.転 移 性 癌 細 胞 は,原 発 巣 か ら 血 流 な ど を介 して他 の 臓 器 に転 移,定 着 す る が,こ の過 程 でMMPを 分 泌 して コ ラ ー ゲ ン な ど の細 胞 間 物 質 を分 解 しな が ら移 動 す る.こ のMMP特 異 的 なFoの 切 断, 活 性 化 が 実 現 す れ ば,転 移 性 癌 細 胞 を標 的 にす る ベ ク タ ー の 開 発 が 可 能 に な る と期 待 さ れ た .そ こで,F0の 切 断 個 所 をMMPの 切 断 ア ミ ノ酸 配 列 に 変 換 し,か つF 蛋 白 質 の 膜 融 合 活 性 を維 持 す る工 夫 を行 な っ た.そ の 結 果,図6に 示 し た よ う な 配 列 に よ り,MMP2(お よ び MMP9)で 特 異 的 に切 断,活 性 化 され る改 変Foを デ ザ イ ンす る こ と に 成 功 した.な お,こ の 改 変Fo配 列 を もつ ベ ク ター は本 来 の ベ ク ター と異 な り,ト リプシ ンでは切 断,活 性 化 を 受 け な か っ た.図6で は,MMP2,9を 分 泌 す る ヒ ト線 維 肉 腫 細 胞 株HT1080を 用 い てin vitroで の 実 験 に よ り本 ベ ク ター の 感染 特 異 性 を 示 して い る が, HT1080細 胞 で はF開 裂 配 列 を改 変 す る こ と に よ り,遺 伝 子 導入 に続 き,強 い シ ン シチ ウ ム形 成 が 認 め られ,細 胞 融 合 型 の 感 染 が 成 立 した.な お,MMP2,9を 発 現 しな い 細 胞 で は,F開 裂 配 列 を 改変 して も シ ン シチ ウ ム 形 成 は ま っ た く起 こ らな か っ た.こ の こ と は,MMP2,9を 発 現 す る癌 細 胞,組 織 に 本 ベ ク タ ー を 感 染 す る こ と に よ り,感 染 部位 の さ らに 深 部 の癌 領 域 へ 特 異 的 に 感 染 が 可 能 と な る こ と を示 唆 して お り,現 在,小 動 物 を用 い た 移 植 癌 モ デ ル の 系 で 本 ベ ク ター に よ る治 療 効 果 の 検 討 を 行 な っ て い る. お わ り に 遺 伝 子 治 療 の 重 要 性 を考 え る と き,真 に 治 療 効 果 が 望 め る,安 全 性 の 高 い 遺 伝 子 導 入 法 の 開 発,実 用 化 が 急 務 で あ る 。 十 分 に 高 い 遺 伝 子 導 入 能 と発 現 能 が 基 本 的 に求 め られ る ほか,遺 伝 子 治 療 が 広 範 に 使 用 され る よ う に な る た め に は,患 者 の 染 色 体 と原 理 的 に も相 互 作 用 しな い ベ ク ター が 絶 対 的 に 必 要 で あ る.そ の よ う な意 味 で,筆 者 らが 開 発 して い るSeVベ ク ター は 「細 胞 質 遺 伝 子 治 療 」 の新 しい 概 念 の 遺 伝 子 治 療 を実 現 す る技 術 と して 重 要 な もの と考 え て い る.す で に 臨床 研 究 の 計 画 が 進 行 中 で あ るが,新 しい ベ ク ター と して の改 良 研 究 も今 後 必 須 で あ る。 また,遺 伝 子 治療 以 外 に もワ クチ ン と して の 利 用 も有 望 で あ り,こ の 基 盤 技 術 の 多 面 的 な応 用 を 国 内 外 の研 究 者 との 共 同 研 究 に よ り図 って い きた い.こ の 実 用 的 技 術 が,日 本 で 育 っ て き たSeVの リバ ー ス ジ ェ ネ テ ィ クス を基 盤 に した もの で あ る こ と は い く ら強 調 して も 強 調 し過 ぎる こ と は な い で あ ろ う. 本 研 究 に際 し,多 大 な ご協 力,ご 指 導 を い た だ き ま した 現 富 山 県 衛 生研 究 所 の 永 井美 之 所 長,国 立感 染 症 研 究 所 の加 藤 篤 博 士, 九 州 大学 大 学 院 医学 系 研 究 院 の 米 満 吉和 博 十,岩 手 大 学 農 学 部 の 平 秀 晴博 士 に深 謝 い た し ます.

1) Hacein-Bey-Abina S., von Kalle, C., Schmidt, M., Le Deist, F., Wulffraat, N., McIntyre, E., Radford, I., Villeval, J. L., Fraser, C. C., Cavazzana-Calvo, M., Fischer, A. : N. Engl. J. Med., 348, 255-256(2003)

2) Lamb, R. A., Kolakofsky, D. : in Fields virology (ed. Fields, B. N., Knipe, D. M., Howley, P. M.), pp. 1177-1204, Lippin cott-Raven, Philadelphia (1996)

3) Nagai, Y., Kato, A. : Microbiol. Immunol., 43, 613-624 (1999) 4) Kido, H., Yokogoshi, Y., Sakai, K., Tashiro, M., Kishino, Y., Fukutomi, A., Katunuma, N.: J. Biol. Chem., 267, 13573-13579(1992) 図6 M欠 失 型 ベ クタ ー でのF開 裂 配 列の 改変 と改変 型M 欠 失 型 ベ ク タ ー で のMMP発 現 依 存 的 感 染 の 拡 大 (a)M欠 失 型 ベ ク タ ー の 構 造 とF蛋 白 質 の 開 裂 配 列 の 改 変.M 欠 失 型 ベ クタ ー のF遺 伝 子 の 開 裂 配 列 部 分 をMMP2,9の 認 識 配 列 と な る よ う に改 変 した.野 生 型(上 段)に 対 しMMP2,9で 開 裂 す る 改 変型 配 列(下 段)を 示 す, (b)改 変型M欠 失 型 ベ ク ター で のMMP発 現 依 存 的感 染 の 拡 大. MMP2,9を 発 現 す るHT1080細 胞 株 で は,改 変 型M欠 失 型 ベ ク タ ー で の み ベ ク タ ー の 隣 接 細 胞 へ の 浸 潤 が 観 察 さ れ る.MMPを 発 現 しな い ヒ ト大 腸 癌 細 胞 株SW620で は,ベ ク タ ー の 浸 潤 は観 察 さ れ ない.

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5) Arai, T., Matsumoto, K., Saitoh, K., Ui, M., Ito, T., Mu rakami, M., Kanegae, Y., Saito, I., Cosset, F.-L., Takeuchi, Y., Iba, H. : J. Virol., 72,1115-1121(1998)

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7) Li, H.-0., Zhu, Y.-F., Asakawa, M., Kuma, H., Hirata, T., Ueda, Y., Lee, Y.-S., Fukumura, M., Iida, A., Kato, A., Nagai, Y., Hasegawa, M. : J. Virol., 74, 6564-6569 (2000)

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9) Shiotani, A., Fukumura, M., Maeda, M., Hou, X., Inoue, M., Kanamori, T., Komaba, S., Washizawa, K., Fujikawa, S., Yamamoto, T., Kadono, C., Watabe, K., Fukuda, H., Saito, K., Sakai, Y., Nagai, Y., Kanzaki, J., Hasegawa, M.: Gene Ther., 8,1043-1050 (2001)

10) Masaki, I., Yonemitsu, Y., Komori, K., Ueno, H., Nakashima, Y., Nakagawa, K., Fukumura, M., Kato, A., Hasan, M. K., Nagai, Y., Sugimachi, K., Hasegawa, M., Sueishi, K.: FASEB J., 15,1294-1296 (2001)

11) Ikeda, Y., Yonemitsu, Y., Sakamoto, T., Ishibashi, T., Ueno, H., Kato, A., Nagai, Y., Fukumura, M., Inomata, H., Hase gawa, M., Sueishi, K.: Exp Eye Res., 75, 39-48 (2002)

12)宮 崎 勝 徳 ・長 谷 川 護 ・伊 東 啓 行 ・米 満 吉 和:医 学 の あ ゆ み,203,357-362(2002)

13) Homann, H. E., Hofschneider, P. H., Neubert, W. J.: Virol ogy, 177,131-140 (1990)

14) Tokusumi, T., Iida, A., Hirata, T., Kato, A., Nagai, Y., Hase

gawa, M. : Virus Res., 86, 33-38 (2002)

15) Masaki, I., Yonemitsu, Y., Yamashita, A., Sata, S., Tanii, M., Komori, K., Nakagawa, K., Hou, X., Nagai, Y., Hasegawa, M., Sugimachi, K., Sueishi, K. : Circ Res., 90,966-973 (2002) 16) Onimaru, M., Yonemitsu, Y., Nakagawa, K., Masaki, I.,

Tanii, M., Okano, S., Shirasuna, K., Hasegawa, M., Sueishi, K.: Circ Res., 91, 723-730 (2002)

17) Inoue, M., Tokusumi, Y., Ban, H., Kanaya, T., Shirakura, M., Tokusumi, T., Hirata, T., Nagai, Y., Iida, A, Hasegawa, M. J. Virol., 77, 6419-6429 (2003) 飯 田 章 博 略 歴:1983年 東 京 大 学 大 学 院 理 学 系 研 究 科 修 士 課 程 修 了. 同 年 ワ シ ン トン州 立 大 学 生 化 学 科 研 究 員,1984年 協 和 発 酵 工 業(株)入 社,研 究 員,主 任 研 究 員 を 経 て,1998年 よ り(株) デ ィナ ベ ック 研 究 所 へ 出 向,現 在,研 究 開 発 部 長,そ の 間, 理 学 博 士(1993年 東 京 大 学),シ テ ィー オ ブ ホ ー プ 国 際 医 療 セ ン タ ー 客 員 研 究 員(1994∼1996年).研 究 テ ー マ:新 規 遺 伝 子 治 療 用 ベ ク タ ー の 開 発.関 心 事 ・抱 負:日 本 発 の 新 規 ベ クタ ー の 開 発 と実 用 化 . 長 谷 川 護 略 歴:1967年 東 京 大 学 理 学 部 生 物 化 学 科 卒 業,同 年 協 和 発 酵 工 業(株)入 社,研 究 員,主 任 研 究 員 を 経 て,1993年 主 席 研 究 員.そ の 間,理 学 博 士(1979年 東 京 大 学),ス イ ス 工 科 大 学 微 生 物 研 究 所 客 員 研 究 員(1981∼1983年),1995年 よ り (株)デ ィ ナ ベ ック 研 究 所 に 出 向,取 締 役 研 究 所 長.研 究 テ ー マ:新 規 遺 伝 子 治 療 用 ベ ク タ ー の 開 発 .関 心事 ・抱負: 遺 伝 子 治 療 を コ ア と す る ビ ジネ ス の 実 現. meeting 第53回 科学講演 会 「遺 伝 子 治 療 と再 生 医 療 」 日 時 平 成15年9月19日(金)18:00∼20:45 会 場 有楽 町朝 日 ホー ル(有 楽 町マ リオ ン11階/JR有 楽 町 駅 前) 演 題 イ ンタ ー フ ェ ロ ン と遺伝 子 治 療 吉 田 純(名 大 院医)/中 枢 神 経 系再 生 医学 岡 野 栄 之(慶 應 大 医) 入 場 料 無料 ・予 約 不 要(当 日先 着 順,定 員630名) *ご 来聴 の 方 に は,後 日講 演 記 録 を進呈 いた し ます.

問合せ先 (財)東 レ科 学 振 興 会 Tel. 047-350-6103 FAX 047-350-6082 E-mail : [email protected]

http://www.toray.co.jp/aboutus/tsf/kagaku.html symposium

群馬大 学 国際 シンポジ ウム 「神 経 伝 達 物 質 放 出 とホ ル モ ン分 泌 の 分 子 機 序 」

日 時 平 成15年11月21日(金)・22日(土)

会 場 群 馬 会 館(群 馬 県前 橋 市 大 手 町2-1-1)

プ ロ グラ ム Membrane Fusion : Erwin Neher (Germany), Richard W. Tsien (USA), Alan D. Grinnell (USA), 高 橋智 幸(東 大),河 西 春 郎(生 理 研),高 橋 正 身(北 里 大)

Vesicle Trafficking : Timothy A. Ryan (USA), Wolfhard Almers (USA), William J. Betz (USA), 黒 見 坦(群 馬 大),泉 哲 郎(群 馬大),柴 田 宏(群 馬大)

参 加 費 無料

演題募集 ポ ス ター発 表募 集 中

連 絡 先 群馬大学 医学部行動生理学教室 黒見 坦 Tel. 027-220-8041 E-mail : [email protected]

http://www.gunma-u.ac.jp/information/shinpol.html