2017年度 長崎大学組換えDNA実験講習会
２．組換えDNA実験
申請
に際しての留意点
水上 修作
組換えDNA実験申請に際しての留意点
遺伝子組換え実験を行う際のルールは国の法律です。
審査を経て組換えDNA実験計画が承認されるまで、
遺伝子組換え実験はもちろん、
遺伝子組換え生物試
料の保管
もできません。
申請後も、実験計画の有効期間に注意が必要です。
・
暦月で5年間有効
例：2016年6月承認の場合、2021年5月末まで
本学の組換えDNA実験安全委員会は、各部局から選
出された教員で構成されています。
22017.4.1 現在 委員区分 所属等 職名 氏名 任期 内線 E-Mail 備考 第１号委員 医歯薬学総合研究科 准教授 森 亮一 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7051 ryoichi@ 委員長 薬学部 教授 武田 弘資 H28.4.1 ～ H30.3.31 本2417 takeda-k@ 熱帯医学研究所 助教 水上 修作 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7820 mizukami@ 熱帯医学研究所 講師 菊池 三穂子 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7845 mkikuchi@ 病院 教授 宮崎 泰司 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7109 y-miyaza@ 病院 講師 星野 倫範 H27.8.1 ～ H29.7.31 病7675 thoshino@ 第2号委員 歯学部 准教授 根本 優子 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7643 ynemoto@ 副委員長 環境科学部 教授 長江 真樹 H28.4.1 ～ H30.3.31 本2755 nagae@ 第3号委員 水産学部 准教授 山田 明徳 H28.4.1 ～ H30.3.31 本2847 ayamada@ 第4号委員 教育学部 教授 堀井 健一 H28.4.1 ～ H30.3.31 本2304 horii@ 第5号委員 医学部・原爆後障害医療研究所 教授 吉浦 孝一郎 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7118 kyoshi@ 第6号委員 保健・医療推進センター 准教授 古林 正和 本2213 masakazu-f328@（官職指定） 第7号委員 研究国際部 部長 山﨑 雅彦 本2869 m-yamasaki@ （官職指定） 第8号委員 歯学部 准教授 増山 律子 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7755 ritsuko@ 工学研究科 准教授 郷田 秀一郎 H28.4.1 ～ H30.3.31 本2685 sgoda@ 先導生命科学研究支援センター 教授 大沢 一貴 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7132 kohsawa@ 合計 16人 安全主任者 先導生命科学研究支援センター 准教授 木住野 達也 H28.4.1 ～ H30.3.31 病7191 kishino@ 副安全主任者 環境科学部 教授 宮西 隆幸 H29.4.1 ～ H31.3.31 本2768 miyanish@
長崎大学組換えＤＮＡ実験安全委員会委員名簿
定足数10人の委員
(委員長･安全主任者･副安全主任者を除く15人の2/3以上)
の審査
を持って意見を取り纏め、
委員長（審査）
に進みます。
31. 教職員の皆さまへ
2. 教職員ポータル
4. 長大ID & パスワード
でログイン
3. 組換えDNA実験計
画申請Webシステム
新規、変更、終了、
譲渡、分与、報告書、
マニュアル等、
すべてここにあります。
XXXXXX
xxxxxxxx
クリックして下さい。
XXXXXX
５. 組換えDNA実験講習会の受講記録
実験責任者、実験従事者の受講状況を必ず確認してください。
６. 新規申請
７. DNA実験安全管理規則、
計画書、終了、譲渡、分与、
報告書、マニュアル等、
はここにあります。
XXXXXX別ウインドウで開きます。
8次のページ
８. 組換えDNA実験計画書
WEB申請マニュアル
９. 組換えDNA実験施設設置・変更申請
(Wordファイル)
別ウインドウで開きます。
１０. 譲渡、分与、購入
の計画書、情報提供書
①遺伝子組換え生物の他機関への譲渡及び搬出について 他機関への譲渡及び搬出前に「遺伝子組換え生物等の譲渡 の計画書（様式１）」及び「遺伝子組換え生物等の譲渡・提供・ 委託に際しての情報提供書（様式２）」 を、部局担当係を通し て、研究国際部研究企画課まで提出願います。なお、譲渡及び 搬出は、安全委員会の確認後になります。 ②遺伝子組換え生物の本学への譲受及び搬入について 本学への譲受及び搬入前に「遺伝子組換え生物等の譲受の 計画書（様式３）」及び「譲渡元発行の情報提供書」を、部局担 当係を通して、研究国際部研究企画課まで提出願います。なお、 譲受及び搬入は、安全委員会の確認後になります。 ③遺伝子組換え生物の本学への購入及び搬入について 本学への購入及び搬入前に「遺伝子組換え生物等の購入 の計画書（様式４） 及び購入先発行の情報提供書を、部局担当係を通して、研究 国部研究企画課ま で提出願います。なお、購入及び搬入は、安全委員会の確認 後になります。 （手続きに７日～１０日かかりますので必ず余裕を持って提出し て下さい)12 ・組換えＤＮＡ実験終了（中止）報告書 （Wordファイル） 組換えＤＮＡ実験を終了（中止）した場合は、終了（中止）後、速やかに提出願います。 なお、ＷＥＢ申請審査システムにより申請・承認された組換えＤＮＡ実験については、 ＷＥＢ 申請審査システムの「終了・中止申請」により報告願います。 ・組換えＤＮＡ実験記録簿 (Wordファイル） ・他の大学等の研究機関等における実験報告 (Wordファイル） ・バイオハザード表示 物理的封じ込めレベルがＰ２以上の実験室には表示が必要です｡ ・ＬＡＣＳ受講者用組換えＤＮＡ実験講習ｅ－ラーニング（LACS）利用案内 ・Ｗｅｂ視聴者用組換えＤＮＡ実験理解度テスト問題 （Pdf ファイル） ・組換えＤＮＡ実験講習受講修了届 受講一覧に登録が必要な場合のみ提出願います。 ・組換えＤＮＡ実験講習会動画 文部科学省ホームページ ・「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保に関する法律」関連 「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を 定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件の一部を改正する告示」について （平成26年7月1日施行） 研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等 を定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件（平成１６年文部科学省告示 第７号）の改正の概要 ※平成２８年度長崎大学組換えＤＮＡ実験講習会【５月２６日（木）】 配布資料 ○組換えＤＮＡ実験に関わる法律と組換えＤＮＡ実験を行う際の留意点 ○組換えＤＮＡ実験申請に際しての留意点 組換えＤＮＡ実験講習会ＤＶＤ貸出については所属部局の担当係または研究企画課まで御連絡下さい。
11. 組換えＤＮＡ実験
記録簿
次のページ
(実験の記録) 第32条 実験責任者は，実験に係る安全の確保のため，必要な事項 を組換えDNA実験記録簿(別記様式第3号)に記録しなければならな い。 2 前項の記録は，実験の終了及び中止後，その写しを学長に提出し なければならない。
○長崎大学組換えDNA実験安全管理規則
別ウインドウで開きます。
WEB申請書作成の前に準備すること
１．組換えDNA実験計画書WEB申請マニュアルを読む（必要事項、作業の手順がわかる）。
２．実験従事者の組換えDNA実験講習会の受講記録（３年以内に１回受講）と健康診断
記録（１年以内に受診）のチェック。
３．実験計画書の作成。
(1) 実験の内容のどの部分が組換えDNA実験なのか？
(2) 動物を用いる実験を行うのか？（同時に動物実験の申請も必要）
(3) どこで実験するのか？
４．核酸供与体（生物種）、宿主、ベクターのクラス分類の確認。
14XXXXXX xxxxxxxx
新規申請手順
統合認証システム
アクセス記録表示
組換えDNA実験計画
申請Webシステム
XXXXXXXXXXXXX
③ 可能であれば、所属す
る部局の委員に申請前に
委員に内容のチェックを
お願いして下さい。
② 実験責任者は、研究の全容
を把握し、実験従事者の安全
の確保に努めてください。
① 記入者情報の入力
このアドレスに連絡メー ルが届きます。 ※実験責任者は必須 実験責任者: 組換え実験の経験 3年以内の組換えDNA実験講習会 受講[またはLACSでの受講] 1年以内の健康診断受診の記入が 必要です。 ログインユーザー以外に実験 計画書のデータを参照させた い場合に、記入して下さい。 ここに記入した委員にも、 実験計画を申請した旨、 メールが届きます。 マウスポインタを近づけると、 注釈が表示されます。 16 プルダウンにて職名を選択して 下さい。組換えDNA動物実験のみの 時は P1A, P2A, P3Aのみに チェック
④ 実験の区分と封じ
込めレベルを決定
DNA供与体と宿主の組み合わせ → 物理的封じ込め
レベルの判断
実験計画の内容に基づいて決定
1）”P1”と”P2以上”では委員会の審査の流れが大きく異なります。
P1: 委員長の確認・判断で迅速審査が行われます。
P2, P3: 委員会の委員全員での審査になります。
→ 本来P1のものをP2, P3として申請すると、
“時間” + “手間” = “
迅速な審査の妨げ
”になります。
2）”本来P1の扱いだが、P2の実験区域で作業するので、P2実験に準じた取り扱いをする”場合、
→ P1として申請し、備考の欄に上記を記入して下さい。
参照）遺伝子組換え生物の第二種使用等について（特に、p.12-17ページ）
http://www.lifescience.mext.go.jp/files/pdf/n815_01.pdf
FAQ1) 一時保存の方法 組換えDNA申請者用マニュアル をご覧ください。文部科学省ホームページ
・
「遺伝子組換え生物等の使用等の規制による生物の多様性の確保
に関する法律」関連
組換えＤＮＡ実験安全委員会ホームページ
1 章 遺伝子組換え生物の 第二種使用等について 2 章 大臣確認が不要な実験の流れ 3 章 大臣確認が必要な実験の流れ 認定宿主ベクター系等を定める 大臣確認申請フォーマット 20
http://www.lifescience.mext.go.jp/bioethics/anzen.html
認定宿主ベクター系等を定める
日本ウイルス学会ホームページ http://jsv.umin.jp/
・組換え体ワクシニアウイルスについての申請例
・組換え体センダイウイルスについての申請例
・組換え体ポリオウイルスについての申請例
⑤ 課題名の入力
⑥ 実施期間
暦月で５年以内で入力し てください。⑦ 実験従事者
• 3年以内の組換えDNA実験 講習会の受講 [またはLACSでの受講] • 1年以内の健康診断受診 が必要です。 表示する項目数の変更が 可能です。 申請ボタン：申請内容に 記入漏れがないか自動的 当然ですが、研究内容を 適切に示す課題名にして 下さい。 FAQ2）実験責任者の実験の経験欄の記入の方法 本学あるいは他大学(機関名も記入）で過去に実施した組換えDNA実験の課題番号およ び課題名(最新のも１件)を記入 本学での実験の場合、整理番号を入力してリターンボタンをクリックすると、自動的 にリンク(承認番号と課題名が表示）します。 本学での組換えDNA実験がない場合は、実験計画書またはそれに代わるもの（論文 等）を添付して下さい。 本学での組換えＤＮＡ実験がない場合は、実験計画書またはそれに代わるもの（論文 等）を添付してください。 （注５）健康診断は実験開始 日の１年以内に必ず受診する こと。外部の医療機関で健康 診断を受けた場合は、その他 参考となる事項に医療施設名 及び受診日を報告願います。 23(1) 実験の内容のどの部分が組換えDNA実験なのか？ (2) 動物を用いる実験を行うのか？ DNA組換え体（細菌、マウス等）の分与を受ける場合、 また作成を外部に依頼する際（ノックアウトマウス作成）は、 →分与元、依頼先(研究者名だけでなく所属)や参考文献を明記して下さい。 (3) どこで実験するのか？ 各実験ごとに実施する実験室を明記 （実験施設のチェックのため、室名までお願いします。） 例） １. 遺伝子クローングや遺伝子発現のためのプラスミドDNAを構築し、さらにその プラスミドを大量調製するために大腸菌を形質転換する。 ２. 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製：BSL 3の細菌の遺伝子をプ ラスミド(pET28a)に組み込んだものを○○大学○○学部○○氏より分与しても らう（文献）。これを大腸菌[BL21(DE3)]に導入し、リコンビナントタンパク 質を調製する。 3. 遺伝子改変動物(ノックアウトマウスなど)を購入・導入(入手先を記載)、繁殖 して実験に用いる。 →動物実験の申請が必要です。（申請書のアップロード） 4. ウイルスベクターを用いた動物細胞および動物個体への遺伝子導入と感染実験 ○○社のキット(○○ ○○)を用いてリコンビナントレンチウイルスベクターを 作製し、HEK293細胞やマウス(○○ tgマウス、○○KOマウス)の脳に遺伝子導 入する。 5. バキュロウイルスを用いて作製したリコンビナントタンパク質の購入： ○○社より○○リコンビナントタンパク質を購入するが、タンパク溶液からバ キュロウイルスを完全に除去できていない旨、情報提供があったため、当該実 験を申請する。
⑨ 実験の概要
詳細に記載して下さい。
24⑧ 実験の目的
詳細に記載して下さい。
注意事項： ・ DNA供与体の生物種名 菌種名、株名を正確に明記して下さい。 “その他”や”○○など”曖昧な表現はNGです。株によってBSLレベルが異なる菌は株名まで記入して下さい。 ・ DNA供与体 ベクター内のDNAや遺伝子(CMVプロモーターなど)注)、 ノックアウトマウスに組み込まれたネオマイシン耐性遺伝子、 loxP配列やGFP, Creリコンビナーゼ等について記載漏れが多々あります。忘れずに記載して下さい。 ・ カルタヘナ法では培養細胞は宿主として扱われませんので、ご注意ください。
⑩ DNA供与体・宿主の
組み合わせ
詳細に記載して下さい。
宿主がウイ ルスの場合、 保有細胞、 動植物種を 記載して下 さい）。 例） ヒト (Homo sapiens) マウス (Mus musculus） ラット (Rattus norvegicus) オワンクラゲ (Aequorea victoria） 非病原性大腸菌 (Escherichia coli) 注)文科省の説明資料(平成18年10月)には、「ベクター内に含まれる薬剤耐性遺伝子などのマーカー遺伝子と、目的遺伝子に 係るものを除く発現調節遺伝子である供与核酸が由来する核酸供与体の特性または供与核酸の特性に関しては記載を省略で きる 」旨記載されていますが、DNA供与体・宿主の組み合わせを省略して良いとは記載されていません。上記を拡大解釈 し、ノックアウトマウス(供与核酸：大腸菌・ネオマイシン耐性遺伝子)を非LMOとすることは問題があります。プラスミド に含まれるCMVプロモーターを組換えて、レンチウイルスベクターに組み込む場合など、明らかにLMOになります。 （LMO: Living Modified Organism)⑪ ベクターの特性、核酸供
与体及び供与核酸の特性
詳細に記載して下さい。
核酸供与体及び供与核酸の特性について記載して下さい。また、毒素 産生性の有無、哺乳動物に対する毒性があれば、明記して下さい。ベクターの特性
例) 1. pUC系(pBluescript等)の大腸菌用のクローニングベクター（参考資料としてマップ添付もしくは販売元会社名） 2. pBR322系：pTrc (Invitrogen), pET (Novagen), pQE (Qiagen) 等の大腸菌の発現用プラスミドベクター 3. pUC系(pcDNA3等)哺乳類細胞発現用プラスミドベクター（Invitrogen）4. アデノ随伴ウイルス作製用プラスミドベクター(pW1,p5CLZ,pIM45,pladeno1等: 参考資料10[自作ベクターは マップを添付])
5. pLenti系レンチウイルス作製用プラスミドベクター(pLenti6.3, pLenti7.3等: Invitrogen）
核酸供与体及び供与核酸の特性
例）
1. ヒト、マウス、ラット cDNAおよびゲノム断片（同定済み遺伝子）
2. 大腸菌 (同定済み遺伝子): 薬剤耐性遺伝子(アンピシリン、カナマイシン、ネオマイシン、テトラサイクリン耐 性遺伝子等)：省略可
3. 有鞘類オワンクラゲ(同定済み遺伝子): 蛍光タンパク質遺伝子 (EGFP, YFP, AcGFP等)
4. 造礁サンゴ(同定済み遺伝子): 蛍光タンパク質遺伝子 (ZsGreen, DsRed, mCherry等) 核酸供与体
5. バクテリオファージ科 P1ファージ(同定済み遺伝子): Cre リコンビナーゼ、loxP配列 (組換え酵素認識配列) 6. 上記に加え、P1ファージエンハンサー、各種発現用プロモーター、ポリアデニン付加シグナルは、哺乳類細胞 内で翻訳されないため病原性等をもたない。：省略可 7. 本実験に使用する組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスは自己増殖に必要な遺伝子を欠失して いるため二次的なウイルス粒子を産生(増殖)し、伝播することはなく、大臣確認実験には該当しない。ウイルス 粒子から毒素は産生しない。組換えアデノ随伴ウイルスおよび組換えレンチウイルスのバイオセーフティーレベ ルは、各々レベル１およびレベル２である。 （注９）毒素産生、ウイルスの使用にお いてはその特性の詳細を記入すること。 廃棄についての記載も必要です。 26
例1). ヒト○○遺伝子をHeLa細胞cDNAからPCRで増幅さpcDNA3発現ベクターにクローニングし、
ヒト培養細胞(293T細胞)に発現
させる。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考
ヒト 大腸菌（DH5a） P1 OO遺伝子
CMV(Cytomegalovirus） 大腸菌（DH5a） P1 早期プロモーター SV40(Simian virus 40） 大腸菌（DH5a） P1 polyA付加シグナル
認定宿主ベクター系。宿主はクラス１で、 核酸供与体CMV、SV40はクラス2であるが、 この供与核酸は同定済み、かつ、哺乳動物 等に対する病原性、伝達性に関与しないこ とが推定される。 ベクターの特性 pcDNA3(Invitrogen社)は哺乳類細胞発現用プラスミドベクターで、トランスフォームする大腸菌(DH5a)の組み合わせ は認定宿主ベクター系である(B1)。 核酸供与体及び供与核酸の特性 ヒトOOcDNA(クラス１)は同定済み遺伝子、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。 pcDNA3はアンピシリン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用CMVプロモーター、ポリアデニン付加シグナル、SV40エンハン サー・プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。 P1実験室で使用するが、使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。
記入例
カルタヘナ法では培養細胞は宿主として扱われません。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス1。例2). HIV1ゲノムを組み込んだプラスミドを○○大学医学部○○氏より分与してもらい
（文献○○）、これを鋳型にPCRをかけ、エンベロープタンパク質p120をpcDNA3発現
ベクターにクローニングし、293T細胞にトランスフェクトする。尚、プラスミドが導入
された細胞を容易に同定するため、EF1aプロモーターからGFP蛍光タンパク質遺伝子 が
発現するように
pcDNA3を改変
した。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 オワンクラゲ 大腸菌（DH5a） P1 GFP遺伝子 ヒト 大腸菌（DH5a） P1 EF1aプロモー ター CMV(Cytomegalovirus） 大腸菌（DH5a） P1 早期プロモーター SV40(Simian virus 40） 大腸菌（DH5a） P1 polyA付加シグナル HIV1(Human immunodeficiency virus type1) 大腸菌（DH5a） P1 gp120遺伝子 ベクターの特性 pcDNA3(Invitrogen社)は哺乳類細胞発現用プラスミドベクターで、トランスフォームする大腸菌(DH5a)の組み合わせは 認定宿主ベクター系である(B1)。EF1aプロモーターからGFP蛍光タンパク質遺伝子 が発現するようにpcDNA3を改変し た(添付書類のプラスミド・マップを参照)。 核酸供与体及び供与核酸の特性 HIV1はクラス3であるが、供与核酸であるHIV1-gp120は同定済み、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与し ないことが推定される。上記認定宿主ベクター系の大腸菌でエンベロープタンパク質gp120をプラスミドにクローニング し、増やしても、この組換え体は通常の自然環境において生育不可能であり、組換え生物の残存性ならびに他の生物への 伝染性はない。さらに、この組換え体を293T培養細胞にトランスフェクトしても感染性のウイルスは産生せず、この組換 え生物の残存性、他の生物への伝染性はない。実験室外での増殖はほとんど不可能である。 pcDNA3はアンピシリン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用CMVプロモーター、ポリアデニン付加シグナル、SV40エンハン サー・プロモーター、ネオマイシン耐性遺伝子を有する。 P1実験室で使用するが、使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。 認定宿主ベクター系。核酸供与体はそれぞれ、クラス2、 クラス3であるが、供与核酸であるCMVプロモーター、 SV40polyA付加シグナル、HIV1-gp120は同定済み、 かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しない ことが推定される(文献○○、GILSP参照)。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス１。 28
例3). 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製：BSL3のウイルス
HIV-1型のgag-24遺伝子をプラスミド(pET28a)に組み込んだものを○○大
学○○氏より分与してもらう（文献○○）。これを大腸菌[BL21(DE3)]に導
入し、リコンビナントタンパク質を調製する。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 T7ファージ 大腸菌(BL21) P1 T7 RNA Polymerase 遺伝子 l7ファージ 大腸菌(BL21) P1 DE3遺伝子 HIV1(Human immunodeficiency virus type1) 大腸菌(BL21(DE3)) P1 gag-24遺伝子 認定宿主ベクター系。供与核酸であるgag-24遺伝子は核酸が同定済み、かつ、核酸供与体はクラス３であるが、
その組換え体のみでは哺乳動物等に対する病原性、伝達 性に関与しないことが推定される(文献○○、GILSP参 照)。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス１。 大腸菌(BL21(DE3))は遺伝子組換え体である。 ベクターの特性 pET28a (Novagen社)は添付したプラスミドマップ及び説明書に示すように大腸菌発現用プラスミドベクターで、トランス フォームする大腸菌(BL21(DE3))の組み合わせは認定宿主ベクター系である(B1)。 核酸供与体及び供与核酸の特性
T7ファージのRNA Polymerase遺伝子、 λファージのDE3遺伝子は大腸菌BL21の認定宿主ベクター(B1)としての特性を変 えるものではない。 pET28aはカナマイシン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用T7・プロモーター配列、ターミネーター配列、lacIリプレッサー遺 伝子、f1 origin、 His-tag(HHHHHH)、T7-tag(MASMTGGQQMG)を有する。 HIV-1はクラス3であるが、供与核酸であるgag-24遺伝子は核酸が同定済み、かつ、その組換え体のみでは哺乳動物等に対 する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。上記認定宿主ベクター系の大腸菌でウイルスタンパク質gag-24をプ ラスミドにクローニングし、増やしても、この組換え体は通常の自然環境において生育不可能であり、組換え生物の残存性 ならびに他の生物への伝染性はない。 使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。
例4). 大腸菌を用いたリコンビナントタンパク質の調製：BSL3の細菌遺伝子○○
をプラスミド(pET28a)に組み込んだものを○○大学○○氏より分与してもらう
（文献○○）。これを大腸菌[BL21(DE3)]に導入し、リコンビナントタンパク質
を調製する。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 T7ファージ 大腸菌(BL21) P1 T7 RNA Polymerase 遺伝子 l7ファージ 大腸菌(BL21) P1 DE3遺伝子 BSL3細菌 大腸菌 (BL21(DE3)) P3 OO遺伝子 認定宿主ベクター系。定済みだが、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しない核酸供与体はクラス3で、供与核酸は同 と言えない。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス１。 大腸菌(BL21(DE3))は遺伝子組換え体である。 ベクターの特性 pET28a (Novagen社)は添付したプラスミドマップ及び説明書に示すように大腸菌発現用プラスミドベクターで、トラン スフォームする大腸菌(BL21(DE3))の組み合わせは認定宿主ベクター系である(B1)。 核酸供与体及び供与核酸の特性 T4ファージのRNA Polymerase遺伝子、λファージのDE3遺伝子は大腸菌BL21の認定宿主ベクター(B1)としての特性を変 えるものではない。 pET28aはカナマイシン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用T7・プロモーター配列、ターミネーター配列、lacIリプレッサー 遺伝子、f1 origin、His-tag(HHHHHH)、T7-tag(MASMTGGQQMG)を有する。 BSL3の細菌遺伝子○○は同定済みだが、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないと言えないので、P3実験室で のみ使用する。使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。 （注）毒性等、その遺伝子の特性がわかっているときはそれを記載する。 30例5). ウイルスベクターを用いた動物細胞および動物個体への遺伝子導入と感染実験：
Invitrogen社のキット(Block-iT Inducible H1 Lentiviral RNAi System)を用いて、
Ifnar1の遺伝子のノックダウンするリコンビナントレンチウイルスベクターを作製し、
Jurkat細胞に導入する。(医学部基礎棟5階○○使用)。さらにこのベクターをマウス
(WT及びIrf1KOマウス)の脳に遺伝子導入する。(動物実験施○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 非病原性大腸菌 マウス P1A ネオマイシン耐性遺伝子 マウス 大腸菌（DH5a） P1 マウスIfnar1遺伝子のshRNA作成 用合成DNA マウス レンチウイルス（組 換え、増殖欠失） P2 マウスIfnar1遺伝子のshRNA作成 用合成DNA レンチウイルス（組換え、 増殖欠失） マウス P2A レンチウィルスゲノムはマウスに接種さ れマウスゲゲノム内に組み込まれる マウス 大腸菌（DH5a） P1 U6プロモーター 宿主のレンチウイルスはクラス2。この Lentiviral RNAi Systemの説明書を添付。Irf1KOマウスは動物実験の申請済（申請書の添付）。
Kitに含まれるpLenti6/H1-shRNAを構成的に shRNAを発現させるため、マウスU6プロモーター に置換したので、そのプラスミド・マップを添付。
ベクターの特性
Invitrogen社のキット(Block-iT Inducible H1 Lentiviral RNAi System)の説明書、及びプラスミド・マップを添付した。要約 すると、リコンビナントウイルスの構造やゲノムパッケージング用のコンポーネントをコードする遺伝子は、4つのプラスミド （gag/pol, env, rev, pLenti6/H1-shRNA）にわけられており、このシステムで作成されたレンチウイルスパーティクルは、 複製能力がなく目的の遺伝子をキャリーしているだけで他のウイルス種をつくりださない。また、3’LTRが欠失している自己不 活性化ベクターであり、宿主ゲノムに組み込まれる際に、5’LTRに存在するプロモーターが不活性化され、内部プロモーターで あるInducible H1によりshRNAの転写が起こる。このinducible H1プロモーターを、構成的に発現させるマウスU6プロモー ターに置換した。 核酸供与体の特性 マウスIfnar1遺伝子(クラス１)は同定済み遺伝子、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。 ノックダウンに使用するshRNA作成用合成DNAも哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。 改変pLenti6はアンピシリン耐性遺伝子、shRNA発現用マウスU6プロモーター、ターミネーター、SV40プロモーター、ブラ ストシジンS耐性遺伝子を有する。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス１。 31
例6). バキュロウイルスを用いて作製したリコンビナントタンパク質の購入：
Invitrogen社よりヒト○○リコンビナントタンパク質を購入するが、タンパク溶液
からバキュロウイルスを完全に除去できていない旨、情報提供があったため、当該
実験を申請する。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考 ヒト Baculovirus P1 ○○遺伝子 認定宿主ベクター系ではない。 宿主、核酸供与体ともクラス１。 ベクターの特性 Bac-to-Bac®システム(Invitrogen)を使用して作成したヒト○○リコンビナントタンパク質を購入。バキュロウイルス 発現ベクターpFastBac1は、リコンビナントタンパク質発現用バキュロウイルス・ベクターで、バキュロウイルスのポ リヘドリン・プロモーター、SV40のpolyA付加シグナルを持つ。130kDaのバキュロウイルスDNAを持つ大腸菌 (DH10BAC)をトランスフォームして、リコンビナント・バキュロウイルスを作成したもの。このリコンビナント・バ キュロウイルスは哺乳動物等の細胞に感染はするが、増殖しない(添付の説明書、プラスミド・マップを参照)。ただし、 認定宿主ベクター系ではない。 核酸供与体及び供与核酸の特性 ヒトOO遺伝子(クラス１)は同定済み遺伝子、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。 バキュロウイルスはクラス１で、遺伝子は同定済み、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推 定される。 pFastBac1はゲンタミシン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用ポリヘドリン・プロモーター、SV40ポリアデニン付加シグ ナル、トランスポゾンTn7、アンピシリン耐性遺伝子を有する。 使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。 32例7). Bac-to-Bac®システム(Invitrogen)で作製した、Ａ型インフルエ
ンザウイルス(H1N1 WSN株)NPタンパク質をバキュロウイルスを用いて
合成させる(メーカーのマニュアルを添付)。(医学部基礎棟5階○○使用)
核酸供与体(生物種) 宿主 実験分類 備考
Influenza virus type A (H1N1 WSN株) Baculovirus P2 NP遺伝子 保有細胞はSf9昆虫 細胞 Baculovirus 大腸菌（DH10B） P1 130 kb Baclulovirus DNA in a BAC Baculovirus 大腸菌（DH10B） P1 ポリヘドリン・プロモー ター
SV40(Simian virus 40） 大腸菌（DH10B） P1 polyA付加シグナル
認定宿主ベクター系ではない。宿主はクラス1、 核酸供与体はクラス2またはクラス1。 保有細胞を記載。 認定宿主ベクター系。宿主、核酸供与体ともクラス１。 ベクターの特性 Bac-to-Bac®システム(Invitrogen)の説明書、プラスミド・マップを添付した。バキュロウイルス発現ベクターpFastBac1 は、リコンビナントタンパク質発現用バキュロウイルス・ベクターで、バキュロウイルスのポリヘドリン・プロモーター、 polyA付加シグナルを持つ。BAC(bacteriall artificial chromosome)に乗った130kDaのバキュロウイルスDNAを持つ大腸 菌(DH10BAC)をトランスフォームして、リコンビナント・バキュロウイルスを作成する。このリコンビナント・バキュロ ウイルスは哺乳動物等の細胞に感染はするが、増殖しない。ただし、認定宿主ベクター系ではない。 核酸供与体及び供与核酸の特性 A型インフルエンザウイルス(H1N1 WSN株)はクラス2であるが、供与核酸である核タンパク質NP遺伝子は核酸が同定済み、 かつ、その組換え体のみでは哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定される。 バキュロウイルスはクラス１で、遺伝子は同定済み、かつ、哺乳動物等に対する病原性、伝達性に関与しないことが推定さ れる。 pFastBac1はゲンタミシン耐性遺伝子、目的遺伝子発現用ポリヘドリン・プロモーター、SV40ポリアデニン付加シグナル、 トランスポゾンTn7、アンピシリン耐性遺伝子を有する。 使用したチップ、容器、培地等はオートクレーブをかけた後、廃棄する。
核酸供与体（生物種）、宿主、ベクターの確認
DNA供与体、宿主の区分は、下記のサイトを参考にして、注意深く記載してください。
研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を定
める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件
平成１６年文部科学省告示第７号
最終改正：平成２６年7月1日
改正点についてはこちらを参照
「研究開発等に係る遺伝子組換え生物等の第二種使用等に当たって執るべき拡散防止措置等を
定める省令の規定に基づき認定宿主ベクター系等を定める件の一部を改正する告示」（平成2６
年7月1日）についての解説 (http://www.lifescience.mext.go.jp/files/pdf/n648_02.pdf)
34核酸供与体(生物種)、宿主、ベクターの確認
特定認定宿主ベクター系
核酸供与体(生物種)、宿主、ベクターの確認
核酸供与体(生物種)、宿主、ベクターの確認
クラス２
クラス１
核酸供与体(生物種)、宿主、ベクターの確認
Competent cell: BL21(DE3)は、
遺伝子組換え体です。
（１）宿主情報
宿主名： BL21（由来： E.coli B株）
導入遺伝子： T7 RNA Polymerase遺伝子 （由来： T7ファージ）
DE3遺伝子 （由来： λファージ）
（２）遺伝子型
⑪ 使用する実験室
「次頁に解説」
室名、部屋番号をアップロード した図面で確認して下さい。 （注１０） ①登録していない部屋を使用する場合には、組換えDNA実験安全委員の現地 確認が必要です。調査委員に計画書の写しを送付できるよう準備願います。 「登録していない新規の施設・設備を利用する」にチェックを入れて下さ い。必ずその他参考となる事項欄に「実験室調査依頼中」である旨コメン トを入れて下さい。組換えＤＮＡ実験安全委員会のＨＰより実験施設設 置・変更申請書を入手し作成して下さい。 ②現地確認後設置承認通知が送付されますので、承認通知書及び組換えＤＮ Ａ実験施設設置・変更申請書（部屋の詳細図、フロア図含む）をその他参 考事項となる事項に添付した上で従来の申請手続きをおこなってください。 （「実験室調査依頼中」のコメントは削除すること） 40１．使用を希望する実験室のBSL（バイオセーフティーレベル）の確認
実験計画の内容に基づいて決定したレベル以上の実験室を使用して下さい。
組換えDNA実験室として登録してある実験室名
登録されてない実験室→部局の委員に事前相談、申請後委員の現地調査を
受けて登録（P1：調査委員1名、P2以上：調査委員2名）
２．申請者の実験室外で実験を行う場合、実験室の責任者に使用の許可を得てくださ
い。
組換えDNA実験室の入り口に責任者名が表記されている
例： 動物実験
→
【エリア別】 棟： 動物実験施改修Ａ棟(A343)、
封じ込めレベル： P1A
、（図面：animal a P1A.pdf）
PDFファイルや画像ファイルを 添付資料としてアップロードで きます。 特にウイルス作成用のベクター や、一般的でないベクターにつ いては、マップをアップロード して下さい。
⑫ 関連する実験の申請書
例）
・ 動物実験申請書（または申請
状況を記載する）
・ 遺伝子改変動物を入手して使
用する場合
→入手先を記載： 学外からの
譲渡等の場合は譲渡の計画書と
先方からの情報提供書
・ 以前の実験の継続のため新規
に申請する場合
→
以前の申請書
FAQ3) 参照する実験計画書の リンク方法 プルダウンすると、動物か遺伝子か聞いてきますので、 どちらかを選択後、左の整理番号を入力してリターン ボタンをクリックすると自動的にリンクします。 42⑬ 訂正箇所
修正等のために差し戻さ
れた場合、再提出の際、
修正した点について、
まとめて記載して下さい。
変更申請について
xxxxxxxxx 44⑭ 変更・追加
申請
ここをクリック
して下さい。
xxxxxxxxx
変更申請について
例）実験従事者として以下の2名を追加 ○○ ○○ 薬学部 学部生 ○○ ○○ 薬学部 学部生 組換えDNA実験を行うため 変更申請でOKなのは、実験従事者 の削除・追加・所属等変更、同じク ラスの核酸供与体の追加など軽微な 変更(ただし、DNA 供与体の種の追 加については、科が同じであれば、 P１レベルのみ変更・追加申請) 委員長決裁 異なるクラスの核酸供与体の追加 や実験室の追加・変更も可 (実験責 任者、課題名、実験の目的等の重 大な変更については変更ではなく 新規の計画として申請すること。) 委員長判断で、委員長決裁もしくは 委員全員の審査に委ねるかを決定 部局担当者 部局担当者⑮ 変更事項、変
更理由、訂正箇所
を記入して下さい。
※組換えDNA実験講習会受講歴、健康 診断受診年月の更新もすること。大臣確認実験申請書（第二種使用等拡散防止措置確認申請書）
申請書の様式は、
文部科学省の遺伝子組換え実験
のHPからダウンロード
できます。
http://www.lifescience.mext.go.jp/files/pdf/
n901_00.doc
記入法や注意点は、
文部科学省の遺伝子組換え実験のHP「遺伝子組換え生
物等の第二種使用等の手引き」および
日本ウイルス学
会のHP
を参照してください。
記入例)
http://www.lifescience.mext.go.jp/bioethics/data/
anzen/carta_expla08.pdf
46大臣確認が必要な「実験」は省令別表第一にあり、概要は以下の通りです。実験の種類(省令第2 条に規定)ごとに、宿主と核酸供与体の実験分類等（省令 第3 条、告示に規定）の条件から、大臣確認の要否が分かります ① 微生物※1 実験 ・実験分類が定まっていないもの (ただし、いくつかの条件を満たす場合は、大臣確認は不要となります。詳細はお問合せ下さい。) ・宿主または核酸供与体の実験分類のいずれかがクラス4 ・宿主の実験分類がクラス3 ・認定宿主ベクター系を用いてなく、核酸供与体の実験分類がクラス3 であるもののうち、以下のいずれか ① 供与核酸が同定済核酸ではないもの ② 供与核酸が同定済核酸であり、哺乳動物等※2 に対する病原性又は伝達性に関連するもの、かつ宿主の病原性を著しく高めることが科学的知見 に照らし推定されるもの ・宿主の実験分類がクラス2 であり、供与核酸に薬剤耐性遺伝子（当該微生物に感染した哺乳動物等※2 の治療を困難にするものに限る）を含むもの（ウ イルス・ウイロイドは本規定適用外）
・自立的な増殖力及び感染力を保持したウイルス・ウイロイドであり、使用等を通じて増殖するもの（Human retrovirus 以外のRetrovirus、Baculovirus、 植物ウイルス等の例外あり。告示別表第３も参照。） ・供与核酸が蛋白質毒素にかかる遺伝子を含むもの（哺乳動物等※2 に対する半数致死量が100μg/kg 以下の場合。宿主が大腸菌である認定宿主ベクター 系の場合は100ng/kg 以下） ② 大量培養実験 ・①の条件に該当するもの ・認定宿主ベクター系を用いていない遺伝子組換え生物等であって、宿主又は核酸供与体の実験分類がクラス2 であるもののうち、供与核酸が哺乳動物に 対する病原性又は伝達性に関連し、その特性により宿主の病原性（哺乳動物等※2 に対する病原性）を著しく高めることが推定されるもの ・特定認定宿主ベクター系を用いていない遺伝子組換え生物等であり、核酸供与体の実験分類がクラス3 であるもの ・省令にある条件(P13 ホ参照)を満たさない生物等についてLSC の拡散防止措置を執るもの(LSC とできない場合あり) ③ 動物※3 使用実験 ・①の条件に該当するもの ・宿主が動物※3 であり、供与核酸が哺乳動物等※2 に対する病原性がある微生物等※1 の感染を引き起こす受容体を付与するもの (例えば、昆虫やマウ ス等に対して、ヒトに感染する病原体の受容体を付与するものが該当します。) ・省令にある条件(P15 ホ参照)を満たさない生物等について、特定飼育区画の拡散防止措置を執るもの（特定飼育区画に変更できない場合もあります。） ④ 植物等使用実験 ・①の条件に該当するもの ・省令にある条件(P17 ホ参照)を満たさない生物等について、特定網室の拡散防止措置を執るもの（特定網室に変更できない場合もあります。） ⑤ すべての細胞融合実験 （注）カルタヘナ法での細胞融合実験とは、異なる分類学上の科に属する生物の細胞を融合する技術の利用により得られた核酸又はその複製物を有する生 物に係る遺伝子組換え実験、とされています。（法第2 条、省令第2 条参照） ※1 微生物等 ：菌界（きのこ類除く）、原生生物界、原核生物界に属する生物。ウイルス、ウイロイド（きのこ類の実験は、植物等使用実験に含みます） ※2 哺乳動物等 ：哺乳網、鳥網に属する生物
