微生物学実習 4日目

(1)

微生物学実習 4日目

[計p.13] 4日目

^HT

供試菌の同定細菌汚染検査

[実験IIIC]

生化学的性状試験3 (供試菌，TSI寒天培地による確認培養)

[実験IV] 薬剤感受性試験前培養

[実験IA]

グラム染色スケッチ [実験IB]

グラム染色のよる細菌の分

類◇顕微鏡の清掃・点検 [実験IIIC]

生化学的性状試験3 (フードスタンプ，TSI寒天

培地による確認培養)

[計p.8] 画線分離培養の結果の確認

前日までの確認：

フードスタンプで検査したセレウス菌，サルモネラ属細菌を普通寒天平板培地に画線分離培養した．

1. フードスタンプセレウス寒天からの画線分離

培養

2. フードスタンプサルモネラ寒天からの画線分離培養

TSI寒天培地の確認培養のサンプル

[計p.8&Rep.22] 分離培養の結果

◆フードスタンプから釣菌したサルモネラ属細菌およびセレウス菌の分離培養の結果をスケッチする[Rep.

22]．

用フードスタンプより ( 黒 ) 色のコロニー検体

セレウス菌フードスタンプより ( 赤 ) 色のコロニー検体培地の色・コロニーの形状・他の細菌の混入などが分かるように色鉛筆を使ってスケッチすること．

サルモネラ

記入例

重要部分のみ重要部分のみ拡大図

拡大図

[Rep.23] 分離培養・純培養の成功例寒天培地上のコロニー形態が均一で，他の菌の混入が認められない．

[Rep.23] 分離培養・純培養の失敗例異なる形状のコロニーが観察される．

[計p.8&Rep.22] グラム染色による確認

サルモネラ菌，

大腸菌・大腸菌群フードスタンプ分離サンプル

セレウス菌フードスタンプ分離サンプルグラム染色性

（陽性・陰性）

陰性陽性

細胞形態

（桿菌・球菌）

桿菌桿菌

細胞の大きさ

（縦 x 横μm）

3 x 1 μm 2 x 1 μm

芽胞（有・無）

なしあり

推定した細菌種

サルモネラ菌セレウス菌

◆画線分離培養した細菌をグラム染色し，グラム染色性・細胞形態・細菌の混在の有無を確認する（Rep.22）．

[計p.8&Rep.22]グラム染色による確認複数種類のコロニーが混在する場合、最も多くみられるタイプのコロニーを１つ選択する。

重要

[計p.8&Rep.22]グラム染色による確認

顕微鏡の清掃

2日目と同じように

清掃します。レンズペーパー

石油ベンジン

(2)

[実p.24] 薬剤感受性試験薬剤感受性試験の最も重要な目的は細菌感染症治療の際の適切な抗菌薬の選択である．

菌種や菌株の違いで、

薬剤感受性が異なる患者

分離培養原因菌

薬剤感受性試験

抗生物質名判定結果

○○ 有効ＸＸ有効

□□ 無効

[実p.24] 薬剤感受性試験

１．重篤な症状で緊急性が高い

臨床において必要な場合のみ実施される２．広域スペクトルの抗

生物質が効かない

[実p.24] 薬剤感受性試験ディスク法でグラム陽性菌を試験する

本実習で扱う方法

黄色ブドウ球菌

(薬剤感受性菌)

黄色ブドウ球菌

(薬剤耐性菌)

[実p.24] 薬剤感受性試験

薬剤感受性試験の方法と有効薬剤の選択方法の習得を目的とする．

抗生物質名判定結果

○○ 有効ＸＸ有効

□□ 無効本実習における目的

[実p.24] 薬剤感受性試験微生物を利用した抗生物質（化学療法剤）の評価方法として，殺菌作用及び静菌作用に基づいた「力価検定」と「感受性試験」がある

[実p.24] 薬剤感受性試験病原性細菌を扱うので，実習内容を十分に理解した上で実験を行うこと！

黄色ブドウ球菌

[実p.26] 黄色ブドウ球菌による感染症

黄色ブドウ球菌は、皮膚の化膿性疾患、骨髄炎、関節炎、肺炎、腹膜炎、敗血症などの原因となる。また、

エンテロトキシンやTSST-1などの毒素を産生するため、

食中毒やトキシックショック症候群、腸炎などの原因となる。

[計p.9] 薬剤感受性試験の前培養

供試菌 ◆2日目のグラム染色結果より，グラム陽性・球菌と同定され，また3日目のマンニット食塩寒天培地にてマンニット分解性であった2種類の供試菌（），

供試菌（）について普通ブイヨン液体培地に4

本ずつ植菌する（8人班では１人１本ずつ担当す

る）．

＊ビニールテープを用いて，培地に班名・試験者名を示し，『供試菌○』と明記すること．

訂正

(3)

[計p.9] 薬剤感受性試験の前培養

【実験IV】普通ブイヨン液体培地：「 8 」本配布物

グラム陽性・球菌

マンニット分解性ありの2種類の供試菌を4本ずつ

[計p.9] 薬剤感受性試験の前培養

白金耳を用いて、分離状態の良いコロニーを１つ釣菌する。

グラム陽性・球菌

マンニット分解性ありの2種類の供試菌 4本ずつ植菌

[計p.9&Rep.24] 薬剤感受性試験の前培養

◆培養する際に，班の中で培養操作についてお互いに評価する（Rep.24）．

白金耳を選んで火炎滅菌

[計p.9] 薬剤感受性試験の前培養アルミキャップ付き試験管は上方から持たない

横から持ちます

落とします危険です

[計p.9] 薬剤感受性試験の前培養

培地や試験管を持ったまま白金耳を火炎滅菌しない

もう慣れたし・・・

試験管を落としたり、菌液をこぼす恐れがあります

[計p.9] 液体培地への植菌の評価 1.

培養後、菌の増殖が認められること。

評価のポイント

明日，菌液が濁っていることを確認する．

濁っていれば，培養成功．

濁っていなければ，培養失敗．

[実p.20] 生化学的性状試験 3

TSI寒天培地を用いて，代表的な腸内細菌を同定する．

目的

RK

供試菌と，フードスタンプを用いて台所用品から採取した菌．

材料

[実p.20] 細菌と食中毒について食品を食べたり飲んだりすることで種々の原因により中毒を起こすことを食中毒といい，このうち細菌が原因となる食中毒を細菌性食中毒という．

おいしい

毎日飲んで学業優秀

○○乳業 2011.12.16

牛乳

毒素

(4)

生きた病原性細菌を含

む食品の摂取細菌毒素を含む食品の摂取

サルモネラ属細菌腸炎ビブリオカンピロバクターなど

黄色ブドウ球菌ボツリヌス菌など

[実p.20] 細菌と食中毒について

腸管毒素

[実p.20] 細菌と食中毒について

原因菌の検出・同定

細菌生食中毒が発生した場合の対応手順発生状況，原因食品などの情報収集

治療再発防止

[実p.20] 生化学的性状試験

基質

^代謝

○○菌

培地成分

ＸＸ菌

代謝産物

＋pH指示薬など

生化学的性状の違い＝代謝できる物質の違い

培地の色が変化する

培地の色が変化しない

[実p.20] 生化学的性状試験・細菌同定

•

フードスタンプから得られた細菌はサルモネラ属細菌(あるいは大腸菌・大腸菌群の細菌)であるか？他の菌の可能性はないのか？

•

純培養をする際に，目的の細菌を釣菌出来たか？他の菌が混ざることはなかったのか？

TSI培地を用いた生化学的性状試験により同定する．

[実p.20] 生化学的性状試験・細菌同定試料

供試菌A〜Hより，グラム染色結果からグラム陰性・桿菌と同定された細菌種4種類

実習生単離菌（フードスタンプから）

[実p.20] TSI寒天培地

主にサルモネラなどの腸内細菌の鑑別培地として用いられる．

TSI= Triple Sugar Iron（乳糖・白糖・ブドウ糖・クエン酸第二鉄）

硫黄(S)源：チオ硫酸ナトリウム pH指示薬：フェノールレッド

(マンニット食塩寒天培地を参照)

[実p.5 & Rep.26] 寒天培地の種類試験管を用いる培地として、斜面培地・高層培地・半斜面培地(半高層培地)があり、純培養・増菌培養・菌の性状テストなどに用いられる。

高層部は嫌気的

斜面

部は好気的

半高層培地

斜面部：好気的条件

高層部：嫌気的条件

[実p.21] TSI寒天培地への穿刺培養-1

純培養したコロニーの釣菌方法白金線

寒天培地実習室にてデモあり！

1.火炎滅菌した白金線を菌の増殖していない部分に当てて冷やす．

2.白金線の先端で釣菌

する．

(5)

[実p.21] TSI寒天培地への穿刺培養-2

TSI寒天培地への植菌方法

1. 培地の高層部に深く穿刺する．

2. 白金線を高層上部まで引き上げる．

3. 斜面部に塗布する．

4. 37℃で培養する．

白金線

実習室にてデモあり！

提出時はキャップを閉めた状態にする(後で教員が調整する)。

[実p.21] 穿刺培養の評価

1.

指示された方法で穿刺培養されている。

2.

目的とする細菌が増殖しており、その他の微生物の混入が認められない。

評価のポイント

[実p.21] コロニーの選択条件

1.  寒天培地上のコロニー形態が均一で，他の菌の混入が認められない．

2.  顕微鏡観察でも他の菌の混入が認められない．

3.

コロニーの分離状態が良く，１つのコロニーのみを正確に釣菌できる．

異なる細菌が混在する状態では、

正確な実験結果が得られない。

確実に１つのコロニーを釣菌し、

検査菌を純培養する。

[計p.8] TSI培地を用いた確認培養

検体

◆サルモネラ属細菌あるいは大腸菌・大腸菌群用フードスタンプから釣菌し，実験IIIBで「分離培養」した検体を各自TSI培地 1本に植菌する．

＊ビニールテープを用いて，培地に班名・試験者名を示し，『検体』と書くこと．

供試菌 ◆2日目のグラム染色結果より，グラム陰性・桿菌と同定された 4種類の供試菌（），供試菌（），供試菌

（），供試菌（）についてTSI培地に2本ずつ植菌する（8人班では１人１本ずつ担当する）．

＊ビニールテープを用いて，培地に班名を示し，『○班，供試菌

○』と明記すること．

[計p.8&Rep.24] TSI培地への穿刺培養

◆培養する際に，班の中で培養操作についてお互いに評価する（Rep.24）．

白金耳を選んで火炎滅菌

[計p.8] TSI培地を用いた確認培養

配布物：

【実験IV】TSI培地：「１６」本

フードスタンプからの検体 (各自1本)

検体供試菌

供試菌 ( )

各班（4種類ｘ2本ずつ）

供試菌 ( )

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