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平 成

2 2

年 度 修 士 学 位 論 文

レ セ プ タ ー レ セ プ タ ー レ セ プ タ ー

レ セ プ タ ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 固 固 固 固 定 定 定 定 化 化 化 化 セ セ セ セ ン ン ン ン サ サ サ サ ー ー ー ー チ チ チ チ ッ ッ ッ ッ プ プ プ プ を を を を 用 用 用 用 い い い い た た た た

バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ タ ン パ ク バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ タ ン パ ク バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ タ ン パ ク

バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ タ ン パ ク 質 質 質 質 の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 解 解 解 析 析 析 析

三 重 大 学 大 学 院 生 物 資 源 学 研 究 科 博 士 前 期 課 程

生 物 圏 生 命 科 学 専 攻 生 命 機 能 科 学 講 座 生 理 活 性 化 学 教 育 研 究 分 野

南 平 麻 衣

略 語 表

C M 5

：

C M

基 を 導 入 し た デ キ ス ト ラ ン を コ ー テ ィ ン

グ し た セ ン サ ー チ ッ プ

C M 3

： コ ー テ ィ ン グ さ れ て い る

C M

デ キ ス ト ラ ン が

短 い セ ン サ ー チ ッ プ

F c

： フ ロ ー セ ル

目 次

第

1

章 緒 論

第

1

節 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ φ

X 1 7 4

に つ い て

· · · 1

第

2

節 リ ポ 多 糖 に つ い て

· · · 2

第

3

節

B I A C O R E

に つ い て

· · · 3

第

4

節 本 研 究 の 背 景 お よ び 目 的

· · · 5

第

2

章 レ セ プ タ ー 糖 鎖 固 定 化 セ ン サ ー チ ッ プ の 調 製 第

1

節 セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

へ の レ セ プ タ ー 糖 鎖 の 固 定 化

· · · 9

第

2

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 1 0

第

3

章 φ

X 1 7 4

ス パ イ ク

G

タ ン パ ク 質 単 量 体 と の 相 互 作 用

解 析

第

1

節

H i s G

の 発 現 お よ び 精 製

· · · 1 2

第

2

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s G

と の 相 互 作 用 解 析

· · · 1 3

第

3

節 相 互 作 用 の 温 度 依 存 性 の 検 討

· · · 1 5

第

4

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 1 5

第

4

章 φ

X 1 7 4

ス パ イ ク

G

タ ン パ ク 質

5

量 体 と の 相 互 作 用

解 析

第

1

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

の 相 互 作 用 解 析 条 件 の

検 討

· · · 1 9

第

2

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

の 相 互 作 用 解 析

· · · 2 0

第

3

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 2 0

第

5

章 セ ン サ ー チ ッ プ

C M 3

を 用 い た

G

タ ン パ ク 質

5

量 体

と の 相 互 作 用 解 析

第

1

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 固 定 化

C M 3

の 調 製

· · · 2 4

第

2

節

C M 3

を 用 い た レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

と の 相 互

作 用 解 析

· · · 2 5

第

3

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 2 6

第

6

章 φ

X 1 7 4

ス パ イ ク

H

タ ン パ ク 質 と の 相 互 作 用 解 析

第

1

節

H i s H

の 精 製

· · · 2 9

第

2

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s H

と の 相 互 作 用 解 析

· · · 3 0

第

3

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 3 0

第

7

章

P 2

フ ァ ー ジ テ イ ル

g p V

タ ン パ ク 質 と の 相 互 作 用 解

析

第

1

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

P 2

フ ァ ー ジ テ イ ル ス パ イ ク タ ン パ ク 質

g p V

と の 相 互 作 用 解 析

· · · 3 3

第

2

節 結 果 お よ び 考 察

· · · 3 4

第

8

章 総 括

· · · 3 7

第

9

章 実 験 の 部

第

1

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 の セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

へ の 固 定

化

· · · 4 1

第

2

節

H i s G

の 発 現 お よ び 精 製

· · · 4 2

第

3

節

C M 5

に よ る レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s G

と の 相 互 作 用

検 討 お よ び 温 度 依 存 性 の 検 討

· · · 4 4

第

4

節

c H i s G

の 発 現 お よ び 精 製

· · · 4 5

第

5

節

C M 5

に よ る レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

と の 相 互 作

用 解 析

· · · 4 7

第

6

節 レ セ プ タ ー 糖 鎖 固 定 化

C M 3

の 調 製

· · · 4 8

第

7

節

C M 3

を 用 い た レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

と の 相 互

作 用 解 析

· · · 4 8

第

8

節

H i s H

の 発 現 お よ び 精 製

· · · 4 9

第

9

節

C M 5

に よ る レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s H

と の 相 互 作 用

解 析

· · · 5 1

第

1 0

節

C M 5

を 用 い た レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

P 2

フ ァ ー ジ テ イ

ル ス パ イ ク タ ン パ ク 質

g p V

と の 相 互 作 用 解 析

5 2

謝 辞

· · · 5 3

参 考 文 献

· · · 5 4

第 第 第

第 1 章章章章 緒緒緒緒 論論論論

第第

第第 1 節節節節 ババババ クククク テテテテ リリリリ オオオオ フフフフ ァァァァ ーーーー ジジジジ

φ φ φ φ

X 1 7 4 にににに つつつつ いいいい てててて

バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ φ

X 1 7 4

は 、 ミ ク ロ ウ イ ル ス 科 に 属 す

る 環 状

1

本 鎖

D N A

ウ イ ル ス で あ る 。 直 径

2 6 n m

の 正

2 0

面

体 構 造 を し て お り 、 正

2 0

面 体 の 各 頂 点 に は ス パ イ ク と 呼 ば れ る

1 2

個 の 突 起 が 存 在 す る

1_）

。 φ

X 1 7 4

は

F

・

G

・

H

・

J

の

4

種 の 構 造 タ ン パ ク 質 に よ っ て 構 成 さ れ て い る 。 そ の 中 で 、

F

タ ン パ ク 質 は 、 正

2 0

面 体 の カ プ シ ド 骨 格 を 形 成 し て い る 。

H

タ ン パ ク 質 は 宿 主 細 菌 内 へ ウ イ ル ス

D N A

を 導 く パ イ ロ

ッ ト タ ン パ ク 質 の 役 割 を 担 っ て い る 。 ま た 、

5

個 の

G

タ ン パ ク 質 が

H

タ ン パ ク 質 の 周 囲 を 囲 ん で 存 在 し 、 ス パ イ ク を 形 成 し て い る 。

J

タ ン パ ク 質 は ウ イ ル ス 粒 子 内 部 に 位 置 し 、

フ ァ ー ジ 粒 子 の 形 態 形 成 の 際 に 、

D N A

の 折 り た た み に 必 要

で あ る （

F i g u r e 1 - 1

） 。

F i g u r e 1 - 1 バ ク テ リ オ フ ァ ー ジ φX 1 7 4 の 構 造 スパイク

スパイクスパイク

スパイク

H

F G

26 nm

φ

X 1 7 4

の 宿 主 細 菌 へ の 感 染 初 期 過 程 に は 、 吸 着 、 エ ク リ

プ ス 、

D N A

挿 入 の

3

段 階 が あ る

2）

。 第

1

段 階 で あ る 吸 着 で は 、 宿 主 細 菌 を 認 識 し 、 可 逆 的 に 接 触 す る

3_）

。 そ し て 第 ２ 段 階 で あ る エ ク リ プ ス で は 、 ま ず 、

F

お よ び

G

タ ン パ ク 質 の 高 次 構 造 が 変 化 す る 。 そ し て こ れ を 引 き 金 と し 、

H

タ ン

パ ク 質 と フ ァ ー ジ

D N A

が 、

G

タ ン パ ク 質

5

量 体 に よ っ て 形

成 さ れ て い る ス パ イ ク チ ャ ン ネ ル を 通 り 、 一 部 分 が 飛 び 出 し た 状 態 と な る

2 , 4_）

。第

3

段 階 で は 、エ ク リ プ ス 状 態 か ら 、

フ ァ ー ジ

D N A

が 宿 主 細 菌 内 に 放 出 さ れ る 。

D N A

を 放 出 し

た φ

X 1 7 4

は 、 空 の カ プ シ ド を 宿 主 細 菌 の 細 胞 外 に 吸 着 さ せ

た ま ま 、 宿 主 細 胞 の 代 謝 経 路 を 利 用 し 、 増 幅 に 必 要 な 遺 伝

子 を 発 現 さ せ て 、構 造 タ ン パ ク 質 や

D N A

の 複 製 を 行 う 。合

成 さ れ た タ ン パ ク 質 か ら フ ァ ー ジ の カ プ シ ド 前 駆 体 で あ る

プ ロ カ プ シ ド が 形 成 さ れ た 後 、

D N A

が カ プ シ ド 内 に 折 り た

た ま れ 、 成 熟 し た ウ イ ル ス と な る 。 成 熟 し た φ

X 1 7 4

は 、 宿

主 を 溶 菌 し て 菌 体 外 へ と 出 て 行 く の で あ る 。

第 第 第

第 2 節節節節 リリリリ ポポポポ 多多多多 糖糖糖糖 にににに つつつつ いいいい てててて

リ ポ 多 糖 （

l i p o p o l y s a c c h a r i d e , L P S

） は 、 親 水 性 の 糖 鎖 部

分 と 疎 水 性 の 脂 質 部 分 を 持 つ 両 親 媒 性 物 質 で あ り 、 グ ラ ム

陰 性 菌 の 外 膜 構 成 成 分 で あ る 。 リ ピ ド

A

と 呼 ば れ る 脂 質 部

分 を ア ン カ ー と し て 膜 内 に 下 ろ し 、 糖 鎖 部 分 を 細 胞 外 に 向

け て 存 在 す る 。 リ ポ 多 糖 は ア ミ ノ 糖 と 脂 肪 酸 か ら な る リ ピ

ド

A

、

2 -

ケ ト

- 3 -

デ オ キ シ オ ク ツ ロ ソ ン 酸 （

K D O

） と ヘ プ ト ー ス か ら な る 内 部 コ ア 糖 鎖 と そ れ に 続 い て 主 に ヘ キ ソ ー ス と ヘ キ ソ サ ミ ン か ら な る 外 部 コ ア （ 両 者 を 合 わ せ て

R

コ ア と 呼 ぶ ） 、 お よ び 菌 の 抗 原 性 を 担 う

O-

抗 原 多 糖 部 分 か ら 成 り 立 っ て い る

5_）

（

F i g u r e 1 - 2

） 。

F i g u r e 1 - 2 リ ポ 多 糖 の 構 造

φ

X 1 7 4

は 、 こ の

L P S

を レ セ プ タ ー と し て 認 識 し て 、 感 染

す る

6_）

。

第第

第第 3 節節節節 B I A C O R E にににに つつつつ いいいい てててて

B I A C O R E

と は 、 表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 （

S u r f a c e P l a s m o n

R e s o n a n c e , S P R

） を 用 い た 分 子 間 相 互 作 用 測 定 機 で あ る 。

表 面 プ ラ ズ モ ン 共 鳴 と は 、 金 薄 膜 と ガ ラ ス の 境 界 面 に 全 反 射 す る よ う に 光 が 照 射 さ れ る と 、 境 界 面 に 沿 っ て 波 （ エ バ ネ ッ セ ン ト 波 ） が 発 生 し 、 こ の 波 の 位 相 速 度 と 電 子 の 振 動

（ 表 面 プ ラ ズ モ ン ） の 位 相 速 度 が 一 致 す る た め 、 共 鳴 的 に 表 面 プ ラ ズ モ ン が 励 起 す る 現 象 の こ と で あ る

7_）

。 表 面 プ ラ

ズ モ ン の 励 起 に 入 射 光 の 一 部 の エ ネ ル ギ ー が 使 わ れ る た め 、

反 射 光 の 一 部 の 強 度 が 低 下 す る 。 こ の 暗 く な っ た （ 低 下 し

アナライト リガンド

センサーチップ 反射光

光源

フローセル

暗部の角度変化

Time(sec) ΔRe

sona nce Unit

(RU) [LA]→[L]+[A]

-d[LA]/dt=k

d[LA]

KD=k

d/ k

a

[L]+[A] k_a [LA]

kd [LA]=R_t [L]=R_max-R_t

dR/dt=k

aC(R_max-R_t)-k

dR_t 結合相

添加終了

解離相

アナライト 添加開始

0

R_t: リアルタイムRU値

R_max: 固定化されたリガンドに対する最 大アナライト結合RU値

た ） 部 分 の 角 度 は 、 セ ン サ ー チ ッ プ 表 面 の 溶 媒 の 屈 折 率 に 依 存 す る 。 リ ガ ン ド と ア ナ ラ イ ト が 結 合 し 、 質 量 変 化 （ ＝ 溶 媒 の 屈 折 率 変 化 ） が 起 き る と 、 暗 く な っ た 部 分 の 角 度 が 変 化 す る （

F i g u r e 1 - 3

） 。

F i g u r e 1 - 3 B I A C O R E の 測 定 原 理 模 式 図

こ の 暗 く な っ た 部 分 の 角 度 変 化 を 縦 軸 に と り 、 横 軸 に 時 間

を と っ た も の が セ ン サ ー グ ラ ム と 呼 ば れ る

B I A C O R E

の 測

定 デ ー タ で あ る （

F i g u r e 1 - 4

） 。 縦 軸 の 単 位 は

0 . 1

度 の 角 度

変 化 を

1 0 0 0 R U

と 定 義 し て お り 、 生 体 分 子 で は 、

1 R U

＝

1

p g / m m²

に 相 当 す る 。

F i g u r e 1 - 4 B I A C O R E に お け る 測 定 デ ー タ （ セ ン サ ー グ ラ ム ） の 例

入射光

B I A C O R E

で の 分 子 間 相 互 作 用 測 定 は 、 ま ず 、 測 定 し た い

分 子 の 片 方 を セ ン サ ー チ ッ プ と 呼 ば れ る 極 板 に 固 定 化 し

（ 固 定 化 し た 分 子 を リ ガ ン ド と い う ） 、

B I A C O R E

に セ ッ ト

す る 。 そ し て 、 も う 片 方 の 分 子 を 含 ん だ 溶 液 を 一 定 時 間 添 加 す る （ 溶 液 と と も に 添 加 す る 分 子 を ア ナ ラ イ ト と い う ） 。 固 定 化 さ れ た リ ガ ン ド の 濃 度 変 化 は な い た め 、 ア ナ ラ イ ト 濃 度 に 依 存 し て 、 結 合 量 と 反 応 速 度 が 変 化 す る 。 ア ナ ラ イ ト の 添 加 が 終 わ る と 、 即 座 に 溶 液 が ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 に 切 り 替 わ り 、 ア ナ ラ イ ト の 濃 度 が

0

に な る 。 そ の た め 、 リ ガ ン ド に 結 合 し て い た ア ナ ラ イ ト の 解 離 の 様 子 を 観 測 す る こ と が で き 、 解 離 速 度 定 数

kd

を 求 め る こ と が で き る 。 ま た 、 ア ナ ラ イ ト の 濃 度 が 既 知 で あ れ ば 、 セ ン サ ー グ ラ ム か ら 結 合 速 度 定 数

ka

が 求 め ら れ る 。 さ ら に 、 こ の ２ つ の 値 か ら 、 解 離 定 数

KD

を 算 出 す る こ と が で き る

1 4_）

。

こ の よ う に 、

B I A C O R E

で は 分 子 間 相 互 作 用 を ノ ン ラ ベ ル

で リ ア ル タ イ ム に モ ニ タ ー で き る た め 、 結 合 の 有 無 だ け で な く 結 合 の 強 度 や 結 合 ・ 解 離 の 速 度 、 選 択 性 な ど 、 様 々 な 情 報 を 得 る こ と が で き る 。

第 第 第

第

4

節 節 節 節 本 本 本 本 研 研 研 研 究 究 究 究 の の の の 背 背 背 背 景 景 景 景 お お お お よ よ よ よ び び び び 目 目 目 目 的 的 的 的

当 研 究 室 で は こ れ ま で 、

B I A C O R E

を 用 い た リ ポ 多 糖 と フ

ァ ー ジ タ ン パ ク 質 と の 相 互 作 用 測 定 を

2

種 類 の 方 法 で 行 っ

て き た 。 秋 田 は 、 疎 水 性 の セ ン サ ー チ ッ プ

H PA

上 に

L P S

含 有 リ ン 脂 質 単 分 子 膜 を 形 成 さ せ 、 そ の チ ッ プ 表 面 に

φ

X 1 7 4

ウ イ ル ス 粒 子 や タ ン パ ク 質 溶 液 を 供 す る こ と で 、

L P S

と φ

X 1 7 4

ウ イ ル ス 粒 子 、

H

タ ン パ ク 質 お よ び

H

タ ン パ ク 質

N

末 端 の

1 / 3

を 含 む

N

末 ド メ イ ン 、

C

末 端 の

1 / 3

を 含 む

C

末 ド メ イ ン と の 相 互 作 用 解 析 を 行 っ た 。 そ の 結 果 、

L P S

と

φ

X 1 7 4

ウ イ ル ス 粒 子 の 相 互 作 用 に お い て 、 解 離 定 数

K_D

は

4 . 5 4×1 0^{- 1 0} M

と 算 出 さ れ た 。 ま た 、

H

タ ン パ ク 質 お よ び そ

の ド メ イ ン と

L P S

と の 相 互 作 用 に お い て 、 解 離 定 数

K_D

は

H

タ ン パ ク 質 ＝

1 . 2 2×1 0^{- 7} M

、

N

末 端 ド メ イ ン ＝

1 . 4 1×1 0^{- 6} M

、

C

末 端 ド メ イ ン ＝

1 . 1 2×1 0^{- 7} M

と 算 出 さ れ た

8 , 9_）

。

冨 田 は 、

N

末 端 に ヒ ス チ ジ ン タ グ を 融 合 さ せ た

H

タ ン パ

ク 質 （

H i s H

） お よ び

N

末 端 に ヒ ス チ ジ ン タ グ を 融 合 さ せ た

G

タ ン パ ク 質 （

H i s G

） を セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

に 固 定 化 し 、

ア ナ ラ イ ト と し て 大 腸 菌

R 2

株 、

K - 1 2

株 お よ び

C

株 の

d e O N

体 （

O,N-

脱 ア シ ル 化

L P S

） を 添 加 し 、 相 互 作 用 解 析 を 行 っ

た 。 そ の 結 果 、

R 2

株 （ 宿 主 ） 、

K - 1 2

株 （ 非 宿 主 ） の 両 者 の

糖 鎖 は 、 と も に

C

株 の 糖 鎖 と 劣 ら な い 親 和 性 を 示 し た

1 0_）

。 し か し 、 こ の

2

つ の 方 法 に は 、 い く つ か の 困 難 な 点 が 存

在 し た 。 前 者 の セ ン サ ー チ ッ プ

H PA

に

L P S

含 有 リ ン 脂 質 単

分 子 膜 を 形 成 さ せ る 方 法 で は 、 リ ポ ソ ー ム を 固 定 化 さ せ て

も 、 そ の 後 の 多 重 に 結 合 し た 膜 を 洗 い 流 す 操 作 で 、 す べ て

の リ ポ ソ ー ム が 洗 い 流 さ れ て し ま う こ と が あ り 、 固 定 化 量

が 均 一 に な り に く い 問 題 が あ っ た 。 ま た 、 測 定 後 に 再 生 溶

液 を 流 し て も 、 ア ナ ラ イ ト が 剥 が れ ず 、 セ ン サ ー チ ッ プ が

再 生 さ れ な い と い う 問 題 も あ っ た

8 , 9_）

。

一 方 、 後 者 の フ ァ ー ジ ス パ イ ク タ ン パ ク 質 を セ ン サ ー チ ッ プ に 固 定 化 す る 方 法 で は 、 測 定 後 の 再 生 溶 液 に よ っ て ア ナ ラ イ ト を 解 離 さ せ る こ と が 難 し く 、 強 い 条 件 で 再 生 を 行 っ て し ま う と 、 ア ナ ラ イ ト だ け で な く リ ガ ン ド ま で も が 剥 が れ 落 ち る た め 、 セ ン サ ー チ ッ プ の 再 生 が 困 難 で あ っ た 。 ま た 、 タ ン パ ク 質 が リ ガ ン ド で あ る た め 、 セ ン サ ー チ ッ プ の 長 期 保 存 に よ り 、 ス パ イ ク タ ン パ ク 質 の 失 活 が 起 こ っ た 。 そ の た め 、 繰 り 返 し 連 続 し た 測 定 を 安 定 に 行 う こ と が 困 難 で あ り 、 そ の た め 、 タ ン パ ク 質 の 調 製 を 含 め 、 セ ン サ ー チ ッ プ 表 面 を そ の 都 度 作 り 直 す 必 要 が あ っ た

1 0_）

。

そ こ で 、 本 研 究 で は 、 リ ガ ン ド と ア ナ ラ イ ト の 関 係 を 逆

転 さ せ 、 安 定 で あ る φ

X 1 7 4

の 宿 主 で あ る 大 腸 菌

C

株 の レ セ

プ タ ー 糖 鎖 を 固 定 化 し た セ ン サ ー チ ッ プ を 調 製 し 、 フ ァ ー

ジ ス パ イ ク タ ン パ ク 質 を 流 し て 相 互 作 用 さ せ る 方 法 を 確 立

す る こ と を 目 的 と し た 。 レ セ プ タ ー 糖 鎖 は そ の 構 造 が 安 定

で あ る た め 再 現 性 よ く 測 定 が で き る と 考 え ら れ た 。 ま た 、

ア ナ ラ イ ト を 変 更 す れ ば 、 様 々 な ス パ イ ク タ ン パ ク 質 と レ

セ プ タ ー 糖 鎖 と の 相 互 作 用 の 解 析 お よ び 比 較 が 可 能 で あ る 。

さ ら に 、 多 量 体 を 形 成 し て い る ス パ イ ク タ ン パ ク 質 に お い

て も 、 多 量 体 の 状 態 で レ セ プ タ ー 糖 鎖 と の 相 互 作 用 す る 様

子 が 解 析 で き る の で は な い か と 考 え た 。 多 量 体 を 形 成 す る

タ ン パ ク 質 を リ ガ ン ド と し て 固 定 化 し た 場 合 、 多 量 体 と し

て 固 定 化 さ れ て い る か を 確 認 す る こ と が で き な い 。 ま た 、

固 定 化 に 成 功 し て も 、 測 定 を 重 ね る こ と で 、 多 量 体 が 崩 壊 し 、 安 定 し た 測 定 が で き な い と 考 え ら れ た 。 し か し 、

B I A C O R E

装 置 で ア ナ ラ イ ト と し て 多 量 体 を 添 加 す る 場 合 、

ア ナ ラ イ ト 分 子 は ラ ベ ル 化 や 固 定 化 な ど の 加 工 を 一 切 す る

必 要 が 無 く 、 そ の ま ま の 状 態 で 添 加 し 、 相 互 作 用 を 測 定 す

る こ と が で き る 。 し た が っ て 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 固 定 化 セ ン

サ ー チ ッ プ を 用 い る こ と で 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と 多 量 体 タ ン

パ ク 質 と の 相 互 作 用 解 析 を 行 え る と 考 え ら れ た 。

第 第 第

第

2

章 章 章 章 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 固 固 固 固 定 定 定 定 化 化 化 化 セ セ セ セ ン ン ン ン サ サ サ サ ー ー ー ー チ チ チ チ ッ ッ ッ ッ プ プ プ プ の の の の 調 調 調 調 製 製 製 製

大 腸 菌

C

株 の

d e O N

体 （

O , N -

脱 ア シ ル 化 し た

L P S

） に は 、

ア ミ ノ 基 が

2

つ 存 在 す る （

F i g u r e 2 - 1

） 。 こ の ア ミ ノ 基 を 利

用 し て 、 セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

に ア ミ ン カ ッ プ リ ン グ 法 を 用

い て

d e O N

体 を 固 定 化 す る 方 法 を 検 討 し た 。

F i g u r e 2 - 1 大 腸 菌 C 株 リ ポ 多 糖 d e O N 体 の 構 造

第 第 第

第

1

節 節 節 節 セ セ セ セ ン ン ン ン サ サ サ サ ー ー ー ー チ チ チ チ ッ ッ ッ ッ プ プ プ プ

C M 5

へ へ へ へ の の の の レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 の の の の 固 固 固 固 定 定 定 定 化 化 化 化

内 田 が 調 製 し た 大 腸 菌

C

株 の

d e O N

体

1 5_）

を

H B S - P

緩 衝

液 （

1 5 0 m M

塩 化 ナ ト リ ウ ム お よ び

0 . 0 0 5

％

Tw e e n 2 0

を 含 む

1 0 m M H E P E S

緩 衝 液

p H 7 . 4

） に 溶 か し て

1 0 0 µg / m l

に

調 製 し た 。 セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

の

F c 3

に

4 0 0 m M N-

エ チ ル

-N' -

（

3 -

ジ メ チ ル ア ミ ノ プ ロ ピ ル ） カ ル ボ ジ イ ミ ド （

E D C

）

/ 1 0 0 m M N-

ヒ ド ロ キ シ ス ク シ ン イ ミ ド （

N H S

） 混 合 溶 液 を

OOOO

OOOO OOOO

OOOO OOOOHHHH

OOOO

OOOOHHHH HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOOHHHH OOOOHHHH

HHHHOOOO

PPPP HHHHOOOO

OOOO OOOO^----

OOOO OOOO

HHHHOOOO OOOOHHHH

OOOO OOOOHHHH PPPP

OOOO OOOO OOOO^---- PPPP OOOO^---- OOOO HHHH3333NNNN⁺⁺⁺⁺ OOOO

PPPP OOOO

OOOO OOOO^---- PPPP OOOO^---- OOOO HHHH3333NNNN⁺⁺⁺⁺ OOOO

OOOO CCCC

OOOO OOOO^---- OOOO

OOOO OOOO

CCCC OOOO

OOOO^----

HHHHOOOO HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO

OOOO OOOO OOOO

OOOO

OOOOHHHHOOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO PPPP

HHHHOOOO OOOO OOOO^----

OOOOHHHH PPPP OOOO^---- HHHH2222NNNN OOOO HHHH2222NNNN

OOOO HHHHOOOO

OOOOHHHH HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO OOOOHHHH

OOOO OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO OOOO

HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

HHHHOOOO

KKKKDDDDOOOO KKKKDDDDOOOO

O O O

Ou u ut u t te t e e er r r r C C Co C o or o r re r e e e

I I I

In n n nn n ne n e er e r r r C C C Co o or o r re r e e e

GGGGaaaallll GGGGaaaallll GGGGllllcccc GGGGllllcccc

GGGGllllcccc

HHHHeeeepppp

HHHHeeeepppp HHHHeeeepppp

G G

G Gl l l lc c cN c N N* N * * *2 2 2 2 f

f f fr r r ro o om o m m m L L L

Li i i ip p pi p i id i d d d A A A A

OOOO

OOOO OOOO

OOOO OOOOHHHH

OOOO

OOOOHHHH HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOOHHHH OOOOHHHH

HHHHOOOO

PPPP HHHHOOOO

OOOO OOOO^----

OOOO OOOO

HHHHOOOO OOOOHHHH

OOOO OOOOHHHH PPPP

OOOO OOOO OOOO^---- PPPP OOOO^---- OOOO HHHH3333NNNN⁺⁺⁺⁺ OOOO

PPPP OOOO

OOOO OOOO^---- PPPP OOOO^---- OOOO HHHH3333NNNN⁺⁺⁺⁺ OOOO

OOOO CCCC

OOOO OOOO^---- OOOO

OOOO OOOO

CCCC OOOO

OOOO^----

HHHHOOOO HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO

OOOO OOOO OOOO

OOOO

OOOOHHHHOOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO PPPP

HHHHOOOO OOOO OOOO^----

OOOOHHHH PPPP OOOO^---- HHHH2222NNNN OOOO HHHH2222NNNN

OOOO HHHHOOOO

OOOOHHHH HHHHOOOO HHHHOOOO

OOOO

OOOOHHHH

HHHHOOOO OOOOHHHH

OOOO OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

OOOO OOOO

HHHHOOOO

HHHHOOOO OOOO

HHHHOOOO

KKKKDDDDOOOO KKKKDDDDOOOO

O O O

Ou u ut u t te t e e er r r r C C Co C o or o r re r e e e

I I I

In n n nn n ne n e er e r r r C C C Co o or o r re r e e e

GGGGaaaallll GGGGaaaallll GGGGllllcccc GGGGllllcccc

GGGGllllcccc

HHHHeeeepppp

HHHHeeeepppp HHHHeeeepppp

G G

G Gl l l lc c cN c N N* N * * *2 2 2 2 f

f f fr r r ro o om o m m m L L L

Li i i ip p pi p i id i d d d A A A A

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、

C M

デ キ ス ト ラ ン の カ ル ボ

キ シ 基 を

N H S

活 性 化 し た 。 そ し て

d e O N

体 の 溶 液 を

1 0

µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、

C M

デ キ ス ト ラ ン に 固 定 化 し

た 。 更 に 、

1 M

エ タ ノ ー ル ア ミ ン を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、 固 定 化 に 使 用 さ れ な か っ た 活 性 型

N H S

基 を ブ ロ

ッ キ ン グ し た 。 ま た 、

F c 1

に は

E D C / N H S

溶 液 を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、 そ の 後

1 M

エ タ ノ ー ル ア ミ ン を

1 0

µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し て ブ ロ ッ キ ン グ し 、 こ れ を リ フ

ァ レ ン ス セ ル と し た 。

第 第 第

第

2

節 節 節 節 結 結 結 結 果 果 果 果 お お お お よ よ よ よ び び び び 考 考 考 考 察 察 察 察

F i g u r e 2 - 2

に

F c 3

に

d e O N

体 を 固 定 化 し た 際 の セ ン サ ー グ

ラ ム を 示 し た 。 固 定 化 前 の レ ス ポ ン ス 値 は

1 6 , 1 0 4 . 0 R U

で

あ っ た の に 対 し 、 固 定 化 後 は

1 6 , 2 9 9 . 5 R U

で あ っ た 。 よ っ

て 、

1 9 5 . 5 R U

の

d e O N

体 が 結 合 し た こ と に な り 、

1 R U

＝

1

p g / m m²

で あ る か ら 、 こ れ は

1 9 5 . 5 p g / m m²

に 相 当 す る 。

d e O N

体 の 分 子 量 が

2 , 7 0 3

で あ る か ら 、 計 算 す る と

7 2 . 3 f m o l / m m²

の

d e O N

体 が 結 合 し た 計 算 に な る 。リ ガ ン ド の 固 定 化 量 は 、

マ ス ト ラ ン ス ポ ー ト リ ミ テ ー シ ョ ン （ 固 定 化 量 が 多 い こ と

に よ り 、 ア ナ ラ イ ト の 拡 散 が 妨 げ ら れ る 現 象 ） を 防 ぐ た め

に 、 以 下 の 式 で 求 め ら れ る 最 大 ・ 最 少 固 定 化 量 の 範 囲 内 に

す る こ と が 望 ま し い 。

最少固定化量（

RU

）＝

200×1/S

×（リガンドの分子量

/

アナライトの分子量）

最大固定化量 （

RU

） ＝

1000×1/S

× （リガンドの分子量

/

アナライトの分子量）

※S

：リガンドの結合部位数。

deON

の結合部位数は

1

上 記 の 式 か ら 求 め ら れ る 至 適 固 定 化 量 は

2 6 . 5 R U

～

1 3 3

R U

で あ る が 、 他 の フ ロ ー セ ル で も 固 定 化 を 検 討 し た 結 果 、

F c 3

が も っ と も 至 適 固 定 化 量 に 近 か っ た た め 、 以 後 こ の セ

ル を 実 験 に 用 い る こ と に し た 。

F i g u r e 2 - 2 C M 5 へ の レ セ プ タ ー 糖 鎖 の 固 定 化 セ ン サ ー グ ラ ム

14000 16000 18000 20000 22000 24000 26000 28000 30000 32000

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500

Tim e s

Response

RU

ブ ロ ッ キ ン グ

E D C / N H S

活 性 化

d e O N

体 固 定 化

第 第 第

第

3

章 章 章 章 φ φ φ φ

X 1 7 4

ス ス ス ス パ パ パ パ イ イ イ イ ク ク ク ク

G

タ タ タ タ ン ン ン ン パ パ パ パ ク ク ク ク 質 質 質 質 単 単 単 単 量 量 量 量 体 体 体 体 と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 析

解 解 析 析 解 析

ス パ イ ク

G

タ ン パ ク 質 は フ ァ ー ジ 粒 子 上 で

5

量 体 を 形 成 し て 存 在 し て い る

1 1_）

が 、 単 量 体 で も レ セ プ タ ー 糖 鎖 と の 相 互 作 用 が あ る こ と が 報 告 さ れ て い る

1 2_）

。 そ こ で ま ず 、 単 量 体 で 存 在 し て い る

N

末 端 ヒ ス チ ジ ン タ グ 融 合 ス パ イ ク

G

タ ン パ ク 質 （

H i s G

） に つ い て 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と の 相 互 作

用 を 検 討 す る こ と に し た 。

第 第 第

第

1

節 節 節 節

H i s G

の の の の 発 発 発 発 現 現 現 現 お お お お よ よ よ よ び び び び 精 精 精 精 製 製 製 製

H i s G

発 現 大 腸 菌

J M 1 0 9

株 を 、

5 0 µl / m l

の ア ン ピ シ リ ン ナ

ト リ ウ ム を 含 む

L B

液 体 培 地 に 植 菌 し 、

3 7

℃ で 振 盪 培 養 し

た 。 そ の 後

I P T G

を 添 加 し 、

3 7

℃ で 振 盪 培 養 し て タ ン パ ク

質 の 発 現 を 誘 導 し た 。 培 養 後 、 遠 心 し て 集 菌 し 、 破 砕 緩 衝

液 （

3 0 0 m M

塩 化 ナ ト リ ウ ム お よ び

1 0 m M

イ ミ ダ ゾ ー ル を

含 む

5 0 m M

リ ン 酸 緩 衝 生 理 食 塩 水

p H 8 . 0

） に 懸 濁 し て

- 3 0

℃ に 保 存 し た 。 こ の

H i s G

発 現 菌 株 を 氷 上 で 融 解 さ せ 、

超 音 波 照 射 に よ り 菌 体 を 破 砕 し た 。 こ の 溶 液 を 遠 心 分 離 し 、

得 た 上 清 を

N i - N TA

ア フ ィ ニ テ ィ ー ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー お

よ び 陽 イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で 精 製 を 行 い 、

S D S - PA G E

に よ り 目 的 の タ ン パ ク 質 を 確 認 し た 。 （

F i g u r e

3 - 1

）

第 第 第

第

2

節 節 節 節 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 と と と と

H i s G

と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 検 検 検 検 討 討 討 討

精 製 し た

H i s G

を

H B S - P

緩 衝 液 で

1 . 2 5

～

2 0 . 0 µM

に な る

よ う に 希 釈 し た 。 こ の 希 釈 し た 試 料 と 、 タ ン パ ク 質 を 含 ま

な い 対 照 緩 衝 液 と し て

H B S - P

緩 衝 液 を 、そ れ ぞ れ 第

2

章 で

示 し た 大 腸 菌

C

株 の

L P S d e O N

体 を 結 合 さ せ た 極 板 を 用 い

る

B I A C O R E

に 供 し 、 相 互 作 用 を 測 定 し た 。 諸 測 定 条 件 を

以 下 に 示 し た 。

R u n n i n g b u f f e r

：

H B S - P F l o w r a t e

：

2 0 µl / m i n Te m p e r a t u r e

：

2 5℃ B i n d i n g t i m e

：

1 2 0 s e c D i s s o c i a t i o n t i m e

：

6 0 0 s e c

R e g e n e r a t i o n s o l u t i o n

：

0 . 5

％

S D S R e g e n e r a t i o n t i m e

：

3 0 s e c

得 ら れ た

F c 3

の セ ン サ ー グ ラ ム か ら 、 リ フ ァ レ ン ス セ ル

の 信 号 を 差 し 引 い た 。 さ ら に 、 タ ン パ ク 質 を 含 ま な い 対 照

緩 衝 液 （ ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 の み を 流 し た 場 合 ） の 信 号 を 差

し 引 く 、 ダ ブ ル リ フ ァ レ ン ス 処 理 を 行 っ た 。 ダ ブ ル リ フ ァ

レ ン ス と は 、 リ ガ ン ド が 結 合 し て い る セ ル の セ ン サ ー グ ラ

ム か ら 、 リ フ ァ レ ン ス セ ル の 信 号 お よ び ア ナ ラ イ ト を 含 ん

で い な い 対 照 緩 衝 液 の 信 号 を 差 し 引 く こ と で あ る 。 こ れ に

よ り 、 非 特 異 的 な 吸 着 、 ベ ー ス ラ イ ン の ド リ フ ト 、 緩 衝 液 の 微 妙 な 違 い に よ る ベ ー ス ラ イ ン の 乱 れ（ バ ル ク 効 果 ） 、お よ び 機 械 的 ノ イ ズ が 除 か れ 、 特 異 的 結 合 の み を 観 察 す る こ と が で き る 。

ダ ブ ル リ フ ァ レ ン ス 処 理 を 行 っ た セ ン サ ー グ ラ ム を 解 析

ソ フ ト （

B I A E VA L U AT I O N 4 . 1

） で 非 線 形 解 析 し 、 各 定 数 を

算 出 し た 。 以 下 に そ の 公 式 を 示 し た 。

dR/dt

＝

k_aC

（

R_max

－

R_t

）－

k_dR_t

ka

：結合速度定数

kd

：解離速度定数

C

：アナライト（ファージタンパク質）濃度

R

：

RU

値

R_max

：固定化されたすべてのリガンドにアナライトが結合した際の

RU

値

B I A C O R E

で は そ れ ぞ れ の 濃 度 で 各 定 数 を 算 出 す る こ と

が 可 能 で あ る た め 、 濃 度 毎 に 算 出 し た 定 数 の 平 均 値 を 、

1

回 の 測 定 で 算 出 し た 定 数 と し た 。 さ ら に 、

2

～

3

回 測 定 を 行 い 、 各 測 定 で 算 出 し た 定 数 を 平 均 し た も の を 、 結 果 と し て 記 載 し た 。 標 準 偏 差 は 、 結 果 か ら の 各 測 定 で 算 出 し た 定 数

（ 濃 度 毎 で 算 出 し た 定 数 の 平 均 値 ） の ば ら つ き を 示 し た 。

第 第 第

第

3

節 節 節 節 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 の の の の 温 温 温 温 度 度 度 度 依 依 依 依 存 存 存 存 性 性 性 性 の の の の 検 検 検 検 討 討 討 討

相 互 作 用 を 測 定 す る 際 の フ ロ ー セ ル 内 の 温 度 を 変 化 さ せ 、

レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s G

の 相 互 作 用 の 温 度 依 存 性 検 討 し た 。

精 製 し た

H i s G

を

H B S - P

緩 衝 液 で

1 . 2 5

～

2 0 . 0 µM

に な る よ

う に 希 釈 し た 。 希 釈 し た 試 料 と 、 タ ン パ ク 質 を 含 ま な い 対

照 緩 衝 液 と し て

H B S - P

緩 衝 液 を そ れ ぞ れ

B I A C O R E

に 供 し 、

相 互 作 用 を 測 定 し た 。 諸 測 定 条 件 を 以 下 に 示 し た 。

R u n n i n g b u f f e r

：

H B S - P F l o w r a t e

：

2 0 µl / m i n

Te m p e r a t u r e

：

5

℃ ，

1 0

℃ ，

1 5

℃ ，

2 0

℃ ，

2 5

℃ ，

3 0℃ B i n d i n g t i m e

：

1 2 0 s e c

D i s s o c i a t i o n t i m e

：

2 4 0 s e c

R e g e n e r a t i o n s o l u t i o n

：

0 . 5

％

S D S R e g e n e r a t i o n t i m e

：

3 0 s e c

得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム に 対 し て ダ ブ ル リ フ ァ レ ン ス 処 理 を 行 い 、 解 析 ソ フ ト で 非 線 形 解 析 し 、 各 定 数 を 算 出 し た 。

第 第 第

第

4

節 節 節 節

結 結 結 結 果 果 果 果 お お お お よ よ よ よ び び び び 考 考 考 考 察 察 察 察

F i g u r e 3 - 2

に 得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム を 示 し た 。 セ ン サ

ー グ ラ ム よ り 算 出 さ れ た 定 数 を

Ta b l e 3 - 1

に 示 し た 。 解 離 定

数

KD

は 、

7 9 3±7 4 n M

（

2 5

℃ ） で あ っ た 。 よ っ て 、

H i s G

は リ ポ 多 糖 の 糖 鎖 部 分 と 相 互 作 用 す る こ と が 示 さ れ た 。

F i g u r e 3 - 3

に レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s G

と の 相 互 作 用 の

v a n ' t H o f f

プ ロ ッ ト を 示 し た 。

∆G⁰= R Tl nKD =∆H⁰-T∆S⁰

で あ

る か ら 、

∆G⁰= - 3 4 . 8 k J / m o l

と 求 め ら れ 、

v a n ' t H o f f

プ ロ ッ ト の 傾 き か ら 、

∆H⁰= - 3 1 . 1 k J / m o l

と 求 め ら れ た 。

∆G⁰=

∆H⁰-T∆S⁰

で あ る か ら 、

∆G⁰

の 値 は

∆H⁰

に 依 存 し て 変 動 す る

た め 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

H i s G

の 相 互 作 用 は 、 エ ン タ ル ピ

ー 駆 動 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 よ っ て 、

H i s G

と レ セ プ タ ー

糖 鎖 と の 相 互 作 用 は 、 発 熱 反 応 で あ る こ と が 示 さ れ た 。

F i g u r e 3 - 1 S D S - P A G E に よ っ て 確 認 さ れ た H i s G の バ ン ド

（kDa） 200 110 66 45

31

21

SDS-PAGE (12.5 ％)

（21 kDa、

加熱処理）

HisG単量体

F i g u r e 3 - 2 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と H i s G と の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

（ 2 5℃ ）

T a b l e 3 - 1 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と H i s G の セ ン サ ー グ ラ ム の 相 互 作 用 解 析 結 果

temp（℃） k_a（10⁴/Ms） k_d（1/10⁴s） K_A（10⁷/M） K_D（nM） 5 1.03±0.15 11.0±2.65 1.05±0.53 350±48 10 0.51±0.15 6.84±0.22 1.00±0.48 363±50 15 0.43±0.03 6.82±1.11 0.67±0.15 401±34 20 0.35±0.09 6.18±1.07 0.82±0.62 540±108 25 0.15±0.06 5.73±0.63 0.26±0.11 793±74 30 0.18±0.11 7.30±0.75 0.28±0.15 984±354

測 定 条 件

大 腸 菌 C 株 L P S の d e O N 体 を 固 定 化 し た セ ン サ ー チ ッ プ C M 5 に 1 . 2 5～ 2 0 . 0 µM の H i s G を 相 互 作 用 さ せ た 。 ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 H B S - P（ 1 5 0 m M 塩 化 ナ ト リ ウ ム お よ び 0 . 0 0 5％ T w e e n 2 0

-50 0 50 100 150 200 250 300

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000

Tim e s

Resp. Diff.

RU 2 0 . 0 µM

5 . 0 0 µM 1 0 . 0 µM

2 . 5 0 µM 1 . 2 5 µM

を 含 む 1 0 m M H E P E S 緩 衝 液 p H 8 . 0）、 温 度 5℃ 、 1 0℃ 、 1 5℃ 、 2 0℃ 、 2 5℃ 、 3 0℃ 、 流 速 2 0 µl / m i n、 結 合 時 間 1 2 0 秒 、 解 離 時 間 2 4 0 秒 、 再 生 溶 液 0 . 5％ S D S、 再 生 時 間 3 0 秒

F i g u r e 3 - 3 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と H i s G の 相 互 作 用 の v a n ' t H o f f プ ロ ッ ト

∆G⁰ =R Tl nK_D=∆H⁰-T∆S⁰

∆G⁰ = - 3 4 . 8 k J / m o l（ 2 5℃ ）

∆H⁰ = - 3 1 . 1 k J / m o l

T∆S⁰= 3 . 7 2 k J / m o l（ 2 5℃ ）

∆S⁰ = 1 2 . 5 J / K m o l（ 2 5℃ ）

y = 3.7405x + 1.5752

13.5 14 14.5 15

3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 1/T /K×1000

-lnK

D

第 第 第

第

4

章 章 章 章 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 と と と と φ φ φ φ

X 1 7 4

ス ス ス ス パ パ パ パ イ イ イ イ ク ク ク ク

G

タ タ タ タ ン ン ン ン パ パ パ パ ク ク ク ク 質 質 質 質 ５ ５ ５ ５ 量 体

量 体 量 体

量 体 と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 解 解 解 析 析 析 析

ス パ イ ク

G

タ ン パ ク 質 は フ ァ ー ジ 粒 子 上 で は 、

5

量 体 を 形 成 し て 存 在 し て い る

1 1 )

。 よ っ て 、 天 然 の 状 態 と 同 じ よ う に

5

量 体 を 形 成 し て い る 組 み 換 え タ ン パ ク 質 が 望 ま れ る と こ ろ で あ る 。 大 江 の 調 製 し た ヒ ス チ ジ ン タ グ を

C

末 端 に 持

つ

G

タ ン パ ク 質 （

c H i s G

） は 、 溶 液 中 で

5

量 体 を 形 成 す る

こ と が 分 か っ て い る

1 3_）

。 そ こ で 、

c H i s G

と レ セ プ タ ー 糖 鎖

と の 相 互 作 用 を 測 定 し て 、

5

量 体 を 作 ら な い

H i s G

と 比 較 す

る こ と を 試 み た 。

第 第

第 第

1

節 節 節 節 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 と と と と

c H i s G

と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 解 解 解 析 析 析 析 条 条 条 条 件 件 件 件 の の の の 検 討

検 検 討 討 検 討

ま ず 、 測 定 条 件 の 検 討 、 と く に フ ロ ー セ ル に 流 す タ ン パ

ク 質 の 濃 度 の 検 討 を 行 っ た 。

c H i s G

は

H i s G

と 同 様 に 、

N i - N TA

に よ る ア フ ィ ニ テ ィ ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー お よ び 陽

イ オ ン 交 換 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に よ っ て 精 製 を し た

（

F i g u r e 4 - 1

） 。 こ の

c H i s G

を 、

H B S - P

緩 衝 液 を 用 い て

2 0 . 0

～

1 . 2 5 µM

（

5

量 体 に 換 算 す る と

4 . 0 0

～

0 . 2 5 0 µM

） 、

1 . 0 0

～

6 2 . 5 µM

（

5

量 体 に 換 算 す る と

2 0 0

～

1 2 . 5 n M

） に 希 釈 し た 。

希 釈 し た 試 料 と 、 タ ン パ ク 質 を 含 ま な い 対 照 緩 衝 液 と し て

H B S - P

緩 衝 液 を そ れ ぞ れ

B I A C O R E

に 供 し 、 解 離 定 数

K_D

を

比 較 し て 、 相 互 作 用 解 析 条 件 を 検 討 し た 。

第 第

第 第

2

節 節 節 節 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 と と と と

c H i s G

の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 解 解 解 析 析 析 析

第

1

節 で 決 定 し た 条 件 に お い て 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と

c H i s G

と の 相 互 作 用 を 測 定 し た 。 諸 測 定 条 件 を 以 下 に 示 し た 。

R u n n i n g b u f f e r

：

H B S - P F l o w r a t e

：

2 0 µl / m i n Te m p e r a t u r e

：

2 5℃ B i n d i n g t i m e

：

7 2 0 s e c D i s s o c i a t i o n t i m e

：

6 0 0 s e c

R e g e n e r a t i o n s o l u t i o n

：

0 . 5

％

S D S R e g e n e r a t i o n t i m e

：

3 0 s e c

得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム に 対 し て ダ ブ ル リ フ ァ レ ン ス 処 理 を 行 い 、 解 析 ソ フ ト で 非 線 形 解 析 し 、 各 定 数 を 算 出 し た 。

第 第 第

第

3

節 節 節 節 結 結 結 結 果 果 果 果 お お お お よ よ よ よ び び び び 考 考 考 考 察 察 察 察

F i g u r e 4 - 2

に 得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム を 示 し た 。 ま た 、

F i g u r e 4 - 2

か ら 算 出 さ れ た 定 数 を

Ta b l e 4 - 1

に 示 し た 。

c H i s G

は 溶 液 中 で

5

量 体 を 形 成 し て い る た め 、

H i s G

と 同 じ タ ン パ

ク 質 濃 度 に 希 釈 し た が 、

5

量 体 と し て の

c H i s G

の 濃 度 は そ

の

5

分 の

1

で あ る 。 し か し 、

5

量 体 と し て 挙 動 す る た め 、

セ ン サ ー グ ラ ム の 結 合 相 で は

H i s G

よ り も 大 き な 信 号 が 検

出 さ れ る と 考 え ら れ た 。 実 際 に 測 定 し 、 ダ ブ ル リ フ ァ レ ン

ス 処 理 を 行 っ た セ ン サ ー グ ラ ム の

Rm a x

は

2 0 . 0 µM

で

6 7 6 0

R U

と 、 同 じ タ ン パ ク 質 濃 度 の

H i s G

と 比 較 し て

2 0

倍 以 上

大 き か っ た 。 よ っ て 、 多 量 体 を 形 成 し た 状 態 で セ ン サ ー チ ッ プ 上 の 糖 鎖 と 相 互 作 用 し て い る と 考 え ら れ た 。 し か し 、

算 出 さ れ た 解 離 定 数

K_D= 8 2 1 n M

（

2 5

℃ ） は 、 前 章 で 求 め ら

れ た

H i s G

の

K_D

と あ ま り 違 い が な か っ た 。 大 江 は 、

c H i s G

は

5

量 体 を 形 成 す る こ と で 、

H i s G

と 比 較 し て

L P S

に 対 し て

強 い 親 和 性 を 示 す こ と を 、 蛍 光 滴 定 に よ る 測 定 を 行 っ た 結 果 と し て 報 告 し て い る

1 3_）

。 し た が っ て 、 セ ン サ ー グ ラ ム 添 加 し た ア ナ ラ イ ト の 量 が 過 剰 で あ り 、 ア ナ ラ イ ト 溶 液 の 粘 性 が 高 い 、 あ る い は 、 セ ン サ ー チ ッ プ 上 の 糖 鎖 と の 立 体 障 害 の た め 、 ア ナ ラ イ ト の 拡 散 速 度 が 遅 く な っ た 結 果 、 マ ス ト ラ ン ス ポ ー ト リ ミ テ ー シ ョ ン が 起 こ り 、 相 互 作 用 が 正 確

に 反 映 さ れ て い な い と 考 え ら れ た 。 そ の た め 、

c H i s G

の 濃

度 を さ ら に 低 く し 、 最 高 で も

1 . 0 0 µM

（

5

量 体 に 換 算 す る と 、

2 0 0 n M

） に し て 測 定 を や り 直 し た 。 そ の 結 果 、

c H i s G

の 解

離 定 数

K_D

は

1 0 8±2 6 n M

と 算 出 さ れ た 。 こ れ は 前 章 で 求 め

ら れ た

H i s G

の

KD

値 と 比 べ て 約

1 / 7

で 、 つ ま り 親 和 性 が 約

7

倍 強 い 。 よ っ て 、

c H i s G

は

H i s G

よ り レ セ プ タ ー 糖 鎖 と の

相 互 作 用 が 強 い こ と を 明 ら か に す る こ と が で き た 。

（kDa）

cHisG 5量体

200 110 66 45

31

21

SDS-PAGE (12.5 ％) (非加熱)

F i g u r e 4 - 1 S D S - P A G E に よ る c H i s G の バ ン ド

F i g u r e 4 - 2 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と c H i s G の 相 互 作 用 セ ン サ ー グ ラ ム

-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900

0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800

Tim e s

Resp. Diff.

RU

2 0 0 n M

5 0 . 0 nM 1 0 0 nM

2 5 . 0 nM 1 2 . 5 nM

（110 kDa、 非加熱処理）

T a b l e 4 - 1 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と c H i s G の 相 互 作 用 測 定 セ ン サ ー グ ラ ム の 解 析 結 果

temp（℃） k_a（10⁴/Ms） k_d（1/10⁴s） K_A（10⁷/M） K_D（nM） 25 9.00±4.05 20.2±1.76 8.12±6.25 108±26

測 定 条 件

大 腸 菌 C 株 L P S の d e O N 体 を 固 定 化 し た セ ン サ ー チ ッ プ C M 5 に 1 2 . 5～ 2 0 0 n M の c H i s G を 相 互 作 用 さ せ た 。 ラ ン ニ ン グ 緩 衝 液 H B S - P（ 1 5 0 m M 塩 化 ナ ト リ ウ ム お よ び 0 . 0 0 5％ T w e e n 2 0 を 含 む 1 0 m M H E P E S 緩 衝 液 p H 8 . 0）、温 度 2 5℃ 、流 速 2 0 µl / m i n、 結 合 時 間 7 2 0 秒 、 解 離 時 間 6 0 0 秒 、 再 生 溶 液 0 . 5％ S D S、 再 生 時 間 3 0 秒

第 第 第

第

5

章 章 章 章 セ セ セ セ ン ン ン ン サ サ サ サ ー ー ー ー チ チ チ チ ッ ッ ッ ッ プ プ プ プ

C M 3

を を を を 用 用 用 用 い い い い た た た た ス ス ス ス パ パ パ パ イ イ イ イ ク ク ク ク

G

タ タ タ タ ン ン ン ン パ パ パ パ ク ク ク ク 質

質 質

質

5

量 量 量 量 体 体 体 体 と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 用 用 用 解 解 解 解 析 析 析 析

セ ン サ ー チ ッ プ

C M 5

は 、 表 面 に 存 在 す る カ ル ボ キ シ メ チ

ル デ キ ス ト ラ ン が 長 く 、 密 で あ る 。 そ の た め 、

5

量 体 を 組

み 、

1 1 0 k D a

と 大 き な

c H i s G

で は 、

C M

デ キ ス ト ラ ン に よ る

立 体 障 害 等 の 問 題 が 起 こ り 、

c H i s G

が 糖 鎖 に 近 づ く 際 の 妨

げ に な る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 、 セ ン サ ー チ ッ プ 表 面 を コ ー テ ィ ン グ し て い る

C M

デ キ ス ト ラ ン が 短 い セ ン サ ー チ ッ

プ

C M 3

を 用 い て 糖 鎖 を 固 定 し 、 そ こ に

c H i s G

を 相 互 作 用 さ

せ る な ら ば 、 マ ス ト ラ ン ス ポ ー ト リ ミ テ ー シ ョ ン が 軽 減 さ れ る と 考 え ら れ た 。

第 第

第 第

1

節 節 節 節 レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 固 固 固 固 定 定 定 定 化 化 化 化

C M 3

の の の の 調 調 調 調 製 製 製 製

d e O N

体 を

H B S - P

緩 衝 液 （

p H 7 . 4

） に 溶 か し て

1 m g / m l

に 調 製 し た 。 セ ン サ ー チ ッ プ

C M 3

の

F c 2

に

E D C / N H S

溶 液

を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、

C M

デ キ ス ト ラ ン の カ ル

ボ キ シ 基 を

N H S

活 性 化 し た 。 そ し て

d e O N

体 を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し 、

C M

デ キ ス ト ラ ン に 固 定 化 し た 。 更

に 、

1 M

エ タ ノ ー ル ア ミ ン を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流

し 、 固 定 化 に 使 用 さ れ な か っ た 活 性 型

N H S

基 を ブ ロ ッ キ ン

グ し た 。 ま た 、

F c 1

に は

E D C / N H S

溶 液 を

1 0 µl / m i n

の 流 速

で

7

分 間 流 し 、 そ の 後

1 M

エ タ ノ ー ル ア ミ ン を

1 0 µl / m i n

の 流 速 で

7

分 間 流 し て ブ ロ ッ キ ン グ し 、 こ れ を リ フ ァ レ ン ス セ ル と し た 。

第 第

第 第

2

節 節 節 節

C M 3

を を を を 用 用 用 用 い い い い た た た た レ レ レ レ セ セ セ セ プ プ プ プ タ タ タ タ ー ー ー ー 糖 糖 糖 糖 鎖 鎖 鎖 鎖 と と と と

c H i s G

と と と と の の の の 相 相 相 相 互 互 互 互 作 作 作 作 用 解 析

用 用 解 解 析 析 用 解 析

精 製 し た

c H i s G

を

H B S - P

緩 衝 液 （

p H 8 . 0

） で

1 5 . 6 n M

～

4 µM

に 希 釈 し た 。 こ の 希 釈 し た 試 料 と 、 タ ン パ ク 質 を 含 ま

な い 対 照 緩 衝 液 と し て 希 釈 に 用 い た

H B S - P

緩 衝 液（

p H 8 . 0

）

を

B I A C O R E

に 供 し て 相 互 作 用 測 定 を 行 っ た 。 諸 測 定 条 件

を 以 下 に 示 し た 。

R u n n i n g b u f f e r

：

H B S - P F l o w r a t e

：

2 0 µl / m i n Te m p e r a t u r e

：

2 5℃ B i n d i n g t i m e

：

7 2 0 s e c D i s s o c i a t i o n t i m e

：

6 0 0 s e c

R e g e n e r a t i o n s o l u t i o n

：

0 . 5

％

S D S R e g e n e r a t i o n t i m e

：

3 0 s e c

得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム に 対 し て ダ ブ ル リ フ ァ レ ン ス 処

理 を 行 い 、 解 析 ソ フ ト で 非 線 形 解 析 し 、 各 定 数 を 算 出 し た 。

第 第 第

第

3

節 節 節 節 結 結 結 結 果 果 果 果 お お お お よ よ よ よ び び び び 考 考 考 考 察 察 察 察

F i g u r e 5 - 1

に 得 ら れ た セ ン サ ー グ ラ ム を 示 し た 。 ま た 、

F i g u r e 5 - 1

か ら 算 出 さ れ た 定 数 を

Ta b l e 5 - 1

に 示 し た 。 そ の

結 果 、 解 離 定 数

K_D

は

7 . 6 0±1 . 2 7 n M

と 算 出 さ れ た 。 こ れ は

C M 5

極 板 に 糖 鎖 を 固 定 化 し て 、 そ こ に

c H i s G

を 相 互 作 用 さ

せ た 場 合 よ り も 約

1 5

倍 小 さ い 。 よ っ て 、 予 想 通 り 、 極 板 上 の

C M

デ キ ス ト ラ ン の 鎖 長 が 短 い た め に マ ス ト ラ ン ス ポ ー

ト リ ミ テ ー シ ョ ン の 軽 減 に 役 立 っ た と 考 え ら れ 、

C M 3

で 観

測 す る こ と に よ っ て 立 体 障 害 の 影 響 を 抑 え て 相 互 作 用 を 測 定 す る こ と が で き た と 考 え ら れ る 。 ま た 、 今 回 の 実 験 に よ

っ て 算 出 さ れ た

KD

は 、 第

3

章 で 算 出 さ れ た

H i s G

の

KD

よ

り も 約

1 0 4

倍 小 さ い 値 で あ る 。 よ っ て 、

G

タ ン パ ク 質 は

5

量 体 の 形 を と る こ と で 、 レ セ プ タ ー 糖 鎖 と の 親 和 性 が 非 常 に 強 く な る と い う こ と を 明 ら か に す る こ と が で き た 。 し か

し 、 前 章 で 行 っ た

C M 5

を 用 い た 測 定 と 比 べ 、 今 回 の

C M 3

を 用 い た 測 定 で は 、

c H i s G

が

5 0 0 µM

以 上 の 濃 度 に な る と 、

セ ン サ ー グ ラ ム の 結 合 相 の 信 号 強 度 が 濃 度 依 存 的 に 減 少 し 、 解 離 相 で も 、 解 離 が 始 ま っ た 直 後 の セ ン サ ー グ ラ ム の 信 号

強 度 の 上 昇 が 見 ら れ た （

F i g u r e 5 - 1 b

） 。 こ れ は

c H i s G

の レ セ

プ タ ー 糖 鎖 へ の 特 異 的 相 互 作 用 よ り も 、 リ フ ァ レ ン ス セ ル

F c 1

上 の カ ル ボ キ シ メ チ ル デ キ ス ト ラ ン マ ト リ ッ ク ス に 対

す る 非 特 異 的 な 吸 着 が 大 き く な っ た た め と 考 え ら れ る 。

c H i s G

が 吸 着 し た リ フ ァ レ ン ス セ ル

F c 1

は 、

0 . 5

％

S D S

溶 液

で 再 生 さ れ た 。 よ っ て 、

c H i s G

は 疎 水 的 吸 着 あ る い は デ キ ス ト ラ ン に も あ る 程 度 結 合 し や す い 可 能 性 が 高 い 。 し た が っ て 今 後 は 、 よ り 解 析 の 精 度 を 高 め る た め 、 非 特 異 的 吸 着 を 抑 え る 工 夫 が 必 要 で あ る 。

a )

b )

F i g u r e 7 - 1 C M 3 に よ る レ セ プ タ ー 糖 鎖 と c H i s G の セ ン サ ー グ ラ ム a）［ c H i s G］ = 3 1 . 3～ 2 5 0 n M b）［ c H i s G］ = 0 . 5 0～ 4 . 0 0 µM

-20 30 80 130 180

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Tim e s

Resp. Diff.

RU 1 2 5 n M

2 5 0 n M

6 2 . 5 n M 3 1 . 3 n M

-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160

-200 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600

Tim e s

Resp. Diff.

RU

1 . 0 0 µM 0 . 5 0 0 µM

2 . 0 0 µM 4 . 0 0 µM