原 著 〔東女医大誌 第63巻 第2号頁151∼157．平成5年2月〕
肺成長障害モデル動物における喫煙曝露の肺に及ぼす影響
東京女子医科大学第1内科学教室（主任：金野公郎教授） マツ ミヤ ハル コ松 宮 晴 子
（受付 平成4年10月13日） Tlle Ef正ect of Cigarette Smoke Exposure on Hypoplastic hngs in RatsHaruko MATSUMIYA
Department of Medicine I（Dir㏄tor：Prof． Kimio KONNO） Tokyo Women’s Medical College W6 hypothesized that hypoplastic lungs were susceptible to the development of emphysema． Bromodeoxyuridine（BrdU）were used to make hypoplastic lung model animals． Animals were injected with BrdU， and were exposed to cigarette smoke for 10 weeks when they were at maturity． The result is that lungs of BrdU−injected and smoke・exposed animals showed a reduced weight and a higher distensibility． Although there was no difference in pressure・volume characteristics and morphometric measurements between experienced animals and control animals， scanning electron・microscopic observation revealed that the alveolar fenestrae were clearly increased in BrdU−injected and smoke− exposed animals． We suggest that the董ungs injured when they are developing are susceptible to alveolar destruction to cigarette smoke and may develop to alveolar destruction recognized as emphysema at later age． 緒 言 喫煙と慢性閉塞性肺疾患（chronic obstructive pulmonary disease，以下COPD）との関連性につ いては従来多くの検索がなされてきた1）∼6｝．これ らの研究から今日，喫煙はCOPDの発症・進展に おいて主たる病因の1つであると目されるに至っ た．一方，肺の機能と構造の比較研究により，COPDを特徴づける呼気閉塞障害は主として肺
気腫によって招来されることが明らかとなってき た7）．しかし，喫煙者のすべてが臨床上観察される 肺気腫へ進展するとは限らず，また，呼気閉塞障 害は喫煙者の10∼15％のみに認められることが知 られている8）9》．これらの所見から，喫煙者の中に COPDとして臨床的にとらえられ，やがて肺気腫 に進展する喫煙易感受性のあることが考えられて きた．近年，Burrowsら10）やBarkerら11）はCOPDへの進展因子として小児期の呼吸器感染
症の重要性を指摘している．また，Castleman ら12）は，動物実験において成長期のラヅトに肺の 感染をもたらし，その後肺の成長障害が発生した ことを指摘した． 以上の所見から私共は，肺の成長障害が喫煙易 感受性因子になりうるとの仮説をたて，DNA傷 害をもたらすbromodeoxyuridine（以下BrdU） による肺成長障害モデル動物13）に喫煙曝露を長期 に行い，その後にみられる肺の形態学的・機能的 変化について検索を行った． 対象および方法 24匹のFisher系雄iラット（Charles River Bτeeding Laboratoryゴ1（anagawa）を用いた． DNA障害物質としてthym三dineのアナロ「グであ るBrdU（Sigma， MO）を0．3％carboxymethyl− cellulose（Sigma， MO）液に溶解し，10mg／ml濃 度．に調整し使用した．Thymidine（Sigma， MO）日後6日 8日
⑤①
貿＿買
⑤・B・dU ①・T・…d… ⑦貿」2
8週齢 ↓ 屠殺 ↓ 喫煙曝露 10週間 Brd U群馬B報煙群
喫煙群 対照群 図1 実験方法 生後6日目にBrdUを腹腔内投与し，8週齢から10週間にわたって喫煙曝露を行っ た． は生理食塩水に60mg／mlの濃度に溶解したユ4）． 1．動物処理 実験方法を図1に示す．生後6日目に1mg／g体重当てのBrdUを腹腔内に投与し2日後に8倍
モル量のthymidine液を腹腔内に投与した，対照群の動物にはBrdUの溶解液であるcarbox・
ymethylcellulose液を同量当て腹腔内投与した． これらの動物を充分量の餌と飲水のもとに8週齢 まで飼育した後，各動物群を2群に分け，一方に は喫煙曝露を行いBrdU＋喫煙群， BrdU群，喫煙 群と対照群の4群をもうけた．喫煙曝露は図2に 示す30cm×35cm×10cmの曝露チャン・ミー内に 動物を入れ，1日6本目紙巻きタバコの主流煙に 10週間にわたり連日曝露を行った．喫煙曝露が終 了した時点ですべての動物にペソトバルビタール を腹腔内に注入し，腹部大動脈を切開し脱血，屠 殺した．ついで前胸壁切開にて開胸したのち肺を 切離し，気管に18Fのアーガイルカニューレを挿．入し200mmHg圧にて脱気した．その後，30cm
H20圧に拡張させた肺から0．5m1ずつOcm H20 圧まで脱気し，air−filled pressure−volume （de且ation curve）studyを行った、 Pressure− volume curveにひきつづき肺門重量（wet lung weight）の計測をした後，各群2検体を免疫組織 化学的検索のため70％エタノールにて固定した． 他の肺は，2．5％グルタールアルデヒド固定液を syringe cigarette壁
chamber知∠⊃＿＿
図2 喫煙装置 モーターで注射器内筒を上下し，紙巻きタバコの主流 煙をチャンバー内に送気した． アーガイルチューブを通じて肺内に注入し，20cm H20圧で24時間以上肺を伸展固定した．拡張固定 された肺をSherleの方法15）に従い水置換法によ り肺容積（lung volume）を測定した．固定された 興野矢状断面において3μmの厚さの肺の縦断切 片を作製し，hematoxyline℃osin（H−E）染色を 施した． 2．免疫組織化学 エタノール固定肺をパラフィン包埋，矢状断面 にて肺の3μm縦断切片とし脱パラフィン後，3N塩酸処理をし抗BrdUモノクロナール抗体
（Beckton Dickinson社）と反応させた．その後ビ オチン化標識抗マウスIgG，酵素標識ストレプトアビジン試薬を作用させDAB発色の後，ヘマト キシリンによる核染色を行った． 3．形態計測 形態計測はスライドをプロジェクター上に200 倍に拡大し，一辺10．75cmの正方形内に一定の間 隔で42個うたれたポイントと，13．9cm長の交叉 するライン上でstrati丘ed random sampling法の もとに，定められた10の領域において行われた． 計測された値をもとにmean linear intercept （MLI）， mean chord length（MCL），平均肺胞壁 厚（Tw），肺胞表面積／肺容積（Sa／V）を算出し た16）． 4．走査電顕 走査電顕観察には光顕形態計測用に採取した肺 切断面の外側より一辺が5mm大の組織片を採取 し，1％オスミック酸（pH7．4カコジル酸緩衝）に て固定した．その後，エタノールの上昇系にて脱 水，臨界点乾燥し組織の表面を白金台着し走査電 子顕微鏡（Hitachi HHS−2R）を用いて肺胞表面 の構造について観察した． 5．血液検査
腹部大動脈から採取した血液は，血球算定
（WBC， Hb， Ht），生化学検査（TP， GOT， GPT， LDH，コレステロール，中性脂肪， BUN，クレア チニン），ホルモン（コルチコステロン）測定に用 いた． 6．統計 測定値はすべてmean±SEで表示し，各群間の 有意差はStudent t−testおよび多重比較（Scheffe F−test）にて行いp〈0．05を統計学的に有意差あ りとした． 結 果 1．免疫組織化学 抗BrdUモノクロナール抗体を用いて染色し た肺組織標本においては（図3），BrdU陽性細胞 は主として肺胞上皮，間質細胞に観察された．そ の他の領域では胸膜中皮細胞や気道上皮細胞にも これらのBrdU陽性細胞が観察されたが，その頻 度はごくわずかで散見される程度であった．肺胞におけるBrdU陽性細胞の出現頻度を図4に示
す．上皮細胞，間質細胞におけるBrdU陽性細胞 図3 免疫組織化学 BrdU陽性細胞（茶褐色）は，主として肺胞上皮細胞や 間質細胞に認められた， 蕊 ；20 8 選 塁 弓lo 占 お § 餌 0 奮ユ。 言・ 1・ 1・ 1・ 匿。 肺胞上皮細胞 間質細胞 肺胞上皮細胞 間質細胞 図4 左：BrdU陽性細胞出現頻度 右：単位肺面積あたりのBrdU陽性細胞数 の出現頻度は（図4左）それぞれ19．27±1．67％， 13．86±1．37％であり問質細胞に比較して肺胞上 皮細胞でBrdU陽性細胞を高率に認めたが，単位 肺面積あたりのBrdU陽性細胞の数においては （図4右）肺胞上皮細胞が1．66±0．25，間質細胞が 8．76±0．50と肺胞上皮細胞に比して間質細胞が有 意に多いことが知られた． 2．体重，肺重量，肺容積 各動物の体重，speci五。 lung volume（肺容積／ 体重），speci且。 lung weight（肺重量／体重）と肺 容積／肺重量を表1に示す．体重はBrdU＋喫煙群 および喫煙群がBrdU群或いは対照群に比較し て有意に低値を示した．Speci丘。 lung weightも統 計学的に有意差はないもののBrdU＋喫煙群，喫 煙群で低値の傾向を示した．Speci丘。 lung volume表1 各群の体重，肺重量，肺容積 Body weight iBW） （9）
W柵9欝ht
Speci丘。 lung iL鷲職） ×10−3 Speci丘。 lung @ volume @（LV／BW） icm3／9）×10−2 LV／LW icm3／9） 対照群 335±4＊＃ 1．11±0．08 3．28±0．25 3．07±0，19 9．4±0．31 BrdU群 337±6＊＃ 1．05±0．08 3．20±0．22 3．20±0．13 10．5±0．28 喫煙群 302±5＃ 0．88±0．06 2．89±0．25 3．13±0．14 11．0±0．85． BrdU {喫煙群 299±3＊ 0．83±0．03 2．76±0．09 3．28±0．10 11．9±0．20 ・，＃：それぞれ統計学的有意差あり（p〈0．05） に関しては各群間に特に差は認められなかった． 肺容積／肺重量はBrdU＋喫煙群〉喫煙群≧BrdU 群〉対照群の順に高値を呈し，BrdU＋喫煙動物 の肺が最も伸展性の高いことが知られた． 3。Pressure・volume curve Pressure−volume（deHation）curveについては， いずれの肺容積においても各二間に有意な差は認 められなかった． 4．形態計測 表2にMLI， MCL， Tw， Sa／Vを示す．4三間の比較では，MLI， MCLにおいて喫煙群が
BrdU群に比して有意に（p＜0．05）低値を示した． また，Sa／Vについても喫煙群とBrdU群の間に 有意差（p＜0．05）が認められた．その他の計測値 については4群間での差は認められなかった．喫 煙曝露を行った動物（BrdU＋喫煙群，喫煙群）と 非曝露動物（BrdU群，対照群）で体重が有意（p＜ 0．05）に異なっているため，喫煙曝露（BrdU十喫 煙群対喫煙群）・非曝露（BrdU群言対照群）のそ れぞれの群内での比較を行った．その結果いずれ の項目も有意差に至らな：かったが，BrdU＋喫煙 群は喫煙群に比し，また，BrdU群は対照群に比較 しMLIが高値を， Sa／Vが低値を示した． 5．走査電子顕微鏡観察 BrdU＋喫煙群の肺（図5a）では対照群（図5d） に比較して肺胞壁はやや菲薄化しており，その肺 胞には一様に散在する小孔が多数観察された。一 方BrdU群（図5b），あるいは喫煙群（図5c）においては肺胞壁がやや菲薄化しているものの
BrdU÷喫煙群で観察されたような肺胞孔はごく 表2 各群の形態計測 MLIiμm）
MCL
iμm） iμm）Tw
Sa／Vim−1）X103対照群 74．6±2．43 36．5±1．13 2．9±0．25 55．0±1．97 BrdU群 82．8±2．29 39．6±0．47 3．6±0．30 48．4±1．32 喫煙群 69．6±3．23 35．2±1．50 3．3±0．26 57．7±2．55 BrdU {喫煙群 76．2±0．64 37．4±127 3．3±0．32 52．5±0．44 Pvalue NS NS
NS
NS
NS：有意差なし MH：mean】inear intercept， MCレmean chord lengtL of alveoli， Tw：wa1疑hickness， Sa／V：alveolar surface area per unit lung volume わずかしか認められず，対照群の肺胞構築とほぼ 同様の形態像を示した． 6．血液検査 血算，生化学検査のいずれの項目においても有 意差は認められなかった．肺成長に影響を及ぼす コルチコステロンは，対照群では422±39ng／ml， BrdU群442±18ng／ml，喫煙群552±92ng／ml， BrdU＋喫煙群446±26ng／mlと，各群間に有意差 は認められなかった． 考 察 本研究において，肺の成長期にBrdUを投与し た動物に長期の喫煙曝露を行った場合肺胞に小孔 が多数形成されることが知られた．一方，BrdU処 置のみ或いは喫煙曝露のみ行った動物の肺胞には かかる小孔は観察されなかった．肺の伸展性（肺 容積／肺重量）はBrdU＋喫煙群が最も高く次いで 喫煙群・BrdU群，対照群の順であった．肺重量，聡蹴球雌
騨 轟卓 図5 肺の走査電子顕微鏡像 BrdU＋喫煙群（a），喫煙群（b）， BrdU群（c），対照群（d）。灘灘
形態計測で評価した肺の構築やair一丘11ed
pressure・volume curveから求めた肺のstability に関しては，上記4群の間に差は認められなかっ た． 肺胞の破壊に関しては，小葉中心型の肺気腫で は肺胞孔が多数みられるが17），汎細葉型肺気腫で は肺の拡張があるものの小葉中心型肺気腫に観察 されるような拡大した肺胞孔はほとんどみられな いとKuhnらは走査電子顕微鏡観察により報告し た18）．本研究ではBrdU＋喫煙動物の肺に，ヒトの 小葉中心型肺気腫で観察された肺胞破壊と類似し た肺胞孔の形成といった形態変化を観察すること ができた．BrdU＋喫煙曝露動物の肺のみに肺胞 孔のサイズや数の増大でみられる肺胞破壊が生じ た理由については今回の研究では明らかにするこ とはできなかった．しかし，本研究では免疫組織 化学的検索によりBrdUが細胞の核に取り込ま れていることを示したが，従来これらのBrdU陽 性細胞のDNAは傷害を受けており19），機能的に も異常となっていることが指摘されている20）． 従って，肺胞孔の形成についてはBrdU投与動物 では肺の修復障害が関与していた可能性が考えら れる．今回BrdU陽性細胞は肺の上皮細胞に比し て間質細胞により多く認められた．これらの所見 は，結合織の修復に不可欠な働きをしている線維 芽細胞を主体とした間質細胞の機能がBrdUに よって傷害され，その結果喫煙により傷害された 肺の組織修復が充分になされず，組織欠損として の肺胞孔の形成をもたらした可能性を示唆するも のである． 肺胞孔形成に関する他の可能性として，BrdU によって成長が障害された肺では吸入物質や異物 を排除する防御機構の低下が生じていることが考 えられる．既に報告されたように，BrdUを投与さ れた動物の肺は一見肺気腫様の粗大な構造を示し ていた21）．気腫肺では異物の浄化機能が低下して いることが報告されている22）．従ってこれらの構 造異常の肺では，喫煙に含まれる肺胞傷害物質の 排除が十分に行われずに肺内に大量に沈着し，そ の結果肺胞破壊を生じたとも考えられる． 今回の研究では，BrdU＋喫煙動物にのみ肺胞 孔がみられたにもかかわらず，肺の生理学的或い は形態学的計測値に関しては，BrdU投与群・非投 与群の間に差が認められなかった．その理由は明 らかではないが，評価に用いた形態計測やair一 躍led pressure−volume curveは本研究で肺に生 じた変化を捕捉しうるほど鋭敏な方法ではなかっ たことが考えられる．肺結合組織の生化学的検索， 或いはsaline・丘lled pressure−volume curveによ る肺胞サーファクタソトの影響を除いた肺間質の力学的検討により4野間の差を見出せた可能性が あるが，今回の研究ではかかる検索は行われな かった．しかし，BrdU＋喫煙群と喫煙群の形態計 測結果について比較した場合，統計学的に有意差 には至らなかったものの，前者で肺胞壁間距離 （MLI）が高値であり，また，肺の拡張性（disten− sibility）の指標となる肺胞表面積／肺容積（Sa／V） が三値を示した．これらの所見から，喫煙はBrdU 投与動物に，より強い組織障害をもたらしたこと カミうかがえる． 今回，肺の成長因子の1つであるコルチコステ ロンの測定も行われたが，実験群・対照群の間に は差はみられなかった．また，血液・生化学的検 査値についても4群間でとくに差は認められな かった．従って，BrdUおよび喫煙中に含まれる物 質が肝障害による低蛋白血症や腎障害による成長 因子の低下といらた他の臓器を介して肺に変化を 及ぼした可能性は低いと考えられる． 今日までにエラスターゼやパパインなどのプロ テアーゼ投与による肺気腫実験がなされてきてい るが，これらの動物に作製された肺気腫は，肺胞 が単に拡張し肺胞構造が粗大にになっており，ヒ トの汎細葉型肺気腫に近似した形態像であった． しかし，喫煙によって生ずるヒトの肺気腫は小葉 中心型持気腫であり，異常な肺胞孔の出現が特徴 的形態像である．今回の私共の研究においては， 予め肺に成長障害をおこさせた異常な肺構築をも つ動物に対して喫煙曝露を10週間行った場合，多 数の大きな肺胞孔が認められ，ヒトの喫煙者にみ られる小葉中心型肺気腫と類似した肺胞変化を持 つ動物を作製することができた．これらの結果か ら，肺の成長障害は喫煙に対する易障害性の1因 子となり，これらの肺をもつ患者が喫煙をした場 合，肺気腫へと進展しうる可能性が示唆される． 結 論 BrdU投与により肺の成長障害をもたらした場 合に喫煙が加わると，肺胞孔が多数形成され，ヒ トの中心型肺気腫に類似した形態変化をもたらす ごとが知られた．一方，喫煙のみではこのような 形態異常は観察されなかったことから，喫煙によ る肺気腫の進展には肺の成長障害が因子となりう ることが示唆される． 稿を終えるにあたり，ご指導ご教授賜りました東京 女子医科大学第1内科学教授金野公郎主任教授に深 謝致します．またこの研究に際し終始直接ご指導賜り ました永井厚志助教授に深謝致します． 本論文の要旨は第31回日本胸部疾患学会総会（1991 年大阪）において発表した． 文 献 1）Anderson DO， Ferris BJ Jr＝ Role of tobacco srnoking in the causation of chronic respira・ tory disease． N Engl J Med 267：787−794，1962 2）Rom WN， Kanner RE， Renzetti AD Jr et al： Respiratory disease in Utah coal miners． Am Rev Resp Dis 123：372−377，1981 3）1、ebowitz MI）， Burrows B：Quantitative rela− tionships between cigarette smoking．and chronic productive cough． Int J Epidemiol 6： 107−113， 1977 4）Fletcher C， Peto R， Tinker C et a1： The Natural History of Chronic Bronchitis and Emphysema．（Fletcレer C eのpp34−105，0xford University Press， New York（1976） 5）Bosse R， Sparrow D， Rose CI． et aL Longitu・ dinal effect of age and smoking cessation on pulmonary function． Am Rev Resp Dis 123： 378−381， 1981 6）Beaty TH， Menkes HA， Cohen BH et al： Risk factors associated with longitudinal change in pulmonary function． Am Rev Respir Dis 129：660−667，1984 7）Nagai A， West WW， Thurlbeck WM：The National institutes of health intermittent posi− tive pressure breathing trial：Pathology studies II。 Correlation between morphologic且ndings， clinical findings and evidence of expiratory air−flow obstruction。 Am Rev Resp Dis 132： 946−953， 1985 8）Jhonston RN， McNeil RS， SmitL DH et al： Chronic bronchitis：Measurements and obser・ vations over 10 years． Thorax 31：25−29，1976 9）Diener CF， Burrows B： Further observations on the course and prognosis of chronic obstruc・ tive lung disease． Am Rev Respir Dis 111： 719−724， 1975 10）Burmws B， Ku皿dson RJ， Lebowitz MD： The relationship of childhood respiratory ill− ness to adult obstructive airway disease． Am Rev Resp Dis 115：75！，1971 11）Barker DJP， Osmond C：Chiidhood respira．
tory infection and adult chronic bronchitis in England and Wales. Br Med J 293 : 1271-1273,
1986
12) Castleman WL, Sorkness RL, Lernanske RF et al: Neonatal viral bronchilitis and monia and alveolar hypoplasia in rats. Lab Invest 59 : 387-392, 1988
13) Nagai A, Matsumiya H, Yasui S et al: Administration of bromodeoxyuridine in early postnatal rats results in lung changes at rity. Exp Lung Res (in press)
14) Tone S, Tanaka S, Kato Y: The inhibitory effect of 5-bromodeoxyuridine on the med cell death in the chick 1umb. Dev Growth Differ 25l381-391, 19983
15) Sherle W : A simple method for volumetry of organ in quantitative stereology. MikrosCopie 26:57-60, 1970
16) Weibel ER; Sterological Methods Vol 1.
Practical Methods for Bi61ogical phometry. Academic Press, New York (1979) l7) Nagai A, Thurlbeck WM : Scanning electron
microscopic observations of emphysema in humans. Am Rev Respir Dis 144 1 901-9e8, 1991 18) Kuhn C III, Tavassoli F: The scanning
tron microscope of elastase-induced
physerna. Lab Invest 34]2-9,
1976-19) Gratzner HG: Monoclenal antibody to
bromo and 5-iododeoxyuridine : A new reagent for detection of DNA replication. Science 218 : 474-475, 1982
20) Tone S, Tanaka S, Kato Y: The cell cycle and cell population kinetics in the programmed cell death in the limb-buds of normal and bromodeoxyuridine-treated chick embryos. Dev Growth Differ 30 : 261-270, 1988 21) rk#s,±.. ta=ags,' ijzlscE-t:hs l alij{i4g-racD lung deveiopment 8 k O waZ trc : 6 ut re ft tt -DNA waSoD kS ee t L -( = H tw utkge. 29 1 7-10, 1991
22) Miller WF, Guemei AM; Respiratory and pharmacologic therapy in COPD. in Chronic Obstructive Pulmoanry Disease (Petry TL, ed), pp90-91, Marcel Dekker, New York (1978)
