牛白血病ウイルス遺伝子量を指標とした地方病性牛白血病の診断法に関する研究

Title

牛白血病ウイルス遺伝子量を指標とした地方病性牛白血病

_{の診断法に関する研究( 本文(Fulltext) )}

Author(s)

宗村, 佳子

Report No.(Doctoral

Degree)

博士(獣医学) 甲第446号

Issue Date

2015-09-24

Type

博士論文

Version

ETD

URL

http://hdl.handle.net/20.500.12099/53641

※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。

牛 白 血 病 ウ イ ル ス 遺 伝 子 量 を 指 標 と し た

地 方 病 性 牛 白 血 病 の 診 断 法 に 関 す る 研 究

2015 年

岐 阜 大 学 大 学 院 連 合 獣 医 学 研 究 科

（ 東 京 農 工 大 学 ）

宗 村 佳 子

目

次

緒 言

1

図 表

9

第 一 章 東 京 都 の と 畜 牛 に お け る 地 方 病 性 牛 白 血 病 発 生 状 況 と

牛 白 血 病 ウ イ ル ス 浸 潤 状 況

14

序 論

14

材 料 お よ び 方 法

15

1 EBL 発 生 状 況

15

2 EBL 牛

15

3 病 理 学 的 検 査

16

4 白 血 球 数 算 定 お よ び リ ン パ 球 比 率 の 測 定

16

5 血 液 お よ び リ ン パ 節 か ら の DNA 抽 出

16

6 リ ア ル タ イ ム PCR 検 査

16

7 抗 体 検 査

17

8 と 畜 牛 の 抗 BLV 抗 体 保 有 調 査

17

結 果

18

1 EBL 発 生 状 況

18

2 EBL 牛 の 病 理 学 的 ・ 臨 床 病 理 学 的 所 見

18

3 EBL 牛 の BLV 遺 伝 子 保 有 状 況

19

4 EBL 牛 の 抗 BLV 抗 体 保 有 状 況

19

5 と 畜 牛 の 抗 BLV 抗 体 保 有 状 況

19

考 察

20

図 表

25

第 二 章 地 方 病 性 牛 白 血 病 発 症 牛 と 牛 白 血 病 ウ イ ル ス 感 染 牛 の

リ ン パ 節 中 の 牛 白 血 病 ウ イ ル ス 量 の 比 較

33

序 論

33

材 料 お よ び 方 法

34

1 対 象 牛 お よ び 抗 体 検 査

34

2 血 液 ， リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 か ら の DNA 抽 出

35

3 定 量 リ ア ル タ イ ム PCR 検 査

36

4 統 計 処 理

36

結 果

37

1 EBL 牛 と BLV 感 染 牛 の BLV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 比 較

37

2 EBL 牛 の 各 リ ン パ 節 間 の BLV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 比 較

37

3 胸 腺 型 牛 白 血 病 牛 に お け る BLV 遺 伝 子 コ ピ ー 数

38

考 察

39

図 表

42

総 括

47

謝 辞

50

引 用 文 献

51

略 語 一 覧

AGID ゲ ル 内 沈 降 反 応 （ agar gel immunodiffusion）

BLV 牛 白 血 病 ウ イ ル ス （ bovine leukemia virus）

EBL 地 方 病 性 牛 白 血 病 （ enzootic bovine leukosis）

EDTA エ チ レ ン ジ ア ミ ン 四 酢 酸 （ ethylene-diamine-tetra-acetic acid）

ELISA エ ラ イ サ （ enzyme-linked immune sorbent assay）

HE

ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン （

hematoxylin-Eosin）

PCR ポ リ メ ラ ー ゼ 連 鎖 反 応 （ polymerase chain reaction）

PHA

受 身 赤 血 球 凝 集 反 応 （

passive hemagglutination）

qPCR

定 量

PCR（ quantitative polymerase chain reaction ）

1 緒 言 牛 白 血 病 は ， 牛 白 血 病 ウ イ ル ス （b o v i n e l e u k e m i a v i r u s ， B L V ） の 関 与 す る 地 方 病 性 牛 白 血 病 （e n z o o t i c b o v i n e l e u k o s i s ， E B L ） と B L V の 関 与 し な い 散 発 性 牛 白 血 病 に 大 別 さ れ る( 4 4 ) 。 牛 白 血 病 に 関 し て の 初 め て の 学 術 的 な 所 見 記 録 は 1 8 7 1 年 ま で 遡 る 。 L e i s e r i n g ( 5 4 ) は 末 梢 血 の 白 血 化 を 起 こ し た 牛 の 脾 臓 に 黄 色 結 節 が 認 め ら れ た と 記 載 し て い る 。 し か し ， 牛 白 血 病 の 病 因 論 に つ い て の 研 究 が 活 発 化 し た の は 2 0 世 紀 半 ば に な っ て か ら で あ っ た 。 1 9 5 0 年 代 以 降 ， ヨ ー ロ ッ パ に お い て 牛 白 血 病 の 発 生 報 告 が 相 次 ぎ( 6 ， 3 2 ， 7 8 ) ， 1 9 6 6 年 に は B e n d i x e n ( 8 ) が 長 年 に わ た る デ ン マ ー ク で の 発 生 状 況 調 査 か ら ， 牛 白 血 病 の 多 く は 地 方 病 的 に 発 生 す る も の で あ り ， そ れ と は 別 に ， 子 牛 型 や 皮 膚 型 と い っ た も の が 散 発 的 に 発 生 し て い る と 報 告 し て い る 。 さ ら に B e n d i x e n ( 8 ) は ， 地 方 病 的 に 発 生 す る 牛 白 血 病 に は ，血 統 あ る い は 飼 養 管 理 面 で の 違 い は 影 響 し て い な い こ と ， 繁 殖 牛 売 買 に 伴 う 移 動 に よ り 本 疾 病 が 拡 が る こ と な ど を 示 し ， 牛 白 血 病 の 原 因 と し て ウ イ ル ス な ど の 感 染 性 因 子 を 強 く 推 察 し て い た が ， こ れ は 証 明 に 至 ら な か っ た 。 そ の 後 ，1 9 6 9 年 に M i l l e r ら ( 6 0 ) は 牛 の リ ン パ 肉 腫 由 来 リ ン パ 球 お よ び そ れ を 接 種 し た 牛 な ど か ら C - t y p e v i r u s に 似 た ウ イ ル ス 様 粒 子 を 回 収 し ，1 9 7 2 年 に は こ の ウ イ ル ス 様 粒 子 を 接 種 し た 牛 に お い て 同 様 の 粒 子 が 回 収 さ れ る こ と お よ び 持 続 性 リ ン パ 球 増 多 が 起 こ る こ と を 確 認 し ，E B L の 原 因 が ウ イ ル ス で あ る こ と を 証 明 し た( 6 1 ) 。 B L V は レ ト ロ ウ イ ル ス 科 オ ル ソ レ ト ロ ウ イ ル ス 亜 科 デ ル タ レ ト ロ ウ イ ル ス 属 に 属 す る 一 本 鎖 R N A ウ イ ル ス で ，プ ロ ウ イ ル ス ゲ ノ ム に 約 8 ，7 0 0 の 塩 基 を 持 つ( 9 1 ) 。粒 子 の 直 径 は 1 0 0 ～ 1 2 0 n m で エ ン ベ ロ ー プ を 有 し ，正 二 十 面

2 体 構 造 を と る( 図 1 ) 。 B L V は ゲ ノ ム 構 造 ， プ ロ ウ イ ル ス の 塩 基 配 列 な ど か ら ヒ ト T リ ン パ 球 向 性 ウ イ ル ス 1 型 （ H u m a n T – l y m p h o t r o p i c v i r u s t y p e 1 ， H T L V - 1 ） ， 同 2 型 （ H u m a n T – l y m p h o t r o p i c v i r u s t y p e 2 ， H T L V - 2 ） お よ び サ ル リ ン パ 球 向 性 ウ イ ル ス 1 型 ( S i m i a n T ‒ l y m p h o t r o p i c v i r u s t y p e 1 ， S T L V - 1 ) と 近 縁 と さ れ る ( 2 0 ， 2 4 ) 。 B L V 遺 伝 子 の 両 端 に は l o n g t e r m i n a l r e p e a t ( L T R ) 領 域 が あ り ，遺 伝 子 中 に は ウ イ ル ス 合 成 に 必 須 で あ る g a g ，p o l ， e n v の 3 種 類 の 遺 伝 子 を 持 つ ( 2 1 ， 8 9 ， 9 0 ) ( 図 2 ) 。 g a g 遺 伝 子 は コ ア タ ン パ ク 質 を ，p o l 遺 伝 子 は 逆 転 写 酵 素 を ， e n v 遺 伝 子 は ウ イ ル ス エ ン ベ ロ ー プ を そ れ ぞ れ コ ー ド す る( 2 4 ) 。ま た ，エ ン ベ ロ ー プ 領 域 と 3 ’ L T R の 間 に は X 領 域 が あ り ， こ こ に は T a x ， R e x ， R 3 お よ び G 4 の 非 構 造 タ ン パ ク 質 を コ ー ド す る 領 域 が あ る 。 B L V 粒 子 中 に は R N A が 二 量 体 と し て 存 在 し ， 主 要 な 構 造 タ ン パ ク 質 と し て カ プ シ ド を 構 成 す る C A タ ン パ ク 質（ p 2 4 ），ヌ ク レ オ カ プ シ ド を 構 成 す る N C ( p 1 2 ) が あ り ( 図 1 ) ， こ の う ち p 2 4 は 感 染 牛 に 対 し て 強 い 免 疫 原 性 を 示 す ( 1 9 ) 。 ま た ， 逆 転 写 に 関 与 す る R T お よ び ウ イ ル ス ゲ ノ ム の イ ン テ グ レ ー シ ョ ン に 関 与 す る I N と い っ た 酵 素 タ ン パ ク 質 が カ プ シ ド 中 に 存 在 す る 。 マ ト リ ッ ク ス タ ン パ ク 質 M A ( p 1 5 ) は カ プ シ ド と エ ン ベ ロ ー プ の 脂 質 層 の 間 に あ り ，エ ン ベ ロ ー プ 中 に は S U ( g p 5 1 ) お よ び T M ( g p 3 0 ) の 二 種 類 の 糖 た ん ぱ く 質 が 見 い だ さ れ て い る 。g p 5 1 は 宿 主 に 強 い 免 疫 を 誘 導 す る こ と か ら 診 断 に 有 用 で あ る 。X 領 域 に 存 在 す る 遺 伝 子 の う ち T a x お よ び R e x は 同 一 の R N A の 異 な る フ レ ー ム に コ ー ド さ れ て お り ，T a x は ウ イ ル ス 遺 伝 子 の 転 写 活 性 を 有 し ， R e x は 転 写 後 の 調 整 因 子 で あ る ( 2 4 ， 1 1 3 ) 。 本 ウ イ ル ス は 宿 主 の リ ン パ 球 ， 単 球 ・ マ ク ロ フ ァ ー ジ 系 の 細 胞 に 感 染 し （1 1 1 ） ， 感 染 し た 動 物 で は ， ウ イ ル ス は 排 除 さ れ る こ と な く 生 涯 持 続 感 染

3 を 続 け る 。 牛 は 本 ウ イ ル ス の 自 然 宿 主 で あ る が( 3 1 ) ， 羊 ， 水 牛 に お い て も 感 染 が 起 こ る ( 1 1 ， 5 6 ) 。 ま た ， 実 験 的 に は 山 羊 ( 7 9 ) ， 豚 ( 5 5 ) ， ウ サ ギ ( 8 0 ， 1 1 2 ) ， チ ン パ ン ジ ー ( 1 0 5 ) な ど 多 く の 動 物 種 に お い て 感 染 が 認 め ら れ て い る 。 B L V が H T L V - 1 お よ び H T L V - 2 と 近 縁 で あ る こ と ( 2 0 ，2 4 ) ，ヒ ト の 血 清 中 に B L V に 対 す る 抗 体 が 高 率 に 見 つ か っ た と の 報 告 ( 1 0 ) が あ る こ と か ら ， ヒ ト へ の 本 ウ イ ル ス の 感 染 に つ い て 危 惧 す る 意 見 も あ る が ，現 在 ま で に B L V が ヒ ト に 感 染 す る と い う 証 明 は な さ れ て い な い 。 牛 で は ，本 ウ イ ル ス に 感 染 し て も 約 7 0 % は 臨 床 上 症 状 を 示 さ な い 無 症 状 キ ャ リ ア ー と な る( 8 8 ) 。 感 染 牛 の 約 3 分 の 1 程 度 が 持 続 性 リ ン パ 球 増 多 症 （P e r s i s t e n t l y m p h o c y t o s i s ， P L ） と な る が ， P L 牛 で も 末 梢 血 の B リ ン パ 球 が 増 加 す る こ と 以 外 に は 臨 床 的 な 異 常 を 示 す こ と は な い 。 ご く 一 部 の 牛 が 年 余 を 経 て E B L を 発 症 す る 。 E B L が 成 牛 型 牛 白 血 病 と 称 さ れ る こ と も あ る よ う に ，好 発 年 齢 は 4 ～ 5 歳 ( 1 1 ， 2 7 ) あ る い は 5 ～ 8 歳 ( 8 1 ) と さ れ る 。発 症 前 に P L を 示 し て い た も の は 3 分 の 2 程 度 で あ り ， E B L 発 症 に P L は 必 ず し も 必 要 な 条 件 で は な い( 1 1 ， 9 4 ) 。 ま た ， B L V 感 染 牛 の う ち ど の 程 度 の 割 合 の 個 体 が E B L ま で 進 行 す る か に つ い て は ， 1 % 以 下 ( 6 6 ) ， 5 ～ 1 0 % ( 8 7 ) ， 5 % 未 満 （1 1 4 ） な ど と さ れ ， 文 献 に よ り 多 少 の 差 が あ る が ， い ず れ に せ よ 発 症 に 至 る 牛 は 数% 程 度 と 考 え ら れ る 。 B L V は ，ウ イ ル ス に 感 染 し た リ ン パ 球 を 含 む 血 液 や 乳 汁 を 介 し て 水 平 伝 播 す る ( 4 4 ) 。 こ の た め ， 除 角 ， 直 腸 検 査 ， 注 射 針 な ど 器 具 の 使 い 回 し と い っ た 人 為 的 な 処 置 や 吸 血 昆 虫 が 感 染 源 と な り う る ( 3 5 ， 7 5 ， 8 4 ) 。 ま た ， 垂 直 伝 播 も あ る が ，子 宮 内 感 染 が 起 こ る 確 率 は ４ ～1 8 % 程 度 で あ る ( 2 5 ， 5 3 ，8 5 ) 。 し か し ， 母 牛 が P L 牛 で あ る 場 合 は 感 染 リ ス ク が 高 ま る ( 2 ) 。 精 液 や 卵 子 を 介 し た 感 染 も 考 え ら れ て い る が ， 大 橋 ら( 8 2 ) は ， B L V 感 染 牛 の 卵 巣 か ら 回 収

4 し た 卵 子 お よ び B L V 感 染 妊 娠 牛 の 胎 子 血 液 か ら の B L V 遺 伝 子 の 検 出 を 試 み た が ， い ず れ か ら も 検 出 さ れ な か っ た こ と か ら ， 卵 子 を 介 し て の 垂 直 感 染 の 可 能 性 は 低 い と 考 え ら れ る 。 ま た ， ウ イ ル ス に 汚 染 さ れ た 乳 に よ り 感 染 が 拡 大 す る 可 能 性 が あ る こ と が 指 摘 さ れ て い る が( 3 5 ) ， F e r r e r ら ( 2 6 ， 2 8 ， 2 9 ) は B L V 感 染 母 牛 か ら の 乳 給 与 を 行 う グ ル ー プ と 行 わ な い グ ル ー プ に つ い て 子 牛 の B L V 感 染 率 を 比 較 し た 結 果 ，乳 汁 感 染 の 可 能 性 は 接 触 感 染 に 比 較 し 少 な い と し て い る 。 初 乳 中 の 移 行 抗 体 の 存 在 は ， 摂 取 子 牛 の 感 染 に 対 し て 予 防 的 に 働 く と さ れ る( 5 2 ， 1 0 6 ) 。 B L V 感 染 に 関 与 す る 様 々 な 飼 養 要 因 が 考 え ら れ て い る が ， 近 年 の 日 本 に お い て は ， 「 つ な ぎ 飼 い で は な い 」 こ と ， 「 除 角 を 実 施 す る 」 こ と ， 「 夏 季 に ア ブ が 非 常 に 多 い 」 こ と が 感 染 伝 播 リ ス ク 要 因 で あ り ， 反 対 に 「 初 乳 給 与 」 は 感 染 率 を 抑 え る 要 因 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る ( 4 6 ) 。 B L V 感 染 牛 は 臨 床 的 な 著 変 を 示 さ な い が ，乳 牛 で は 泌 乳 量 の 減 少 ，乳 脂 肪 率 の 低 下 な ど を 引 き 起 こ す と さ れ ( 9 , 1 7 ) ， B L V 感 染 に よ り も た ら さ れ た 経 済 損 失 は 米 国 に お い て 年 間 4 , 2 0 0 万 ド ル ( 1 7 ) あ る い は 5 億 2 , 5 0 0 万 ド ル と 見 積 も ら れ て い る ( 8 3 ) 。 一 方 で ， B L V 感 染 と 非 感 染 牛 の 間 に 乳 量 や 乳 脂 肪 率 の 違 い は な い と す る 報 告 ( 3 4 ， 3 6 , 3 9 ) お よ び P L 牛 で は 乳 量 が 増 加 す る と い う 報 告 も あ る ( 1 1 0 ) 。 こ の よ う に ， B L V 感 染 に よ る 乳 牛 の 生 産 性 の 低 下 に つ い て は 結 論 が 出 て い な い が ， 予 防 プ ロ グ ラ ム 導 入 や 感 染 牛 の 淘 汰 や 更 新 回 数 の 増 加 ， 商 取 引 上 の 制 限 な ど か ら ，B L V 感 染 は 生 産 者 側 に 経 済 的 な 負 担 を も た ら す 。R h o d e s ら ( 8 7 ) は ， 1 0 0 頭 規 模 の 乳 牛 農 場 で B L V 陽 性 率 が 5 0 % の 場 合 で は ， 感 染 予 防 の コ ス ト に 年 間 6 , 4 0 6 ド ル ， 検 査 や 飼 養 管 理 な ど に 必 要 な 費 用 と し て 1 , 7 6 5 ド ル が か か る と 見 積 も っ て い る 。ま た ， B L V 高 率 感 染 農 場 で は ，消 化 器 ，代 謝 性 疾 患 の 発 生 件 数 が 多 く な る こ と も 示 さ れ て い る ( 4 1 ) 。

5 B L V の 起 源 は ヨ ー ロ ッ パ ，よ り 限 定 的 に は バ ル ト 海 沿 岸 の 現 在 の リ ト ア ニ ア 付 近 と さ れ( 9 3 ) ， 牛 の 輸 出 の 活 発 化 に よ り ， 過 去 5 0 0 年 の 間 に ヨ ー ロ ッ パ か ら 世 界 各 国 に 広 ま っ た( 2 0 ) 。ヨ ー ロ ッ パ に お い て は ，か つ て E B L の 発 生 報 告 が 相 次 い で い た も の の ， 摘 発 淘 汰 を 主 体 と す る 政 府 主 導 の コ ン ト ロ ー ル 策 が 成 功 し 清 浄 化 に 成 功 し た 国 も 多 い ( 1 ， 4 5 ， 7 2 ) 。 欧 州 委 員 会 は ， 2 0 1 3 年 1 2 月 3 1 日 現 在 ，西 欧 お よ び 北 欧 の 大 多 数 は E B L 清 浄 国 で あ る と 宣 言 し て い る( 図 3 ) ( 2 3 ) 。 し か し ， イ タ リ ア の 一 部 地 域 や 東 欧 の 多 く の 国 は 未 だ E B L 清 浄 国 と は な っ て い な い 。 ア メ リ カ で は ，1 9 9 6 年 の 調 査 で は 8 9 . 0 % の 乳 牛 農 場 が B L V に 汚 染 さ れ て お り ，2 0 0 7 年 で は 8 3 . 9 % が B L V 陽 性 と さ れ ，高 い B L V 汚 染 率 が 続 い て い る ( 1 0 4 ) ( 表 1 ) 。 カ ナ ダ に お け る B L V 陽 性 率 は ， 乳 牛 で 2 0 . 8 % ( 1 0 7 ) あ る い は 2 6 . 9 % ( 9 5 ) と の 報 告 が あ る 。 南 米 で も B L V の 陽 性 率 は 高 く ， ア ル ゼ ン チ ン で は 1 5 の 乳 牛 農 場 を 調 べ た 結 果 ， 抗 体 陽 性 率 は い ず れ の 農 場 も 6 6 % 以 上 で あ っ た と い う 報 告 や( 3 3 ) ，8 4 % の 農 場 が 陽 性 で あ り 個 体 レ ベ ル で は 3 2 . 8 5 % が 陽 性 で あ る と い う 報 告 が あ る( 1 0 3 ) 。 ま た ， ウ ル グ ア イ に お い て は 乳 牛 の 5 0 % 以 上 が B L V に 感 染 し て い る と さ れ る ( 8 6 ) 。 エ ジ プ ト で は ， 1 9 9 6 年 に E B L の 発 生 が 初 め て 報 告 さ れ た が ， 発 生 農 場 は ア メ リ カ 輸 入 牛 を 起 源 と し た 牛 群 で あ り ，牛 群 内 で の 2 歳 以 上 の 抗 体 陽 性 率 は 7 2 . 8 % で あ っ た ( 1 1 5 ) 。し か し ， そ の 他 の ア フ リ カ 地 域 で の B L V 浸 潤 状 況 に つ い て の 報 告 は 極 め て 少 な い も の と な っ て い る 。 中 東 地 域 に 関 し て は ， ト ル コ の 乳 牛 で 5 9 . 6 % ( 4 2 ) ， イ ラ ン で は 2 9 . 9 ％ ( 6 3 ) あ る い は 8 1 . 9 % ( 6 5 ) ， ま た ， シ リ ア で は 6 2 . 9 ～ 6 9 . 2 % ( 5 0 ) が 抗 体 陽 性 で あ っ た と の 報 告 が あ り ， 概 し て 高 い 陽 性 率 と 考 え ら れ る 。 パ キ ス タ ン で は 水 牛 で 0 . 3 % ， 牛 に お い て は 0 % と の 報 告 が あ る ( 5 7 ) 。 韓 国 で は ， 乳 牛 で 2 8 . 3 % ， 韓 国 土 着 牛 で 2 . 4 % ( 1 4 ) ， 台 湾 で は 1 9 8 5 年 で 8 . 4 % ， 1 9 8 6 年

6 で 5 . 6 % ( 1 0 8 ) ， ま た ， カ ン ボ ジ ア で は 牛 で 5 . 3 % ， 水 牛 で は 0 % ( 5 8 ) と の 報 告 が あ る が ， い ず れ も 調 査 年 代 が 古 く ， ま た ， 調 査 頭 数 も 少 な く ， 日 本 以 外 の ア ジ ア で の 近 年 の B L V 感 染 率 は 不 明 な 点 が 多 い 状 況 と な っ て い る 。 日 本 に お け る 牛 白 血 病 の 初 報 告 は 1 9 2 7 年 で あ り ， 岩 手 県 に 輸 入 さ れ た 種 雄 牛 で の 発 生 で あ っ た ( 4 9 ) 。 そ の 後 ， 国 内 で も 1 9 7 6 年 に は E B L 症 例 か ら B L V が 分 離 さ れ ( 7 3 ) ，1 9 8 0 年 に は 農 林 水 産 省 家 畜 衛 生 試 験 場 に よ り 初 め て の 全 国 的 な B L V 浸 潤 状 況 調 査 が 実 施 さ れ た ( 3 8 ) 。 1 9 9 8 年 に 牛 白 血 病 は 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に 基 づ く 届 出 伝 染 病 に 指 定 さ れ た が ， そ の 年 の 届 出 数 は 9 9 頭 で あ っ た も の が ， 漸 増 を 続 け ，1 0 年 後 の 2 0 0 8 年 に は 1 , 0 4 0 頭 と 1 0 倍 以 上 と な り ，2 0 1 3 年 に は 2 , 3 1 0 頭 と な っ た ( 7 1 ) ( 図 4 ) 。 伊 藤( 3 8 ) に よ る 調 査 で は ， 国 内 牛 の B L V 陽 性 率 は 1 9 8 0 年 に は 乳 用 牛 で 5 . 8 % ， 肉 用 牛 で 1 1 . 3 % で あ っ た 。 そ の 2 年 後 ， 再 び 同 様 の 調 査 が 実 施 さ れ た が ， そ の 際 に は ， 乳 用 牛 お よ び 肉 用 牛 で そ れ ぞ れ 4 . 2 % お よ び 6 . 0 % で あ っ た ( 3 8 ) 。全 国 的 な B L V 浸 潤 状 況 調 査 は そ の 後 2 5 年 間 実 施 さ れ て い な か っ た が ， 2 0 0 7 年 に 2 0 9 農 場 5 , 4 2 0 頭 を 対 象 に し た 調 査 の 結 果 ， 乳 用 牛 で 3 4 . 7 % ， 肉 用 牛 で 1 1 . 9 % が B L V 陽 性 と な り ， 特 に 乳 用 牛 で の B L V 感 染 率 が 高 ま っ て い る こ と が 示 さ れ た ( 6 9 ) 。 さ ら に ， 2 0 1 0 ～ 2 0 1 1 年 に 行 わ れ た 全 国 調 査 に お い て は 乳 用 牛 で 4 0 . 9 % ， 肉 用 繁 殖 牛 で 2 8 . 7 % と な り ， B L V 感 染 率 が 更 な る 上 昇 を 見 せ て い る こ と が 明 ら か に な っ た ( 7 0 ) 。 と 畜 検 査 で は ， 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に 規 定 す る 家 畜 伝 染 病 お よ び 届 出 伝 染 病 も 検 査 対 象 疾 病 と な っ て お り ， 牛 白 血 病 は ， と 畜 検 査 に よ り 摘 発 さ れ れ ば と 畜 禁 止 あ る い は 全 部 廃 棄 処 分 と な る 重 要 な 疾 病 で あ る 。 平 成 2 3 年 に 全 国 で 見 つ か っ た 牛 白 血 病 発 症 牛 1 , 7 3 1 頭 の う ち ， 6 6 . 5 % に あ た る 1 , 1 5 1 頭 が と 畜 場 で 見 つ か っ て お り ， し か も そ の 7 0 % 以 上 ( 8 2 0 頭 ) は 生 体 検 査 に お い て は 異

7 常 を 呈 し て い な か っ た と さ れ る( 4 7 ) 。 こ の こ と は ， と 畜 検 査 に お け る 牛 白 血 病 診 断 の 重 要 性 の 高 ま り を 示 し て い る 。 全 国 の 食 肉 衛 生 検 査 所 か ら 報 告 さ れ る 牛 白 血 病 症 例 も 増 加 し て い る が( 4 3 ， 5 1 ， 9 2 ， 1 0 1 ) ， こ れ ら 牛 白 血 病 発 症 牛 に つ い て 品 種 や 年 齢 な ど の 詳 細 を 示 す 基 礎 的 な デ ー タ は な い 。 特 に ， 生 後 2 年 半 か ら 3 年 程 度 で と 畜 さ れ る 肥 育 牛 に つ い て は ， 乳 牛 と 比 較 し て 国 内 症 例 報 告 も 少 な く( 9 8 ， 9 9 ， 1 0 0 ， 1 0 2 ) ， と 畜 検 査 に お け る 疾 病 排 除 に 支 障 を き た し て い る 。 現 在 ， と 畜 検 査 に お い て 本 疾 病 が 疑 わ れ る 場 合 は ， 生 体 所 見 ， 剖 見 所 見 ， 血 液 所 見 お よ び 病 理 組 織 所 見 等 を 総 合 し て 診 断 し ， 検 査 の 合 否 を 判 断 し て い る( 1 1 6 ) が ，症 例 の 中 に は 診 断 に 苦 慮 す る も の も あ る 。抗 B L V 抗 体 検 査 や P C R に よ る B L V 遺 伝 子 検 出 な ど の ウ イ ル ス 学 的 検 索 で は B L V 感 染 の 有 無 は 診 断 で き て も ， 発 症 と 未 発 症 を 区 別 す る こ と は で き な い こ と か ら ， 病 理 組 織 検 査 を 補 助 す る 新 た な 病 原 学 的 な 検 査 法 の 開 発 が 求 め ら れ て い る 。 近 年 ， 病 原 体 の 微 量 検 出 法 と し て ， 定 量 リ ア ル タ イ ム P C R 法 ( q P C R 法 ) が 用 い ら れ る よ う に な っ て き た( 1 3 , 1 5 ) 。 リ ア ル タ イ ム P C R で は ， 増 幅 産 物 量 に 比 例 し て 得 ら れ る 蛍 光 強 度 を ， 目 的 遺 伝 子 の 量 が 既 知 で あ る 標 準 物 質 の 蛍 光 強 度 と 比 較 す る こ と で 遺 伝 子 の 定 量 が 可 能 と な る 。E B L を 発 症 し て い る 牛 で は B L V 感 染 牛 に 比 較 し B L V 遺 伝 子 量 が 有 意 に 高 い こ と が 示 さ れ ， 本 方 法 の E B L 診 断 へ の 応 用 が 期 待 さ れ て い る ( 9 6 ) 。 そ こ で 本 研 究 で は ， 最 初 に ， と 畜 場 に 搬 入 さ れ た 肥 育 牛 に お け る E B L 発 生 状 況 な ら び に と 畜 検 査 の 過 程 で 発 見 さ れ た E B L 牛 に つ い て の 病 理 学 的 検 査 ， 白 血 球 数 算 定 ，B L V 遺 伝 子 検 査 お よ び 抗 B L V 抗 体 検 査 を 実 施 し ， そ の 結 果 に つ い て 考 察 し た 。さ ら に ，肥 育 牛 に つ い て の B L V 浸 潤 状 況 に 関 す る 情 報 が 乏 し い こ と か ら （6 9 ， 7 0 ） ， 搬 入 さ れ た 肥 育 牛 を 対 象 と し て 抗 B L V 抗

8

体 保 有 状 況 調 査 を 行 い ， 年 度 お よ び 品 種 間 で の 差 異 に つ い て 比 較 検 討 を 行 っ た 。次 に ，q P C R 法 の E B L 診 断 へ の 応 用 の 可 能 性 を 検 討 す る た め ，E B L 牛 と B L V 感 染 牛 の 血 液 ， リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 中 の B L V 遺 伝 子 量 を q P C R 法 に よ り 比 較 し 考 察 を 加 え た 。

図1 牛白血病ウイルスの模式図

（文献番号31より改変引用）

図2 牛白血病ウイルスの遺伝子構造

（文献番号31より改変引用）

図3 ヨーロッパにおける地方病性牛白血病の清浄化状況

（文献番号23より改変引用）

地域 国 調査対象 陽性率 調査頭数 調査法 調査年 文献番号 北米 カナダ 乳牛 20.8% 900 ELISA3) ₍₂₀₀₁₎5) ₁₀₇ 乳牛 26.9% 2,814 ELISA (2006) 95 アメリカ 乳牛農場 89.0% 10061) AGID4) 1996 104 バルク乳 83.9% 5342) _{ELISA 2007 104} 南米 アルゼンチン 乳牛 66.0～99.0% 151) ELISA (2012) 33 乳牛農場 32.85% 3631) ELISA 1999 103 中東 トルコ 乳牛 59.6% 109 ELISA 2002～2005 42 イラン 乳牛 29.9% 137 ELISA 2010～2011 63 乳牛 81.9% 403 ELISA (2012) 65 シリア 乳牛 69.2% 237 ELISA 1999 50 アジア パキスタン 牛 0% 76 AGID (2000) 57 水牛 0.3% 370 AGID (2000) 57 カンボジア 牛 5.3% 544 AGID (2000) 58 水牛 0% 42 AGID (2000) 58 韓国 乳牛 28.3% 106 AGID 1981 14 土着牛 2.4% 699 AGID 1981 14 台湾 乳牛 8.4% 4,459 AGID 1985 108 乳牛 5.6% 22,190 AGID 1986 108 黄牛 0% 142 AGID 1985～1986 108 水牛 0% 134 AGID 1985～1986 108 5)　（　　）は調査年が不明のため，報告年を記載したことを表す。

表1　諸外国における抗BLV抗体陽性率

1)　農場数 2)　バルク数

3)　エライサ（enzyme-Linked immuno sorbent assay） 4) ゲル内沈降反応（agar gel immunodiffusion）

0 500,000 1,000,000 1,500,000 2,000,000 2,500,000 3,000,000 3,500,000 0 500 1000 1500 2000 2500 1998 1999 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007 2008 2009 2010 2011 2012 2013 乳用牛飼養頭数 肉用牛飼養頭数 届出数

年

飼

養

頭

数

牛

白

血

病

届

出

数

図4 我が国における牛白血病届出数と牛の飼養頭数の推移（1998年～2013年）

総務省統計局畜産統計調査（http://www.e-stat.go.jp/SG1/estat/List.do?lid=00000111508）および農林水産省消費安全局監視伝染 病発生状況の累年比較http://www.maff.go.jp/j/syouan/douei/kansi_densen/pdf/h25_ruinenn_todokede.pdf）をもとに作成 13

14

第 一 章 東 京 都 の と 畜 牛 に お け る 地 方 病 性 牛 白 血 病

発 生 状 況 と 牛 白 血 病 ウ イ ル ス 浸 潤 状 況

序 論

牛 白 血 病 の 多 く は ， 牛 白 血 病 ウ イ ル ス （b o v i n e l e u k e m i a v i r u s , B L V ） の 感 染 に よ る 地 方 病 性 牛 白 血 病 （e n z o o t i c b o v i n e l e u k o s i s , E B L ） で あ る 。 牛 白 血 病 は 1 9 9 8 年 に 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に お け る 届 出 伝 染 病 に 指 定 さ れ た が ， そ の 年 の 届 出 数 は 約 1 0 0 頭 で あ っ た も の が 漸 増 を 続 け ， 2 0 1 3 年 に は 2 , 3 1 0 頭 と な っ た( 7 1 ) 。 我 が 国 に お い て は ， と 畜 場 法 に 基 づ き ， 食 用 に な る 家 畜 を と 畜 す る 際 に は ，一 頭 毎 に と 畜 検 査 を 経 な け れ ば な ら な い が ，と 畜 検 査 で は ， 家 畜 伝 染 病 予 防 法 に 規 定 す る 家 畜 伝 染 病 お よ び 届 出 伝 染 病 も 検 査 対 象 疾 病 と な っ て お り ， 牛 白 血 病 は ， と 畜 禁 止 あ る い は 全 部 廃 棄 処 分 と な る 重 要 な 疾 病 で あ る 。 近 年 ， 全 国 の 食 肉 衛 生 検 査 所 か ら 報 告 さ れ る 牛 白 血 病 症 例 も 増 加 し て い る ( 4 3 ， 5 1 ， 9 2 ) 。 富 田 ( 1 0 2 ) は 、 牛 白 血 病 発 症 牛 の う ち ， 生 前 に 外 貌 異 常 を 呈 し て い た も の は 2 2 % ，異 型 リ ン パ 球 の 出 現 が 認 め ら れ た も の は 5 7 % で あ っ た こ と を 報 告 し ， 臨 床 検 査 で 異 常 を 示 さ な か っ た た め 生 前 診 断 が 困 難 で あ っ た 例 が と 畜 検 査 段 階 で 見 つ か る と 推 察 し て い る 。 牛 白 血 病 が 国 内 に お い て 増 加 し 続 け る 中 ， と 畜 検 査 に お け る 牛 白 血 病 診 断 の 重 要 性 は ま す ま す 高 ま る と 思 わ れ る が ，と 畜 牛 に お け る E B L の 発 生 率 の 推 移 や ，発 症 牛 の 品 種 や 年 齢 な ど の 詳 細 に 関 す る 全 国 的 な デ ー タ は な い た め ( 4 8 ) ， と 畜 検 査 に お け る E B L の 迅 速 な 診 断 や E B L 牛 の 排 除 に 支 障 を き た し て い る の が 現 状 で あ る 。そ こ で 本 研 究 で は ， 肥 育 牛 の 検 査 頭 数 が 国 内 最 大 規 模 で あ る 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所

15 に お け る 1 9 9 7 年 度 か ら 2 0 1 2 年 度 ま で の 1 6 年 間 の 牛 白 血 病 発 生 状 況 に つ い て 回 顧 的 調 査 を 実 施 し た 。ま た ，と 畜 検 査 の 過 程 で 発 見 さ れ た E B L 牛 に つ い て の 病 理 学 的 検 査 ， 白 血 球 数 算 定 ，B L V 遺 伝 子 検 査 お よ び 抗 B L V 抗 体 検 査 の 結 果 に つ い て 考 察 し た 。さ ら に ，と 畜 場 搬 入 牛 に お け る B L V 浸 潤 状 況 を 知 る た め ，搬 入 さ れ た 肥 育 牛 を 対 象 と し て 抗 B L V 抗 体 保 有 状 況 調 査 を 行 い ，年 度 お よ び 品 種 間 で の 差 異 を 比 較 し た 。

材 料 お よ び 方 法

１ E B L 発 生 状 況 1 9 9 7 ～ 2 0 1 2 年 度 （ 1 9 9 7 年 4 月 ～ 2 0 1 3 年 3 月 ） の 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 に お け る 牛 の 検 査 頭 数 ， 全 部 廃 棄 数 ，E B L に よ る 全 部 廃 棄 数 か ら ， E B L の 発 生 率 ， 全 部 廃 棄 頭 数 に 占 め る E B L に よ る 全 部 廃 棄 数 の 割 合 を 算 出 し た 。 ２ E B L 牛 2 0 0 5 ～ 2 0 1 2 年 度 に ， 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 に て と 畜 検 査 さ れ た 牛 7 4 3 , 9 7 4 頭 の う ち ，E B L と 診 断 さ れ て 全 部 廃 棄 と な っ た 1 6 3 頭 を 供 試 材 料 と し た 。 血 液 は 枝 肉 の 腕 頭 静 脈 よ り e t h y l e n e - d i a m i n e - t e t r a - a c e t i c a c i d ( E D T A ) ま た は ヘ パ リ ン を 含 む 採 血 管 に 採 取 し ， こ の う ち 約 5 m l を 3 , 0 0 0 回 転 1 5 分 遠 心 後 ， 分 離 し た 血 清 を 抗 体 検 査 に 用 い た 。 リ ン パ 節 は 浅 頸 リ ン パ 節 ， 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 ， 膝 窩 リ ン パ 節 な ど の 体 幹 リ ン パ 節 ま た は 空 腸 リ ン パ 節 ， 縦 隔 リ ン パ 節 な ど の 臓 器 附 属 リ ン パ 節 を 採 材 し た 。 検 体 は 採 材 直 後 ま た は 凍 結 保 存 （ 血 液 お よ び 血 清 は －2 7 ℃ ， リ ン パ 節 は － 8 0 ℃ ） し た 後 ， 試 験 に

16 供 し た 。 ３ 病 理 学 的 検 査 血 液 塗 抹 標 本 お よ び 病 変 部 の ス タ ン プ 標 本 を 作 製 し た 後 ， デ ィ フ ・ ク イ ッ ク 染 色 を 行 い 観 察 に 供 し た 。 ま た ，1 0 % 中 性 緩 衝 ホ ル マ リ ン 固 定 パ ラ フ ィ ン 切 片 を 作 製 し た 後 ， ヘ マ ト キ シ リ ン ・ エ オ ジ ン （H E ） 染 色 を 行 い 観 察 に 供 し た 。 ４ 白 血 球 数 算 定 お よ び リ ン パ 球 比 率 の 測 定 E B L 牛 1 6 3 頭 の う ち ， 9 6 頭 に つ い て 実 施 し た 。 白 血 球 数 は 血 球 算 定 板 あ る い は 自 動 血 球 算 定 装 置 「p o c H - 1 0 0 i V 」 （ シ ス メ ッ ク ス ㈱ ， 兵 庫 ) に よ り 算 定 し た 。血 液 塗 抹 標 本 に お い て 白 血 球 の 分 類 を 行 い ，リ ン パ 球 比 率 を 求 め た 。 ５ 血 液 お よ び リ ン パ 節 か ら の D N A 抽 出 血 液 は 5 0 μ l を ， リ ン パ 節 は 2 5 m g を 秤 量 し ， D N A 抽 出 キ ッ ト 「 D N e a s y B l o o d & T i s s u e K i t 」（ ㈱ キ ア ゲ ン ，東 京) あ る い は 自 動 核 酸 抽 出 器「 P N E - 2 0 8 0 」 （ ㈱ マ ル コ ム ， 東 京 ） を 用 い て D N A を 抽 出 し た 。 抽 出 し た D N A は 直 ち に 使 用 す る か ， ま た は 使 用 ま で －2 0 ℃ で 凍 結 保 存 し た 。 抽 出 さ れ た D N A の 濃 度 は 分 光 光 度 計 N D - 1 0 0 0（ N a n o D r o p t e c h n o l o g i e s , W i l m i n g t o n D E , U S A ） に て O D 2 6 0 お よ び O D 2 8 0 を 測 定 し ， D N A 1 0 0 n g を 試 験 に 供 し た 。 ６ リ ア ル タ イ ム P C R 検 査 「C y c l e a v e P C R ウ シ 白 血 病 ウ イ ル ス （ B L V ） 検 出 キ ッ ト 」（ タ カ ラ バ イ オ ㈱ ， 滋 賀 ） を 使 用 し て 反 応 液 を 調 整 し ， リ ア ル タ イ ム P C R 装 置 「 A B I P r i s m

17 7 9 0 0 H T S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m 」 ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A , U S A ) を 用 い て P C R 反 応 を 実 施 し た（ 図 1 - 1 ）。反 応 条 件 は「 C y c l e a v e P C R ウ シ 白 血 病 ウ イ ル ス （B L V ） 検 出 キ ッ ト 」 の 仕 様 書 に 準 じ た 。 得 ら れ た 結 果 は S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m ソ フ ト ウ ェ ア ー ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y , C A , U S A ) を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。 ７ 抗 体 検 査 牛 白 血 病 診 断 キ ッ ト( 牛 白 血 病 ア ッ セ イ キ ッ ト「 日 生 研 」，日 生 研 ㈱ ，東 京 ） を 用 い て 受 身 赤 血 球 凝 集 反 応( P H A ）を 行 っ た 。同 キ ッ ト の 仕 様 書 に 従 い ，階 段 希 釈 し た 血 清 を 用 い て 定 性 試 験 を 行 い 1 6 倍 以 上 と な っ た も の に つ い て 定 量 試 験 お よ び 阻 止 試 験 を 実 施 し た 。 定 量 試 験 の 凝 集 終 末 価 が 1 6 倍 以 上 で か つ 阻 止 試 験 の 凝 集 終 末 価 が 定 量 試 験 の そ れ よ り 低 い と き に 陽 性 と 判 定 し 、 定 量 試 験 の 凝 集 終 末 価 を も っ て 抗 体 価 と し た 。 ８ と 畜 牛 の 抗 B L V 抗 体 保 有 調 査 2 0 0 5 ～ 2 0 0 7 年 度 に 搬 入 さ れ た 肥 育 牛 2 9 7 頭 （ 黒 毛 和 種 1 3 2 頭 ， 黒 毛 和 種 と ホ ル ス タ イ ン 種 の 交 雑 種 （ 交 雑 種 ）6 0 頭 ， ホ ル ス タ イ ン 種 9 9 頭 ， ジ ャ ー ジ ー 種 6 頭 ）お よ び 2 0 1 2 年 度 に 搬 入 さ れ た 肥 育 牛 3 0 0 頭（ 黒 毛 和 種 1 9 4 頭 ， 交 雑 種 1 0 6 頭 ） を 対 象 と し 前 述 の 牛 白 血 病 診 断 キ ッ ト を 用 い て P H A を 行 っ た 。( 表 1 - 1 ) 。 抗 B L V 抗 体 陽 性 率 の 有 意 差 検 定 は カ イ 二 乗 検 定 （ エ ク セ ル 統 計 2 0 1 0 ） に よ り 行 い p< 0 . 0 5 の と き 有 意 差 あ り と し た 。

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結 果

１ E B L 発 生 状 況 1 9 9 7 ～ 2 0 0 4 年 度 は 牛 白 血 病 の 型 別 を 行 っ て い な か っ た た め ， E B L 単 独 で の 発 生 率 は 不 明 で あ る が ， こ の 間 の 牛 白 血 病 の 発 生 数 は 年 間 0 ～ 4 頭 の 範 囲 で 推 移 し ，大 き な 変 動 は な く ，8 年 間 の 牛 白 血 病 発 生 率 の 平 均 は 0 . 0 0 2 % で あ っ た( 表 1 - 2 ) 。 し か し ， 2 0 0 5 年 度 に は E B L 発 生 数 は 1 1 頭 と 増 加 し ， 2 0 1 2 年 度 に は 3 0 頭 と な り ，同 年 の E B L の 発 生 率 は 0 . 0 3 % と 著 し く 増 加 し た 。2 0 0 5 ～2 0 1 2 年 度 に 発 見 さ れ た E B L は 1 6 3 例 で あ っ た が ， こ れ ら E B L 牛 の 月 齢 は 1 8 ～ 3 8 ヶ 月 齢 に 分 布 し ，中 央 値 は 3 0 ヶ 月 齢 で あ っ た 。ま た ，品 種 別 で は ， 黒 毛 和 種 1 2 7 例 ， 交 雑 種 3 5 例 ， ホ ル ス タ イ ン 種 1 例 で あ っ た 。 E B L の 発 生 率 に す る と ， 和 種 0 . 0 2 3 8 % ， 交 雑 種 0 . 0 1 7 3 % ， ホ ル ス タ イ ン 種 0 . 0 1 3 8 % と な り ， 和 種 が 最 も 高 か っ た 。 ２ E B L 牛 の 病 理 学 的 ・ 臨 床 病 理 学 的 所 見 生 体 検 査 に お い て ， 何 ら か の 異 常 所 見 が 認 め ら れ た も の は 1 6 3 例 中 2 4 例 ( 1 4 . 7 % ) で あ っ た（ 表 1 - 3 ）。最 も 多 か っ た 所 見 は 体 表 の 腫 脹 ・ 腫 瘤 で あ り 1 0 例 で 認 め ら れ た 。 ま た ， 起 立 不 能 が 7 例 ， 眼 球 突 出 が 6 例 ， 削 痩 お よ び 呼 吸 速 拍 が そ れ ぞ れ 3 例 で あ っ た 。 解 体 後 に は リ ン パ 節 の 腫 大 が 全 例 で 認 め ら れ た が ， そ の 大 き さ は 様 々 で あ り ， 正 常 よ り や や 大 き い 程 度 か ら 人 頭 大 ま で 認 め ら れ た （ 図 1 - 2 - 1 お よ び 図 1 - 2 - 2 ） 。 8 2 例 に つ い て 最 大 の リ ン パ 節 を 検 索 し た と こ ろ ， 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 が 4 2 例 （ 5 1 . 2 % ） と 半 数 以 上 を 占 め ， 次 い で 浅 頚 リ ン パ 節 が 1 6 例（ 1 9 . 5 % ），空 腸 リ ン パ 節 が 1 0 例（ 1 2 . 2 % ）で あ っ た 。 病 理 組 織 検 査 に お い て は ， 複 数 の 核 小 体 を 持 ち ， 核 形 が 不 整 の 中 型 か ら 大 型

19 の リ ン パ 球 の び ま ん 性 増 殖 が 確 認 さ れ た（ 図 1 - 3 - 1 お よ び 1 - 3 - 2 ）。白 血 球 数 を 算 定 し た 9 6 例 の 白 血 球 数 は 2 , 0 0 0 ～ 4 5 1 , 6 0 0 個 / μ l に 分 布 し ， 中 央 値 は 1 5 , 0 5 0 個 / μ l で あ っ た 。 E C の 鍵 の 正 常 値 を 下 回 っ た も の は 1 8 頭 ( 1 8 . 8 ％ ) で あ っ た( 表 1 - 4 ) 。 ま た ， こ れ ら の リ ン パ 球 比 率 は 約 半 数 の 4 9 頭 で 9 0 % 以 上 で あ っ た が ，白 血 球 数 が 多 く な る に 従 っ て リ ン パ 球 比 率 が 高 ま る 傾 向 に あ っ た 。 ３ E B L 牛 の B L V 遺 伝 子 保 有 状 況 1 例 を 除 き ， E B L と 診 断 さ れ た 牛 の 血 液 か ら B L V 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た 。 血 液 で 不 検 出 で あ っ た 例 を 含 め ，全 て の リ ン パ 節 検 体 か ら B L V 遺 伝 子 が 検 出 さ れ た 。 ４ E B L 牛 の 抗 B L V 抗 体 保 有 状 況 抗 B L V 抗 体 は 3 例 で は 検 出 さ れ な か っ た （ 1 例 は 未 実 施 ） 。 P H A 抗 体 価 は 1 6 倍 か ら 2 , 0 4 8 倍 以 上 の 広 い 範 囲 に 分 布 し 中 央 値 は 5 1 2 倍 で あ っ た 。 ５ と 畜 牛 の 抗 B L V 体 抗 保 有 状 況 2 0 0 5 ～ 2 0 0 7 年 度 の 抗 B L V 抗 体 陽 性 率 は 肥 育 用 肉 用 種 で 1 9 . 8 % ， 肥 育 用 乳 用 種 で は 2 3 . 8 % で ， 有 意 差 は 認 め ら れ な い も の の 乳 用 種 の 方 が 抗 体 陽 性 率 は 高 か っ た 。P H A 抗 体 価 の 中 央 値 は 肉 用 種 お よ び 乳 用 種 い ず れ も 1 2 8 倍 で あ っ た 。 肉 用 種 の う ち ， 黒 毛 和 種 の 陽 性 率 は 1 4 . 4 % ， 交 雑 種 の そ れ は 3 1 . 7 % と な り 交 雑 種 の ほ う が 有 意 に 高 か っ た( 図 1 - 4 ) 。 2 0 1 2 年 度 に 肥 育 用 肉 用 種 の み の 調 査 を 行 っ た と こ ろ ，陽 性 率 は 1 2 . 7 % で あ り ，P H A 抗 体 価 中 央 値 は 2 5 8 倍 で あ っ た 。 こ の う ち 黒 毛 和 種 の 陽 性 率 は 5 . 7 % ， 交 雑 種 で は 2 5 . 5 % と な り ， 1 回 目 の 調 査 と 同 様 に 交 雑 種 に お い て 有 意 に 高 か っ た 。2 0 1 2 年 度 と 2 0 0 5 ～ 2 0 0 7

20 年 度 の 黒 毛 和 種 と 交 雑 種 の 抗 体 陽 性 率 を 比 較 す る と ，い ず れ も 低 下 し て お り ， 特 に 黒 毛 和 種 に お い て は 2 分 の 1 以 下 と 顕 著 な 低 下 が 認 め ら れ た 。

考 察

国 内 で は 年 間 約 1 2 0 万 頭 の 牛 が と 畜 さ れ て い る が ( 1 8 ) ， 食 肉 衛 生 検 査 に よ り 見 つ か る 牛 白 血 病 数 の 推 移 や ，E B L 牛 の 品 種 や 年 齢 な ど の 詳 細 に 関 す る 全 国 的 な 統 計 資 料 は な い た め( 4 8 ) ， と 畜 場 で の 発 生 状 況 に つ い て は 不 明 な 点 が 多 い 。 今 回 調 査 を 行 っ た 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 管 轄 の と 畜 場 は 国 内 最 大 規 模 で あ り ， 年 間 約 9 万 頭 前 後 の 牛 が 搬 入 さ れ て い る 。 搬 入 牛 の ほ と ん ど が 3 0 ヶ 月 齢 前 後 の 肥 育 牛 で あ り ，約 7 割 を 黒 毛 和 種 が 占 め ，そ れ ら は ほ ぼ 全 国 か ら 出 荷 さ れ て い る 。従 っ て ，東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 に お け る E B L 発 生 状 況 を 調 査 す る こ と は ，国 内 肥 育 牛 に お け る E B L 発 生 動 向 を 明 ら か に す る こ と に 寄 与 で き る と 考 え ら れ る こ と か ら ， 本 研 究 で は 過 去 1 6 年 間 の 牛 白 血 病 発 生 状 況 に つ い て 回 顧 的 調 査 を 実 施 し た 。 そ の 結 果 ，E B L 検 出 率 は 2 0 0 5 年 度 か ら 増 加 傾 向 に 転 じ ，2 0 1 2 年 度 に は 0 . 0 3 1 8 % と 1 9 9 7 ～ 2 0 0 4 年 度 の 平 均 牛 白 血 病 発 生 率 の 約 1 4 倍 と な っ て い た が ， 今 回 の 調 査 の 中 で 増 加 の 原 因 を 明 ら か に す る こ と は で き な か っ た 。 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 で は 高 齢 牛 の 搬 入 は な い こ と か ら ， 他 の 検 査 所 に 比 較 し て 遭 遇 す る E B L 症 例 も 少 な い と 考 え ら れ る が ( 4 3 ，5 1 ，9 2 ) ，そ の よ う な 条 件 下 に お い て 近 年 E B L と し て 摘 発 さ れ る 牛 は 増 加 し 続 け て い る 。E B L の 好 発 年 齢 は 4 ～ 5 歳 ( 1 1 ，2 7 ) あ る い は 5 ～ 8 歳 ( 8 1 ) と い わ れ て い る が ，近 年 ， 3 歳 未 満 で の 発 症 例 も 報 告 さ れ て い る ( 9 8 ， 9 9 ， 1 0 0 ， 1 0 2 ) 。 本 研 究 で み ら れ

21 た 発 症 牛 の う ち 最 も 若 齢 の も の は 1 8 ヶ 月 齢 で あ っ た 。 B L V 感 染 か ら 発 症 ま で は 3 ～ 4 年 あ る い は そ れ 以 上 か か る と さ れ る ( 4 4 ) 。 胎 児 期 を 含 め て 早 い 時 期 に 感 染 し た 個 体 で は 発 病 に 至 る 期 間 が 短 い と さ れ （6 8 ） ， 本 研 究 対 象 と し た 2 ～ 3 歳 の E B L 発 症 個 体 は ， 胎 子 あ る い は 幼 齢 期 に B L V に 感 染 し た 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 牛 白 血 病 は 冒 さ れ た 臓 器 組 織 の 部 位 に よ り 症 状 が 異 な る た め ， 慎 重 な 鑑 別 診 断 が 求 め ら れ る 。 臨 床 に お い て は ， 体 表 の リ ン パ 節 腫 脹 が 認 め ら れ な い な ど ， 当 初 E B L が 疑 わ れ な い 例 も 報 告 さ れ て い る ( 9 9 ， 1 0 0 ) 。 富 田 ( 1 0 2 ) は ， 牛 白 血 病 発 症 牛 の う ち ，外 貌 異 常 は 2 2 % に し か 認 め ら れ ず ，そ の よ う な 牛 で は ， 生 前 診 断 が 困 難 で あ る た め 食 肉 衛 生 検 査 段 階 で 初 め て 見 つ か る と 推 察 し て い る 。 本 研 究 に お い て も ，E B L 牛 の う ち ， 生 体 検 査 時 に 異 常 所 見 が 得 ら れ た も の は 約 1 5 % と わ ず か で あ り ， し か も い ず れ も 起 立 不 能 な ど 非 特 異 的 な 所 見 で あ っ た 。こ れ ら の 結 果 か ら ，外 貌 か ら E B L と 診 断 す る こ と は 難 し い と 考 え ら れ る 。 B u r t o n ら ( 1 2 ) は ， 牛 白 血 病 牛 の 1 0 . 4 % に の み 末 梢 血 の 白 血 化 が 認 め ら れ ， ま た ，い わ ゆ る B e n d i x e n の 鍵 ( 7 , 3 0 ) に よ る リ ン パ 球 増 多 は 2 5 % に し か 認 め ら れ な か っ た と 報 告 し て い る 。 ま た ， 血 液 中 へ の 異 型 リ ン パ 球 の 出 現 は 5 7 % と の 報 告( 1 0 2 ) も あ る 。こ の よ う に ，腫 瘍 性 病 変 と リ ン パ 球 の 増 数 や 異 型 リ ン パ 球 の 出 現 と い っ た 血 液 変 化 は 一 致 し な い と さ れ る が ， 本 研 究 に お い て も ， E B L を 発 症 し て い て も 白 血 球 数 は 正 常 値 を 示 す 例 も 1 8 . 8 % で み ら れ た 。抗 体 検 査 に お い て 抗 体 価 は 広 い 範 囲 に 分 布 し ，3 例 で は 陰 性 で あ っ た 。 よ っ て ， 血 液 検 査 や 抗 体 検 査 は ，B L V 感 染 牛 の 発 見 に は 有 用 な 検 査 法 で あ る が ， E B L 診 断 を す る 上 で の 有 用 性 は 高 い と は 言 い 難 い 。E B L は 腫 瘍 性 病 変 で あ る こ と か ら ，と 畜 検 査 に お い て 病 理 検 査 は 主 た る 検 査 法 と な っ て い る が( 1 1 6 ) ，診 断

22 に 苦 慮 す る 症 例 も あ り 補 助 的 な 検 査 方 法 が 必 要 と さ れ て い る 。 本 研 究 で は リ ア ル タ イ ム P C R 法 に よ り B L V 遺 伝 子 は 全 例 で 認 め ら れ た 。血 液 中 か ら B L V 遺 伝 子 が 検 出 さ れ な か っ た 例 が 1 例 あ っ た が ， こ れ は 血 液 中 に B L V 感 染 リ ン パ 球 が 少 な か っ た た め と 考 え ら れ る 。し た が っ て 本 検 査 法 は E B L 診 断 の 有 効 な 手 段 と な る こ と が 示 唆 さ れ た 。 リ ン パ 節 中 に は 血 液 中 に 比 べ ， よ り 多 く の リ ン パ 球 が 存 在 す る こ と か ら ，E B L 診 断 の た め の 検 体 は リ ン パ 節 が 適 切 で あ る と 考 え ら れ た 。 M u r a k a m i ら ( 7 0 ) に よ り 2 0 1 0 ～ 2 0 1 1 年 に 行 わ れ た 全 国 抗 体 調 査 に よ れ ば ， 2 歳 未 満 の 繁 殖 用 肉 牛 の 抗 B L V 抗 体 陽 性 率 は 1 5 . 2 % で あ っ た 。調 査 方 法 ，対 象 お よ び 規 模 に 違 い は あ る も の の ， 今 回 行 っ た 調 査 に お い て 肉 用 肥 育 牛 の 抗 体 陽 性 率 は 2 0 1 2 年 度 で 1 2 . 7 % と な り ， 全 国 調 査 の 成 績 に 近 い 値 を 示 し た 。 ま た ，2 歳 未 満 の 乳 用 種 の 陽 性 率 は ，2 0 0 7 年 で 1 9 . 3 % ，2 0 1 0 ～ 2 0 1 1 年 で 2 4 . 1 % と の 報 告( 6 9 ， 7 0 ) も あ り ， 今 回 の 調 査 に お け る 2 0 0 5 ～ 2 0 0 7 年 度 の 乳 用 種 の 抗 体 陽 性 率 の 2 3 . 8 % は こ れ に 近 い 値 で あ っ た 。 こ れ ら の こ と か ら ， 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 に お け る 調 査 結 果 は B L V 感 染 率 に 関 し て 全 国 調 査 と 同 様 の 傾 向 が あ る こ と が 明 ら か に な り ，と 畜 場 搬 入 牛 の 定 期 的 な 抗 体 調 査 は 国 内 の B L V 感 染 状 況 の 把 握 に 寄 与 で き る 可 能 性 が 示 さ れ た 。 国 内 に お い て B L V 感 染 率 は 肉 用 種 に 比 較 し て 乳 用 種 が 高 い と 報 告 さ れ て い る( 6 9 ， 7 0 ) 。 本 研 究 で も ， 乳 用 種 の 抗 体 保 有 率 は 肉 用 種 に 対 し 高 く ， 同 じ 肉 用 種 で も 交 雑 種 は 黒 毛 和 種 に 比 較 し て 有 意 に 高 か っ た 。B L V の 感 染 経 路 と し て は 不 衛 生 な 処 置 や 吸 血 昆 虫 を 介 し て の 血 液 に よ る 水 平 感 染 が 挙 げ ら れ る ( 3 5 ) 。 ま た ， 乳 汁 を 介 し た 母 子 感 染 も あ り ， B L V に 対 す る 移 行 抗 体 を 含 ま な い 代 用 乳 や ウ イ ル ス に 汚 染 さ れ た プ ー ル 乳 に よ り 感 染 が 拡 大 す る 可 能 性 が あ る こ と が 指 摘 さ れ て い る( 3 5 ) 。 一 方 ， B L V 感 染 実 験 よ り 初 乳 中 の 移 行 抗 体 が

23 十 分 で あ れ ば 感 染 防 御 が 成 立 す る こ と が 示 さ れ る な ど ( 5 9 ， 1 0 6 ) ， 垂 直 感 染 予 防 に 果 た す 初 乳 の 重 要 性 が 指 摘 さ れ て い る 。K o b a y a s h i ら ( 4 6 ) も ， 牛 群 内 で の B L V 感 染 拡 大 を 防 御 す る 因 子 と し て 母 牛 か ら の 初 乳 給 与 を 挙 げ て い る 。 M u r a k a m i ら ( 6 9 ，7 0 ) は ，乳 用 種 に お い て 肉 用 種 よ り 高 い B L V 感 染 率 を 示 す 原 因 は ，初 乳 お よ び 常 乳 の 給 与 方 法 に あ る 可 能 性 を 指 摘 し て い る 。す な わ ち ， 乳 用 種 は 母 牛 か ら 初 乳 や 乳 を 直 接 摂 取 す る こ と は ま れ で あ り ， プ ー ル 乳 な ど を 給 与 さ れ る 機 会 が 多 い こ と が 感 染 を 拡 大 さ せ て い る こ と を 示 唆 し て い る 。 黒 毛 和 種 で は 初 乳 を 含 め ， 母 牛 か ら 母 乳 を 直 接 摂 取 す る こ と が 多 い 。 一 方 ， 交 雑 種 は ， 母 牛 に ホ ル ス タ イ ン 種 を 用 い て 産 出 さ れ る た め ， プ ー ル 乳 を 与 え ら れ る 機 会 が 黒 毛 和 種 に 比 較 し て 多 い 。 黒 毛 和 種 と 交 雑 種 で は 育 成 期 お よ び 肥 育 期 に お け る 飼 養 状 況 に 顕 著 な 違 い は な い こ と か ら ， 本 研 究 で 認 め ら れ た 黒 毛 和 種 と 交 雑 種 間 の B L V 感 染 率 の 違 い は ，母 牛 の 品 種 の 違 い お よ び 哺 乳 期 に お け る 初 乳 や 乳 の 給 与 方 法 の 差 異 に 起 因 す る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 E B L の 発 症 に 対 し て 感 受 性 ・ 抵 抗 性 を 規 定 す る 牛 主 要 組 織 適 合 性 抗 原 （B o L A ） の 対 立 遺 伝 子 が 同 定 さ れ る な ど ， E B L 発 症 に は 宿 主 側 要 因 が 重 要 で あ る こ と が 示 唆 さ れ て い る( 3 ) 。ま た ，黒 毛 和 種 と ホ ル ス タ イ ン 種 で は B o L A の ハ プ ロ タ イ プ の 分 布 が 異 な っ て い る こ と が 示 さ れ て い る( 6 2 ) 。 今 回 の 調 査 に よ り B L V 感 染 率 は 黒 毛 和 種 で は 交 雑 種 に 比 較 し て 有 意 に 低 か っ た が ，E B L の 品 種 ご と の 発 生 率 は 和 種 0 . 0 2 3 8 % ， 交 雑 種 0 . 0 1 7 3 % ， ホ ル ス タ イ ン 種 0 . 0 1 3 8 % と な っ た 。 す な わ ち ， 和 種 が 最 も 高 い 結 果 と な り ， 品 種 あ る い は 血 統 に よ る 感 染 率 や 発 症 率 の 差 異 が 解 明 さ れ る こ と が 待 た れ る 。 以 上 ，と 畜 場 に 搬 入 さ れ た 肥 育 牛 に つ い て 回 顧 的 調 査 を 試 み ，2 0 0 5 年 度 よ り E B L が 増 加 し て い る こ と を 示 し た 。ま た ，従 来 報 告 さ れ て い る よ り も 若 齢 で E B L が 認 め ら れ る こ と ，発 症 牛 の 中 に は 外 貌 上 健 康 で あ る も の や 血 液 に 異

24 常 所 見 を 示 さ な い も の も あ る な ど 非 典 型 的 な 症 例 も あ る こ と を 明 ら か に し た 。 さ ら に ，と 畜 場 搬 入 肥 育 牛 で の B L V 浸 潤 状 況 を 調 査 し ，和 種 に 比 較 し 交 雑 種 に お い て 抗 体 陽 性 率 が 高 い こ と を 示 し た 。 こ れ ら 実 態 の 解 明 は ， と 畜 検 査 に お け る E B L 発 症 牛 の 適 切 な 排 除 の た め に ，非 常 に 有 用 か つ 重 要 な 知 見 を 与 え て く れ る も の と 考 え る 。 従 来 ，飼 養 期 間 が 2 年 半 か ら 3 年 程 度 の 肥 育 牛 に つ い て は ，B L V 感 染 が あ ま り 問 題 に さ れ て こ な か っ た が ， 今 後 は 肥 育 牛 に つ い て も ，E B L 発 症 例 の 詳 細 の 把 握 ， 有 効 な 予 防 プ ロ グ ラ ム 確 立 ， ま た ， と 畜 検 査 で 応 用 可 能 な 診 断 法 の 開 発 が 必 要 と 考 え る 。

25

①

反応液量（1 反応あたり）

2 × CycleavePCR Reaction Mix SP1

12.5 μl

Probe/Primer Mix for BLV（5 ×）

5 μl

検体サンプル

(DNA100ng に調整)

5 μl

ROX Reference Dye II

0.5 μl

RNase Free dH2O

2 μl

Total

25 μl

② 反応条件

Stage 1： 初期変性（Hold）

Reps：1, 95℃ 10 秒

↓

Stage 2： 2step PCR

Reps：40, 95℃ 5 秒 → 64℃ 30 秒

Reporter は FAM，Quencher は None，Passive Reference は ROX で設定した。

図

1-1 Cycleave®PCR Reaction Mix SP

乳用種

黒毛和種

交雑種

(ホルスタイン種および

ジャージー種)

29ヶ月齢

1)

27ヶ月齢

23ヶ月齢

(26-40)

(23-32)

(16-35)

2005～2007

297

132

60

105

2012

300

194

106

0

合計

597

326

166

105

1)　月齢の中央値，(　　）はその範囲

表1-1　抗BLV抗体保有調査対象としたと畜牛の内訳

年度

検査数

肉用種

26

発生率(%)

3)

1997

88,212

29

3

(10.3)

0.0034

NT

5)

NT

1998

87,637

25

1

( 4.0)

0.0011

NT

NT

1999

86,472

19

0

( 0 )

0

0

0

2000

85,403

26

2

( 7.7)

0.0023

NT

NT

2001

73,011

15

1

( 6.7)

0.0014

NT

NT

2002

78,959

14

1

( 7.1)

0.0013

NT

NT

2003

84,688

35

4

(11.4)

0.0047

NT

NT

2004

83,215

53

3

( 5.7)

0.0036

NT

NT

2005

94,383

55

11

(20.0)

0.0117

11

1 (胸腺型）

2006

94,078

41

19

(46.3)

0.0202

19

1 (胸腺型）

2007

93,965

43

22

(51.2)

0.0234

22

0

2008

92,564

44

20

(45.5)

0.0216

20

1 (胸腺型）

2009

90,741

34

14

(41.2)

0.0154

14

0

2010

94,758

40

23

(57.5)

0.0243

23

1 (胸腺型）

2011

89,162

47

24

(51.1)

0.0269

24

0

2012

94,323

44

30

(68.2)

0.0318

30

1 (胸腺型）

合計

1,411,571

564

178

(31.6)

0.0126

163

1)　1997～2004年度の全部廃棄数は牛白血病全数 2)　全部廃棄数に占めるEBLによる全部廃棄の割合（1997～2004年度は牛白血病による全部廃棄の割合） 3)　検査数に対するEBLによる全部廃棄の割合（1997～2004年度は牛白血病による全部廃棄の割合） 4)　リアルタイムPCR検査によりリンパ節から検出された頭数 5)　NTは未検査

表1-2　地方病性牛白血病(EBL)の発生状況(1997～2012年度）

散発性牛白

血病発生頭

数

BLV遺

伝子検

出頭数

4)

全部廃棄数

1)

(%)

2)

年度

検査数

全部廃棄数

EBL

27

有

24 (14.7)

(内訳)

体表の腫脹・腫瘤

10 (6.1)

起立不能

7 (4.3)

眼球突出

6 (3.7)

削痩

3 (1.8)

呼吸速拍

3 (1.8)

発熱

2)

1 (0.6)

姿勢異常

1 (0.6)

元気消失

1 (0.6)

眼瞼部外傷

1 (0.6)

切歯の脱落

1 (0.6)

無

139 (85.3)

1) 複数の所見を持つ例もあるため内訳の合計は163頭より多い。 2) 40.0℃以上

表1-3　EBL牛163頭に見られた生体所見

頭数(%)

1)

異常所見

28

29

図

1-2-1 EBL 牛 の リ ン パ 節

（ 雌 黒 毛 和 種

25 ヶ 月 齢 空 腸 リ ン パ 節 ）

図

1-2-2 EBL 牛 の リ ン パ 節

（ 去 勢 黒 毛 和 種

31 ヶ 月 齢 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 ）

図

2-2-1 EBL 牛 の リ ン パ 節

（ 雌 黒 毛 和 種

25 ヶ 月 齢 空 腸 リ ン パ 節 ）

30

図

1-3-1

EBL 牛 の 末 梢 血

( ﾃ ﾞ ｨ ﾌ ｸ ｲ ｯ ｸ 染 色 ）

図

1-3-2

E B L 牛 の 末 梢 血 中 に 見 ら れ た 異 型 リ ン パ 球

50未満 50～60 60～70 70～80 80～90 90以上 未測定

正常

18( 18.8)

1

2

3

4

4

4

0

偽陽性

11( 11.5)

0

0

0

5

1

5

0

陽性

67( 69.8)

1

2

0

8

15

40

1

合計

96(100)

2

4

3

17

20

49

1

2)白血球数に占めるリンパ球比率(％)

表1-4　EBL牛の白血球数とリンパ球比率

分類

1)

頭数(％)

リンパ球比率

2)

1)ECの鍵による分類に従った。1歳以上2歳未満で正常値は<9,000，擬陽性は10,000～

12,000，陽性は12,000<,2歳以上3歳未満で正常値は<7,500，擬陽性は7,500～9,500，

陽性は9,500<,3歳以上4歳未満で正常値は<6,500，擬陽性は6,500～8,500，陽性は

8,500<である（単位個/μl）。

31

14.4

31.7

23.8

5.7

25.5

0

0

0

0

0

0

0

0

黒毛和種

交雑種

乳用種

保

有

率

₍

%

)

2005-07年度 2012年度

*

*

*

30

20

10

0

図1-4 と畜牛の抗BLV抗体保有率 （*p<0.05)

32

33

第 二 章 地 方 病 性 牛 白 血 病 発 症 牛 と 牛 白 血 病 ウ イ ル ス 感

染 牛 の リ ン パ 節 中 の 牛 白 血 病 ウ イ ル ス 量 の 比 較

序 論

第 一 章 に お い て ，と 畜 検 査 の 段 階 に お い て 摘 発 さ れ る E B L が 2 0 0 5 年 以 降 増 加 傾 向 に あ る こ と を 明 ら か に し た 。 ま た 外 貌 異 常 を 示 さ な い 例 が 8 5 . 3 ％ ， 白 血 球 数 が 正 常 値 で あ る も の が 1 8 . 8 % 認 め ら れ た こ と や リ ン パ 節 の 腫 脹 の 程 度 に は 差 異 が あ り 診 断 に 苦 慮 す る 症 例 も 多 い こ と を 示 し た 。 出 荷 し た 牛 が 全 部 廃 棄 と な る こ と は ， 生 産 者 に と っ て 大 き な 経 済 的 損 失 と な る た め ， と 畜 検 査 に お い て ， 牛 白 血 病 が 疑 わ れ る 例 で は 慎 重 に 検 査 し な く て は な ら な い 。 ま た ， と 畜 検 査 に お け る 合 否 判 断 は 生 鮮 流 通 が 基 本 と な る 食 肉 生 産 に 直 結 す る た め ， 迅 速 で あ る こ と も 求 め ら れ る 。B LV 感 染 牛 の ス ク リ ー ニ ン グ に は ゲ ル 内 沈 降 反 応( A G I D ) や エ ラ イ ザ 法（ E L I S A ）と い っ た 抗 体 検 査 法 が 用 い ら れ る ( 7 7 ) 。 し か し な が ら ， 抗 体 検 査 で は ， 抗 体 量 が 少 な い 個 体 や 感 染 初 期 の 抗 体 上 昇 以 前 の 個 体 で は 陰 性 と な る 場 合 も あ る( 1 6 , 2 2 ) 。 従 っ て ，B LV 感 染 診 断 に は P C R 法 に よ り 宿 主 細 胞 内 に 蓄 積 さ れ た B LV プ ロ ウ イ ル ス 遺 伝 子 を 検 出 す る こ と が 一 般 的 で あ る( 4 ， 6 4 ， 11 2 ) 。 し か し ， 抗 体 検 査 や P C R 法 で は 感 染 の 有 無 は 判 定 で き て も 発 症 と 未 発 症 を 区 別 す る こ と は で き な い た め ，と 畜 検 査 に お け る E B L 牛 の 診 断 に 応 用 す る こ と は で き な い 。現 在 ， と 畜 検 査 に お い て 本 疾 病 が 疑 わ れ る 場 合 は ， 生 体 所 見 ， 剖 見 所 見 ， 血 液 所 見 お よ び 病 理 組 織 所 見 等 を 総 合 し て 診 断 し ， 検 査 の 合 否 を 判 断 し て い る ( 11 6 ) 。脂 肪 壊 死 症 あ る い は 好 酸 球 性 筋 炎 ，心 嚢 炎 な ど の 炎 症 性 疾 患 と の 類 症 鑑 別 が 必 要 と さ れ る が( 11 6 ) ， 中 に は 診 断 に 苦 慮 す る 症 例 も あ り ， ま た ， 病 理

34 検 査 で は 標 本 作 成 等 に 時 間 が か か る こ と や 技 術 的 習 熟 が 必 要 な こ と か ら ， 病 理 検 査 を 補 助 す る 病 原 学 的 な 検 査 法 の 開 発 が 求 め ら れ て い た 。 近 年 ， 病 原 体 の 微 量 検 出 法 と し て ， 定 量 リ ア ル タ イ ム P C R 法 ( q P C R 法 ) が 用 い ら れ る よ う に な り ， 疾 病 診 断 の 迅 速 化 や 検 査 精 度 の 向 上 が 図 ら れ る よ う に な っ て き た( 1 3 , 1 5 ) 。 C y c l e a v e P C R 法 は ， サ イ ク リ ン グ プ ロ ー ブ 法 を 使 用 し た リ ア ル タ イ ム P C R で あ る が ， R N A と D N A か ら な る キ メ ラ プ ロ ー ブ と R N a s e H の 組 み 合 わ せ に よ る 検 出 法 で ，増 幅 中 や 増 幅 後 の 遺 伝 子 断 片 の 特 定 配 列 を 効 率 良 く 検 出 す る こ と が で き る( 5 , 6 7 ) 。 そ こ で ， 本 章 で は q P C R 法 が 牛 白 血 病 診 断 法 の 一 つ と し て 有 効 で あ る か を 検 証 す る た め ，C y c l e a v e P C R 法 を 用 い た q P C R 法 に よ り E B L 牛 と B LV 感 染 牛 お よ び 健 康 牛 の 血 液 細 胞 お よ び 組 織 に お け る B LV 遺 伝 子 量 を 定 量 比 較 し た 。

材 料 お よ び 方 法

１ 対 象 牛 お よ び 抗 体 検 査 東 京 都 芝 浦 食 肉 衛 生 検 査 所 に お い て 解 体 後 の 肉 眼 所 見 ， 病 理 組 織 所 見 お よ び 血 液 所 見 な ど を 総 合 し E B L と 診 断 さ れ た 牛 ( E B L 牛 ) 1 0 2 頭 か ら 得 ら れ た 血 液 9 0 検 体 ，リ ン パ 節 1 4 4 検 体 ，脾 臓 3 5 検 体 お よ び B LV 感 染 牛 3 7 頭 か ら 得 ら れ た 血 液 3 7 検 体 ， リ ン パ 節 3 9 検 体 （ 空 腸 リ ン パ 節 3 6 検 体 ， 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 3 検 体 ）， 脾 臓 1 2 検 体 を 材 料 と し た （ 表 2 - 1 ）。 E B L 牛 の リ ン パ 節 の 部 位 お よ び 数 の 内 訳 は 浅 頸 リ ン パ 節 3 8 検 体 ， 膝 窩 リ ン パ 節 1 3 検 体 ， 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 4 7 検 体 ， 空 腸 リ ン パ 節 2 5 検 体 ， 縦 隔 リ ン パ 節 1 5 検 体 ， 第 一 肋

35 間 リ ン パ 節 2 検 体 ， 腸 骨 下 リ ン パ 節 3 検 体 お よ び 耳 下 リ ン パ 節 １ 検 体 で あ っ た( 表 2 - 1 ) 。 E B L 牛 は ， と 畜 解 体 後 検 査 に お い て リ ン パ 節 の 腫 脹 ， 脾 腫 肝 腫 あ る い は 臓 器 に お け る 黄 白 色 腫 瘤 形 成 な ど 牛 白 血 病 を 疑 う 所 見 が 認 め ら れ た も の で ， 病 理 検 査 に お い て は 病 変 部 に 中 型 か ら 大 型 で 複 数 の 核 小 体 を 持 つ 異 型 リ ン パ 球 の び ま ん 性 増 殖 が 確 認 さ れ ，牛 白 血 病 診 断 キ ッ ト( 牛 白 血 病 ア ッ セ イ キ ッ ト 「 日 生 研 」， 日 生 研 ㈱ ， 東 京 ） を 用 い た 受 身 赤 血 球 凝 集 反 応 （P H A ） に よ る 抗 体 検 査 に よ り B LV 抗 体 陽 性 で あ っ た も の を 対 象 と し た 。 こ の う ち 6 個 体 は ，リ ン パ 節 の 腫 脹 の 程 度 お よ び 病 理 組 織 所 見 と B LV 遺 伝 子 量 を 比 較 す る 目 的 で 複 数 の リ ン パ 節 を 検 体 と し ， そ の 腫 脹 の 程 度 を － か ら 3 ＋ ま で の ４ 段 階 で 評 価 し た 上 で ， 病 理 組 織 切 片 上 の 腫 瘍 細 胞 浸 潤 の 程 度 と B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 を 比 較 し た 。 B LV 感 染 牛 は P H A に よ る 抗 体 検 査 に よ り B LV 抗 体 陽 性 で あ り ， か つ ， と 畜 検 査 に お い て は リ ン パ 節 の 腫 脹 ， 脾 腫 肝 腫 あ る い は 臓 器 に 黄 白 色 腫 瘤 の 形 成 な ど の 牛 白 血 病 の 症 状 が 認 め ら な か っ た も の を 対 象 と し た 。 ま た ，B LV 抗 体 陰 性 牛 7 6 頭 か ら 得 ら れ た 血 液 7 6 検 体 ， リ ン パ 節 1 2 8 検 体 （ 空 腸 リ ン パ 節 7 6 検 体 ， 内 側 腸 骨 リ ン パ 節 5 2 検 体 ）， 脾 臓 5 2 検 体 を 陰 性 コ ン ト ロ ー ル と し た 。さ ら に ，胸 腺 に 大 型 腫 瘤 が 認 め ら れ ， 病 変 部 の 病 理 組 織 検 査 に お い て は 大 型 の 異 型 リ ン パ 球 の び ま ん 性 増 殖 が 確 認 さ れ 免 疫 組 織 学 的 検 査 に お い て C D 3 陽 性 で あ っ た こ と か ら 胸 腺 型 牛 白 血 病 牛 と 診 断 し た 3 頭 か ら 得 ら れ た 血 液 2 検 体 ， リ ン パ 節 2 検 体 ， 脾 臓 1 検 体 に つ い て も 対 象 と し た が ， こ の う ち 1 検 体 は B LV 抗 体 陽 性 で あ っ た 。 ２ 血 液 ， リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 か ら の D N A 抽 出 血 液 は 5 0 μ l を ， リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 は 2 5 m g を 秤 量 し ， D N A 抽 出 キ ッ ト 「D N e a s y 血 液 & Ti s s u e K i t 」（ ㈱ キ ア ゲ ン ， 東 京 ) あ る い は 自 動 核 酸 抽 出

36 器 「P N E - 2 0 8 0 」（ ㈱ マ ル コ ム ， 東 京 ） を 用 い て D N A を 抽 出 し た 。 抽 出 し た D N A は 直 ち に 使 用 す る か ，ま た は 使 用 ま で － 2 0 ℃ で 凍 結 保 存 し た 。抽 出 さ れ た D N A は 分 光 光 度 計 N D - 1 0 0 0 （ N a n o D r o p t e c h n o l o g i e s , Wi l m i n g t o n D E , U S A ） に て O D 2 6 0 お よ び O D 2 8 0 を 測 定 し ， D N A 1 0 0 n g を 試 験 に 供 し た 。 ３ 定 量 リ ア ル タ イ ム P C R 検 査 「C y c l e a v e P C R ウ シ 白 血 病 ウ イ ル ス （ B LV ） 検 出 キ ッ ト 」（ タ カ ラ バ イ オ ㈱ ， 滋 賀 ） を 使 用 し て 反 応 液 を 調 整 し ， リ ア ル タ イ ム P C R 装 置 「 A B I P r i s m 7 9 0 0 H T S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m 」 ( A p p l i e d B i o s y s t e m s , F o s t e r C i t y, C A , U S A ) を 用 い て P C R 反 応 を 実 施 し た 。 反 応 条 件 は 「 C y c l e a v e P C R ウ シ 白 血 病 ウ イ ル ス （B LV ） 検 出 キ ッ ト 」 の 仕 様 書 に 準 じ た ( 図 1 - 1 ) 。 定 量 の た め の 検 量 線 の 作 成 は 同 キ ッ ト 仕 様 書 に 準 じ ， 付 属 の P o s i t i v e C o n t r o l を 希 釈 し て 作 成 し ，各 検 体 の 抽 出 D N A 1 0 n g あ た り の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 を 算 出 し た 。 得 ら れ た 結 果 は S e q u e n c e D e t e c t i o n S y s t e m ソ フ ト ウ ェ ア ー ( A p p l i e d B i o s y s t e m s ) を 用 い て 解 析 を 行 っ た 。 ４ 統 計 処 理 E B L 牛 お よ び B LV 感 染 牛 の 血 液 ， リ ン パ 節 お よ び 脾 臓 の B LV コ ピ ー 数 の 比 較 お よ び E B L 牛 の 各 リ ン パ 節 間 の B LV コ ピ ー 数 の 比 較 に は ， 統 計 ソ フ ト J M P ( Ve r s i o n 5 . 0 , S A S I n s t i t u t e , To k y o , J a p a n ) を 用 い た Wi l c o x o n / K r u s k a l – Wa l l i s t e s t ( r a n k s u m t e s t ) を 実 施 し ，p< 0 . 0 5 の と き 有 意 差 あ り と し た 。

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結 果

１ E B L 牛 と B LV 感 染 牛 の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 比 較 血 液 お よ び リ ン パ 節 ， 脾 臓 の い ず れ に お い て も ，E B L 牛 の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 は ，B LV 感 染 牛 に 比 較 し 有 意 に 高 か っ た (p< 0 . 0 0 0 1 , 図 2 - 1 ) 。 血 液 中 の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 は 抽 出 D N A 1 0 n g あ た り E B L 牛 で は 2 5 ～ 2 . 3 × 1 04 _{コ ピ ー の 間 に 分 布 し ， 中 央 値 は 1 , 7 0 0 コ ピ ー と な っ た 。 一 方 ， B LV} 感 染 牛 の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 は 0 ～ 2 , 6 0 0 コ ピ ー に 分 布 し ，中 央 値 は 11 0 コ ピ ー で あ っ た 。血 液 で は ，E B L 牛 の 6 5 . 6 % が 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え て い た が ， B LV 感 染 牛 で は 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え た も の は 1 0 . 8 % で あ っ た 。 リ ン パ 節 中 の B LV コ ピ ー 数 を 比 較 す る と ， E B L 牛 で は 3 2 ～ 1 . 7 × 1 04_コ ピ ー の 間 に 分 布 し ， 中 央 値 は 1 , 9 0 0 コ ピ ー で あ っ た の に 対 し ， B LV 感 染 牛 で は 0 ～ 2 . 3 × 1 02 _{コ ピ ー と な り 中 央 値 は 6 . 8 コ ピ ー で あ っ た 。 ま た ， E B L 牛} で は ，7 0 . 1 % が 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え て い た が ， B LV 感 染 牛 で は 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え た も の は な か っ た 。 脾 臓 で は ，E B L 牛 の B LV コ ピ ー 数 は 1 . 1 ～ 1 . 1 × 1 04 _{コ ピ ー 数 に 分 布 し ,} 中 央 値 は 2 , 2 0 0 コ ピ ー と な り ，B LV 感 染 牛 で は 0 ～ 5 , 2 0 0 コ ピ ー に 分 布 し 中 央 値 は 6 1 コ ピ ー と な っ た 。E B L 牛 の 脾 臓 で は 6 5 . 7 % が 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え て い た が ，B LV 感 染 牛 で は 全 て の 検 体 が 1 , 0 0 0 コ ピ ー 未 満 で あ っ た 。 ２ E B L 牛 の 各 リ ン パ 節 間 の B LV 遺 伝 子 コ ピ ー 数 の 比 較 E B L 牛 の 各 リ ン パ 節 間 の コ ピ ー 数 に は 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た が ， 1 , 0 0 0 コ ピ ー を 超 え た も の の 割 合 は 以 下 の 順 で 高 く な っ た ： 浅 頸 リ ン パ 節