前立腺癌における新規アンドロゲン応答遺伝子
G3BP2
の同定及び機能解析（要約）日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系泌尿器科学専攻
芦苅 大作
2014
年指導教員 髙橋 悟
【背景】
前立腺癌は近年の食生活の欧米化や高齢化社会の到来などにより患者数の急速 な増加傾向などを受け、患者自身の認識も高まり、今や医療上の大きな問題と なっている。
前立腺癌細胞においてアンドロゲン受容体（AR）は重要な役割を果たしている。
アンドロゲン（テストステロン）が標的臓器である前立腺細胞内に取り込まれ る と 、 5 α 還 元 酵 素 の 働 き に よ っ て ジ ヒ ド ロ テ ス ト ス テ ロ ン
（dihydrotestosterone：DHT）に代謝される。DHT は標的細胞内の AR と結 合して複合体を形成する。このようにDHTがリガンドとして核内受容体である AR と複合体を形成し、核内に移行するとアンドロゲン応答配列（androgen response element : ARE）に結合して、他の転写活性化因子とともに転写活性 を促進、mRNA及び蛋白の発現を介してアンドロゲン作用を現す。アンドロゲ ン応答遺伝子の中には過剰発現することにより、anti-apoptosisや細胞増殖に働 き前立腺癌の発症や進展を促すものがある1-4 。そのためARを阻害する抗アン ドロゲン療法は前立腺癌に対する確立された治療法の一つであるが、しばしば 治療中に癌が再燃しアンドロゲン非依存的に増殖する治療抵抗性の獲得が臨床 上の大きな課題となっている5-6 。
そのため近年では前立腺癌の発症及び進展に重要な役割を果たしているアンド ロゲンの標的遺伝子に着目した研究が盛んに行われている 7-10 。東京大学大学 院医学系研究科抗加齢医学講座では AR 陽性前立腺癌細胞株を用いて、クロマ チン免疫沈降法ChIP assay（Chromatin immunoprecipitation）にゲノムタイ リングアレイを組み合わせた ChIP-chip 法や、次世代シークエンサーによるシ ークエンスを組み合わせたChIP-sequence法によりゲノムワイドにAR結合領 域を含むAndrogen Receptor Binding Sites（ARBSs）を同定した11-12 。
【目的】
上記の方法により同定された新規の AR 標的遺伝子群の中から我々は G3BP2
（Ras GTPase activating protein (SH3 domain) binding protein2）に着目した。
本研究では前立腺癌細胞における G3BP2 のアンドロゲン応答性の検討及び細 胞内での機能解析を行い検討した。
【結果】
Ⅰ アンドロゲン応答遺伝子G3BP2の同定
AR陽性ヒト前立腺癌細胞株 LNCaP細胞を用いてゲノムワイドにアンドロ ゲン応答遺伝子を検索した。ChIP-sequence法により G3BP2 の TSS近傍 にリガンド刺激によって多くのARの結合が認められる領域を同定した（図 1上）。また、AR ChIP assayによりリガンド付加での有意な結合の増加 を確認できた（図 1下）。
Ⅱ G3BP2 AREの同定及びアンドロゲン応答性の検討
次に、実際にこのARBS内に認められる ARE を介した結合が起きているの か、またこの ARの結合がアンドロゲン応答性に重要かどうかを解析した。
まず初めに Luciferase vectorに G3BP2 ARBS及び Promoter/ Enhancer 領域をinsertとしてG3BP2 promoter-Luc constructを作成し、さらにARE 候補領域にmutationを入れた G3BP2 mutation-Luc constructを作成した。
Luciferase assayにて Vehicle 処理及びリガンド処理（DHT 100 nM）での 転写活性化を評価したところ、Vehicle 処理に比べリガンド処理のもので有 意 な リ ガ ン ド 依 存 的 な 転 写 活 性 化 を 認 め た 。G3BP2 mutation-Luc
constructを用いて同様にして検討したところ、リガンド依存的な転写活性
化はARE 候補領域に mutationを入れることにより消失した（図 2, 3）。
また、Electrophoresis Mobility Shift Assay（EMSA）にてこの ARE候補
配列と蛋白の結合を解析したところ、リガンド刺激でより多くの蛋白質と の結合が認められ、mutationを入れた配列ではこの結合の消失を確認した
（図4 左）。さらに、抗 AR抗体と incubationさせることにより AR/ARE の結合が抗 AR 抗体濃度及び incubation 時間に相関して減弱することを確 認しARが直接 DNA配列と結合していることが示唆された（図 4 右）。以
上よりG3BP2 TSS 近傍の ARE候補領域に ARが結合し転写活性化に重要
な役割を担っていることが確認できた。
Ⅲ G3BP2のアンドロゲン応答性の検討
qRT-PCR を用いて mRNA レベルでのアンドロゲン応答性を検討した。
Vehicle処理に比べリガンド処理（DHT 100 nM）ではリガンド及び時間依
存 的 に 有 意 な 増 加 を 認 め （ 図 5 左 ） 、 そ の 増 加 は 抗 ア ン ド ロ ゲ ン 剤
（Bicalutamide）を用いることにより消失した（図5右）。また Western Blot 法によりタンパク質レベルでもリガンド依存的な増加を確認し（図 6 上）
さらに蛍光免疫染色によりリガンド依存的なタンパク質の増加は、細胞内 において細胞質有意な局在で高発現していることが認められた（図6 下）。
以上より G3BP2 は mRNA レベル、タンパク質レベルでアンドロゲンによ
り制御される標的遺伝子であることが示された。
【考察】
Ⅰ ChIP-chip法及びChIP-sequence法による新規アンドロゲン応答遺伝子の 同定
本研究では東京大学大学院医学系研究科抗加齢医学講座の高山らが ChIP-chip 法及び ChIP-sequence法を用いてゲノムワイドに ARE を解析した結果を引用 している。今回G3BP2 TSS近傍に1つのAR結合部位を同定し、これは新規 のAR結合部位であった。その部位に対するChIP assayではARの結合が濃縮
して確認され精度の高い検出ができていることが見出された。また、同定した AR結合部位へのARの結合により直接的なアンドロゲンによる転写制御を受け、
アンドロゲン応答性にmRNA及びタンパク質レベルでの発現増加が認められ新 規アンドロゲン応答遺伝子の発見へと至った。
今後ますますChIP-chip法及びChIP-sequence法が核内受容体ならびに転写因 子の機能解析に応用されていくことが期待される。
Ⅱ G3BP2の分子機能
本研究によりG3BP2 がアンドロゲンによる制御を受けていることを見出した。
G3BP2はRas GAPにSH3 domainを介して結合することが知られている。ま た、乳癌細胞に過剰発現しているとの報告もあり、近年では癌関連遺伝子とし ても注目されている 13-18 。G3BP2 が何らかのシグナル伝達経路に関与するこ とで前立腺癌細胞へ及ぼす影響のさらなる研究が期待される。
Ⅲ 今後の研究の展望
今回、G3BP2が前立腺癌細胞においてアンドロゲン応答性に発現増加すること
を初めて報告した。しかし、実際にどのようなシグナル伝達経路に関与し、ど のような機能を持っているかは未だに解明されていない点も多く今後の研究課 題と言える。
【図・図説】
図
図 1 ア ン ド ロロ ゲ ン 応 答 遺 伝 子 G3BP2 の 同 定定
（ 上 段 ）UCSC genome browser（hg18） 上 で の G3BP2 の 位 置 。 ChIP-sequence 法により G3BP2 TSS 近傍にリガンド処理により AR の結 合の増加が認められ 1 つの ARBS が同定された。（下段）LNCaP 細胞に Vehicleもしくは DHT (10 nM )処理を行い AR抗体により ChIP assayを 行った。濃縮度はqRT-PCRにより定量化しinputに対する濃縮率を示した。
図
図 22 GG33BBPP22 pprroommootteerr,, mmuuttaattiioonn--LLuucc ccoonnssttrruucctt のの 作作 製製
（上段）ARBSを含むG3BP2 enhancer/promoter領域をinsertしたG3BP2 promoter-Lucを作製。さらに ARBS内に認められた 1つの ARE候補領域 に2 カ所の mutationを入れた G3BP2 mutation-Lucを作製した。（下段）
公共データベースで公表されているARE consensus 配列。
図
図 33 G3BP2 mmuutaatioonn--Luucc の 転 写 活 性 化 能 の 消消 失失
LNCaP 細 胞 に 図 2 で 作 製 し た G3BP2 promoter-Luc 及 び G3BP2 mutation-Luc constructをそれぞれtransfectionしVehicle及びDHT (100 nM)処理し転写活性化を検討した。pGL3 vector-Luc は negative control として使用した。
図
図 44 GG33BBPP22 AARREE のの 同同 定定
（左図）Vehicle 及びDHT (100 nM)処理 48時間の LNCaP細胞から核内 タンパク質の分離抽出を行い、それぞれARE, ARE mutation オリゴ核酸と 室温で15分間 incubation しGel shift assay を施行した。（右図）リガン
ド処理LNCaP細胞から抽出した核内タンパク質とオリゴ核酸に加え抗AR
抗体の濃度をそれぞれ 4, 10 (µg)及び incubation時間を 15, 30分間として 調整し施行した。
図
図 55 mmRRNNAA レレ ベベ ルル でで のの リリ ガガ ンン ドド 応応 答答 性性 発発 現現 定定 量量 解解 析析
（左図）LNCaP細胞に Vehicle 及びDHT (100 nM)処理し、処理後各時間 での mRNA レベルの発現を qRT-PCR を用いて定量化した。Vehicle 処理 に対するリガンド処理での発現増加率で示した。（右図）Vehicle 処理及び DHT (100 nM)処 理 単 独 、 さ ら に DHT 処 理 に 抗 ア ン ド ロ ゲ ン 剤 Bicalutamide付加（それぞれ 1 µM, 5 µM）処理し 24時間後に定量解析を 施行した。
図
図 66 タ ンン パ ク 質 レレ ベ ルル でで のの リ ガ ンン ド 応 答 性 発 現 解解 析析
（上図）LNCaP細胞に Vehicle 及びリガンド処理 0, 24, 48時間後にタンパ ク質を回収し whole cell lysates 30 (µg)で Western Blot 法による発現解析 を行った。（下図） LNCaP 細胞を用いて同様にしてリガンド処理し蛍光 免疫染色を施行した。G3BP2 特異抗体により反応させ蛍光に標識された 2 次抗体を用いて局在を示した。DAPIにより核染色を行った。
【引用文献】
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