小 脳 の 酵 素 組 織 化 学
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(2) 666. 徳. 永. 五. 輪. れ な け れ ば な らな い こ と を示 す もの で あ る.. 雄. α‑GPDH;. こ こ に酵 素 組織 化 学 に お け る 固 定 の 問 題 を め ぐつ. 0.1M;α‑グ. て,諸 種 の 条 件 を 実 験 的 に設 定 して し らべ た の で 報. 0.1M;燐. 告 す る.. Nitro‑BT水. リ セ ロ 燐 酸 ナ ト リウ ム 水 溶 液: 酸 緩 衝 液(PH;. MDア. Ⅱ 実 験材料並 びに方法 実 験 材 料 と して は,体 重200g前 ク ネ ズ ミ(雌 雄)を. 後 の健 康 ダイ コ. 37℃. 間 の剖 検 屍 体 人. や か に ドライ ア イ スで 凍 結 処 理 し た後, ‑20℃. ン(10%,中 後,冷. London)で. ng. 間)漬. SDH,. けた. の 組 織 化 学 的 検 出 法 はNachlas, man氏. 法8)9)24)25)を. amin. K3,. と 略 す)を. び に α‑GPDHの. intermediatorと. 2methyl‑1,. and. selig‑. 多 少 変 え て 用 い た が,. 必 要 と し な いSDH,並 の 反 応 液 に は,. れ ら. Walker. し,そ. .必. 照 実 験 も 行 つ た.. dehydrogenase"反. 要 に応 じ. の量を. (cf:"nothi. 応15)26)). の実 験 条 件 は Ⅲ 節 で 述 べ る.. フ ォ ル マ リ ン 固 定,非. 固 定 両 切 片 に お い て,形. 分 布 と,. Nitro‑BTの. 着 性 と の 関 係 を し ら べ る た め に, (1961)の BT. 方 法 を 用 い た.す. O.1mg/mlを. 4)に. 検 出のため. し てmenadione(Vit. 短 時 間(10〜30分. 下MD. 0.1M;ア. 間)更. 組成 は 次の. tro‑BTを. 組 織 へ の吸. Pearse. and Hess27). 間)漬. 酸 緩 衝 液(PH; し た 後,緩. に15〜30分. 7.. 衝 液 で数 回. 間 水 洗 し,そ. ス コル ビ ン 酸 を 含 ん だ0.12M;炭. ナ ト リ ウ ム 液 に2〜3分. 成. な わ ち 切 片 を 先 ずNitro‑. 含 む0.1M;燐. 洗 い(5〜10分. 添 加 す る こ と を 原 則 と し た.. そ れ ぞ れ の 反 応 液(滲 漬 液)1mlの. エルバノ. 応 液 の 中 か ら基 質 の み を 除 き,そ. て も し らべ た が,そ. NADを. 4‑naphthaoquinone;以. 洗 後. 核 の 後 染 色 を施 した .. さ れ たformazanの. LDHと. オ ル マ リンに. ま た,反 応 抑 制 剤 の 酵 素 活 性 に 及 ぼ す 影 響 に つ い. 切 片 を 作製 して 載 物 ガ ラス に 貼 附 した. α‑GPDH,. 記 反 応 液 に,. 10%フ. 間 固 定 し て 反 応 を 止 め,水. 緩 衝 液 で 補 つ て,対. 厚 さ10. の 冷 フ ォル マ リ. 性)に 所 定 時 間(10〜15時. 間 滲 漬 し た 後,. † ま た は グ リセ リ ンで 封 入 した. な お,反. のク. 却 した 蒸 溜 水 で 洗 い,そ の 後 ク リオ ス タ ッ ト. 被検酵 素は. に て30分. Kernechtrotで. 〜20μ の 切 片 を 作製 し,載 物 ガ ラス に 貼 附 し た. 固 定 切 片 は,材 料 を 先 ず0〜4℃. 0.05ml 0.25ml. て 約10分. り 出 した材 料 を 出 来 るだ け す み. SLEE,. 0 .1ml. セ ト ン 溶 液(4mg/ml):. ール. リオ ス タ ッ ト(Pearse:. 0 .5ml. 載 物 ガ ラ ス に 貼 附 し た 組 織 切 片 を,上. 脳 の 小 脳 小 塊 を 用 い た. 非 固 定 切 片 は,取. 7.4):. 溶 液(5mg/ml):. 蒸 溜 水:. 断頭 後 直 ち に取 り出 した小 脳 を. 用 い,他 に ネ コ,及 び死 後2〜12時. 0 .1ml. 間 漬 け て,非. の後 酸 ナ. 酵 素 的 にNi. 還 元 さ せ た.. 如 くで あ る.. Ⅲ. LDH; 0.5M;乳. 酸 ナ トウ ム 水 溶 液:. 0.1M:燐. 酸 緩 衝 液(pH;. Nitro‑BT*水 0.1M;塩. 0.2 7.4):. (イ). 0.1ml. ⅰ ) LDH;顆. 化 マ グ ネ シ ウ ム 水 溶 液:. NAD**:少. ダ イ コ ク ネズ ミ小 脳 の 所 見. ml. 0.4ml. 溶 液(5mg/ml):. 0.1ml. 量. mazan顆. ハ ク 酸 ナ ト リ ウ ム 水 溶 液:. 0.5ml. 0.1M;燐. 酸 緩 衝 液(pH;. 0.4ml. Nitro‑BT水 MD***ア. ***. cerebellosi"に 相 当 子層 に はfor. 粒 は び ま ん 性 に 存 在 し,反 応 は顆 粒 層 よ り. に 強 度 〜 中 等度 の 活 性 を 示 す.こ れ に 反 し白質 に は. 0.1M;コ. *. 粒層 の"glomeruli. や や 弱 い 印象 を う け る. P‑細 胞 は 核 を 除 いて 細 胞体. 0.2ml. SDH;. **. 新 鮮 凍 結 ク リオ ス タ ッ ト切 片;(表1). して 最 も強 い青 色 の反 応 が見 られ,分. (3〜0.5mg). 蒸 溜 水:. 実験 内容並 びに結果. 7.4):. 溶 液(5mg/ml): セ ト ン 溶 液(4mg/ml):. Nitro. Blue. β‑Nicotinamide menadione:. Tetrazolium;和 Adenine Vitamin. ⅱ ) SDH;全. 体 と してLDH反. 応 像 に似 て お り,. 0.05ml. 顆 粒 層 に最 も強 く,つ い でP‑細. 0.05ml. で 活 性 が 認 め られ,白 質 に は ほ とん ど証 明 され ない. 光 純 薬(大 Dinucleotide; K3;半. ほ とん ど反 応 は 証 明 さ れ な い(図1).. 胞 層,分. 子 層 の順. 阪)製 SIGMA. (U. 井 化 学 薬 品(京. 都)製. . S. A.)製. †三光 純薬(東 京)製 成 分;ポ. リ ビ ニー ル ア ル コ ー ル. こ れ を よ く 混 和 し そ れ に1/2容. 1容. 0.14M;. NaCl加0.01M;燐. 酸 緩衝液. の 最 純 グ リ セ リ ン を 加 え 混 和 精 製 し た も の.. (pH;. 4容 6〜7).
(3) 小. 脳. の 酵. 素. 組. 織. 化. 学. 667. 表1. (+:添. 加,. ‑:添. 加 せ ず,. 5:反. 応 強,. 3:中,. 0:反. 応 な し). 応 が 強 く,分 子 層 で は や や 弱 い.そ. (図2).. ⅲ ) α‑GYDH;顆 SDHに. 1:弱,. 位層,分. 度 の 反 応 が 認 め られ る(図5,. 子 層 の反 応 はLDH,. ほぼ 同 じで あ るが, P‑細 胞 層 に はformazan. の形 成 が ほ と ん ど な く,あ た か も顆 粒‑,分. して 白質 に も軽. 6).. (但 し固 定 時 間 の 比較 的 長 い 標 本 に お い て は,. 子‑両. incubation直. 後 で は 顆 粒 層, P‑細 胞 に てformazan. 層 の 間 に空 隙 が あ る様 な 像 を示 す.白 質 に は活 性 は. 色 素 の鮮 や か な 色 調 が認 め られ ず,む. 証 明 され な い(図3,. 反 応 の 方 が 強 く見 え る場 合 が あ る.し か しそ の 場 合. 4).. しろ分 子 層 の. 対 照 切 片;(表1). で も標 本 を 放 置 して お け ば,時 間 の 経 過 に従 つ てP‑. LDH検. 細 胞 及 び顆 粒 層 に お け るtetrazolium塩. 出 の た め の反 応 液 か ら 基 質 の み を 除 い た. 場 合(NADは. 添 加)わ ず か に 淡 紫 色 の反 応 が認 め ら. れ るが,分 子層, P‑細 胞 層,顆 粒 層 の各 層 の反 応 の. れ た.. 非 固 定 切 片 のP‑細. 15)*) α‑GPDH検. 出の た め の 反 応 液 か ら 基 質 の. みを 除 い た場 合(MDは の"nothing. 添 加)の. dehydrogenase". 反 応 は 上 記LDH. (NADの. 存 在)の. の還 元が更. 々 に色 彩 が 強 まつ て くる傾 向が み ら. こ こで 問 題 と な る こ とは,緒 言 で既 述 した 如 く,. 程 度 に大 差 は な か つ た. ("nothing dehydrogenase". SDH,. に進 行 して,徐. 場. 合 よ りや や 強 く現 わ れ た が,各 層 間 の差 は ほ と ん ど み られ な か つ た.. 胞 層 に お い て, α‑GPDHの. 反. 応 が ほ と ん ど 認 め られ な い の に反 し,固 定 切 片 で は反 応 が 認 め られ, formazan形 む し ろP‑細. 成は他の部 よりも. 胞 に て 強 度 で あ り,ま た 非 固 定 切 片 で. ほ とん ど陰 性 で あ つ た 白質 に も,固 定 切 片 で は反 応 が み られ た と い う こ とで あ る.更 に,固 定 切 片 に お け る"nothing. dehydrogenase"反. 応 は, NADの. 存. (ロ). フ ォル マ リン固 定 切 片;(表1). 在 液 で は ほ と ん ど 認 め られ な い が, MDを. SDH,. αGPDH,. もに 反 応 は 全 般 に 減 弱. に は 反 応 が 出現 す る.こ の 場 合 非 固定 切 片 に お け る. 反 応 の 減 弱 の 度 合 は,他 の. 所 見 と異 な る点 は, P‑細 胞 の 反 応 が分 子 層,顆 粒 層. LDHと. され る.し か しLDHの. 2者 に くらべ て 少 な い よ うで あ る. LDH,. SDH,. * Zimmermann でincubateし. α‑GPDHと and. の反 応 に比 較 して,軽 度 で は あ るが よ り強 い 傾 向 を. もP‑細 胞,顆. Pearse. (1959)は. ,. た 場 合 に も ア ル カ リ性pHレ. 粒層 に 反. DH"と. 使 用 し な い 反 応 に お い て も,滲. い う表 現 に 総 括 す る .. 示 す こ とで あ る.. NAD (NADP)依 存 性 脱 水 素 酵 素 の 証 明 に 際 し,基 質を加 えない ベ ル に て 陽 性 反 応 を み と め,こ れ はNAD (NADP)の 還元 に非. 酵 素 的 過 程 が あ る こ と に よ る も の で あ る と み な し て,こ 本 稿 で はNADを. 含む場合. の"nothing. DH". (Racker26))と. い う 言 葉 を 導 入 し た.. 漬 液 か ら 基 質 の み を 除 い た 場 合 の 反 応 を す べ て"nothing.
(4) 668. 徳. 永. な お ヒ ト,ネ コ の小 脳 の 非 固 定,固 定 両 切片 に お い て も,ダ イ コ ク ネ ズ ミの 場 合 と同 様 の結 果 を 得 た . 固 定,非. 固 定 切 片 の間 に 上述 の 様 な 矛 盾 す る所 見. を 得 た の で,そ. れ を 解 明 す る た め に 次 の 様 な 諸種 の. 条 件 を 設 定 して し らべ た. 実 験1:フ. 4,. の各 々 に に つ い. 6及 び8時 間 の 固 定. を 施 し,そ の 後 作 製 した 切 片 に つ い て α‑DPDH, SDH,. LDHを. 雄. この 場 合 に も固 定 時 間 を種 々変 え て(5分 分 間 及 び3,. 6,. 10時 間)各. 問, 20. 々の 反 応 態 度 を 比 較 し. た.固 定 後 の 切 片 は,反 応 液 に 滲 漬 す る前 に5〜15 分 間 水 洗 した.. い差 は な か った.し か し前 述 の,切 片 作 製 前 に組 織 塊 を 固 定 した 場 合 と は異 な り, α‑グリ セ ロ 燐 酸 ナ. ⅰ ) まず ほ ぼ 同 一 大 の 小 脳 塊4個 フ ォル マ リ ンで2,. 輪. 反 応 は 全 般 に 抑 制 され る が,固 定 時 間 に よ る著 し. ォル マ リン固 定 切 片 に お け る 反応 の,. 固 定 時 問 の 長 さ に よ る影 響.. て,冷. 五. 検 索 した .. トリウ ム を 基 質 と し た 時 のP‑細. 胞 の 反 応 は,特 に. 強 くは な くて 軽 度 で あ り, 10時 間 固 定 の 切 片 に お い て さえ,分. 子層 や 顆 粒層 に比 してP‑細. 胞 層 の反応. は 弱 い.こ の 点 は非 固 定 切 片 に お け る α‑GPDHの. この 場 合,固 定 時 間 の 長 さ に よ る フ ォル マ リンの. 反 応 態 度 に類 似 して は い る が,し か し非 固定 切 片 に. 組 織 内 浸 透 度 に 関連 して,反 応 態 度 の 相 違 が うか が. お け る よ うにP‑細. わ れ た.す な わ ち,フ. こ と は な い.す な わ ち この 固 定 法 で は,非 固定 切片. ォル マ リン の浸 透 に 伴 い,そ. の 部 分 に 反応 の 低 下 が み られ た が,そ. の 部 のP‑細. 胞 層 が 空 隙 と して 見 え るよ うな. に くらべ ると 反 応 が 切 片全 体 に一 様 に現 わ れ る傾 向. 胞 はむ しろ 強 く現 わ れ て くる.特 に α‑グ リセ ロ燐. を 示 した.従 つ て 実 験1の 結 果 と 比 較 して,固 定 を. 酸 ナ トリウ ム を 基 質 と した場 合 に は,同 一 標 本 に お. 切 片 作 製 前 に 行 うか,後 に 行 うか に よ つ て 組 織 の. い て フ ォル マ リンの 浸 透 が 不 充 分 な 所(切 片 の 中心 部)で. は, P‑細. 胞 に 反 応 が 認 め られ な い が,既. フ ォル マ リンが 浸 透 して い る部 のP‑細 示 す,と い うP‑細. に. 胞 は反応を. 胞 に ついて のふたつの反応結果. が 同 一 切 片 で 現 わ れ て くる. ⅱ ) 次 に 固 定 を24.. (特 にP‑細 胞 に お け る)反 応 態 度 に差 異 を来 す こ と が 認 め られ た. 実 験3:. α‑GPDH及. びSDHの. 原 則 と して, intermediatorと. 証 明 に あ たつ て は してMDを. 添加する. 方 法 を と つ た が,こ れ を加 え な い場 合 に つ い て もし. 48, 72時 間 並 び に8日 間 施 し. らべ た.更 に α‑GPDHに. つ い て は, MDを. た もの につ い て み る と,当 然 の こ と な が ら全 体 に反. な い で, NADを. 応 の低 下 が み られ る が,い ず れ の 場 合 に もな おfor. を 使 用 した場 合 の 反 応 態 度 と比 較 した(表2).. mazan形. 成 を 認 め得 る.そ の 染 色 態 度 に は,固 定 時. 間 の長 さ に よ る著 明 な差 が 認 め られ な か つ た.す. な. ⅰ ) MDを. 添加 し. 加 え た 場 合 の 反 応 を しらべ, MD. 添 加 しな い 場 合:. 非 固 定 切 片 で は, α‑GPDHはMD添. 加 の 場合 に. わ ち8日 間 固 定 の 切 片 に て も24時 間 固定 の もの に比. くらべ る と全 体 に反 応 は 弱 い.こ の 場 合 に も顆 粒層,. し,染 色 態 度 に 大 差 は な か つ た.. 分 子 層 に反 応 が み られ る け れ ど もP‑細. 実 験2:固. 定 方 法 を 変 えて,ま. ス タ ッ ト切 片 を 作 製 し,ガ. ず 新 鮮 凍 結 ク リオ. ラス に 貼 附 し た後 に 冷 フ. ォル マ リンで 固 定 した.. 胞にはほと. ん ど反 応 が み られ な い. SDH反. 応 もや は りMD添. 加 の 場 合 に くらべ る と. 全 体 に 弱 く,こ の 場 合 も反 応 は顆 粒層 に最 も強 く,. 表2.
(5) 小. 脳. の. 分 子層, P‑細 胞 層 で は ほ ぼ 同 程 度 で あ り,そ 係 はMD添. 酵 の関. α‑GPDH両. SDHの. 加 の場 合,フ. MDが. つ. 素 の形 成 に は,. 重 要 な 役 割 を 演 じて い るよ うで あ る.. ⅱ ) MDを. 添 加 しな い で, NADを. α‑GPDH反. 学. α‑GPDH反. 669. 応 は す べ て の条 件 下 で マ ロ ン酸 の 影. ⅱ ) 次 に,. SH‑inhibitorす. な わ ちN‑ethylmaleimide. 定 両 切 片 を,. 37℃,. 0.1M;. ラス に 貼 附 し た非 固 N‑ethylmaleimideで,. 1時 間preincubateし,水. 液)に. 洗 後 基 質 液(反. 応 は非 固定 切 片 に お い て, MD添. 定 の 両 者 に お い て, SDH‑,. MD添. α‑GPDH反. 応 の す べ て が 陰 性 と な つ た.. 加の. 実 験6:. 場合 よ り全 体 的 に 弱 く,固 定 切片 で は更 に 低 下 し非. て,. 常 に軽 度 の 反 応 しか 認 め られ な い.た. ro‑BT. だNADを. 応. 滲 漬 し た.. そ の 結 果 は 非 固 定,固. 加 の 場 合 も添 加 し な い 場 合 も,. 加 え た場 合:. 加 した場 合 に は,非 固 定 切 片 のP細. 化. に よ る 抑 制 作 用 を し ら べ た.ガ. ォル マ リン固 定 切 片 のP‑細. 胞 で認 め られ た著 明 なformazan色. お. 定,固. 添 加 しな け れ ば α‑GPDH,. 反 応 は と も にほ とん ど認 め られ な い.従. てMD添. 織. 者. の 活性 を 増 強 させ て い る こ と が わ か る. 固定 切片 で は, MDを. 組. 響 を う け な か つ た.. 加 の場 合 と 同 じで あ つ た.す な わ ちMD. は,非 固 定 切 片 に お い て は, SDH,. 素. 添. 胞 に も軽 度 の. Pearse. Nitro‑BTの. and. Hess27)の. 方 法(前. 組 織 へ の 吸 着 性(結. formazanの. 述)を. 用 い. 合 性)と,. Nit. 分 布 様 相 と の 関 係 を し ら べ た.. 固 定 切 片 を あ らか じめNitro‑BT液. に 浸 し た後 水. 加 の. 洗 し,こ れ を ア ス コル ビ ン酸‑炭 酸 ナ ト リウ ム液 で. 場合 の様 に固 定 切 片 で 増 強 され る こ とは な く,む し. 非 酵 素 的 に還 元 させ る と, P‑細 胞 に は 特 に 強 い 反 応. 反応 が 認 め られ た,し か し この 反 応 はMD添. ろ低 下 した.. (formazan形. 実 験4:非 SDH反. 固定,固. 定 両 切 片 に お い て, α‑GPDH‑,. 応及 び そ の 滲漬 液 か ら基 質 を除 い た 場 合,. 更 にMDを. 添 加 しな い 場 合 の 各 々 に つ い て 滲 漬 液. 内 の緩 衝 液 のPH‑levelを. 変 え て(pH;. 如 くで あ るが, pHの. 変 化 に よ り影 響 を 受 け る こと. は なか つ た.. ル カ リ性 側 で はpH. 9.2迄. 大 差 な く(時. 高 い 域 で む しろ 増 強 され),酸. pHが6.0以. も同 様 に,. Nitro‑BTの. に よつ て. 性 側 で は,. 組 織 蛋 白 との 結 合 性 につ い 切 片全 体 に ほ ぼ 一 様 に. お実 験. 5‑ⅱ)と 同 じ く, N‑ethylmaleimideでpreincubateし. 5‑ⅱ)の 結 果 は, N‑ethylmaleimideがNitro‑BTの 組 織 へ の吸 着 性 を 阻 害 した結 果 で は な い こ と を示 す もの と考 え られ る.. 考. 按. 脱 水 素 酵 素 系 の 中 で もSDH及. 述 の 非 固 定,固 定 両 切 片 に つ い て, α‑. SDH反. Ⅳ. 変 化によ る影響が ほと. ん どみ られ な か つ た. 実 験5:上. 固定 切 片 につ い て. へ の 特 異 的 な 吸 着 性 は 認 め られ な か つ た.な. 下 に な る と め だ つ て 低 下 す る.し か し. 固定 切 片 にお い て は, pHの. GPDH,. 非 常 に類 似 して い る(図7).非. た 切 片 につ い て も同 様 の結 果 を 得 た.す な わ ち実 験. 添 加 した 場 合 の 非 固 定 切 片 の各 反 応 は,ア. はpHの. み られ,こ の 染 色 態 度 は, a‑. 結 合 して お り,固 定 切 片 に み られ た よ うな, P‑細 胞. 添 加 しな い 場 合 の 固定 切 片 の 反 応 は前 述 の. MDを. 成)が. 出の 際 の 固 定 切 片 にみ られ た 染 色 態 度 と. て し らべ た が, Nitro‑BTが. 4.8〜9.2). 反応 を し らべ た. MDを. GPDH検. 応 に対 す る 反 応 抑 制 剤 の 影 響 を し. らべ た. 成 が,は. た. と もに,. く,種 々組 織 に お け る これ ら酵 素活 性 の 分 布 につ い て は,既. ⅰ ) 特 に 固定 切 片 に お け るformazan形. びLDHは. 酵 素 組 織 化 学 の分 野 で 研 究 の 対 象 と され る こ とが 多. に多 くの 報 告 が あ る6)13)28)29)30)33)34)35).. 著 者 は ダ イ コ ク ネズ ミ小 脳 の 新鮮 凍 結 ク リオ ス タ. して 酵 素 反応 に よ る もの か 否 か を み るた め に,ま ず. ッ ト切 片 に お い て,顆. SDH反. の際 あ. 々に 両 酵 素 の 活性 を み た が,そ の分 布 態 度 は これ ま. 応 に対 す る影 響 に つ い て も し ら. で の 諸 家 の 認 め て い る知 見 に ほ ぼ一 致 す る も ので あ. 応 の マ ロ ン酸 に よ る抑 制 をみ た .こ. わせ て α‑GPDH反. べ 比 較検 討 した. SDH及. び α‑GPDH検. 出のための. 滲 漬 液 に,各 々 マ ロ ン酸 ナ ト リウ ムを 最 終 濃 度 が 0.025Mに. な る よ うに加 え た .非. 反 応 は, MDを. 固定 切 片 でSDH. 添 加 した場 合 も添 加 しな い 場合 に も. 粒層,分. 子 層, P‑細 胞 層 の各. る. フ ォル マ リ ン固定 切 片 にお い てSDH活. 性 が全 く. 失 わ れ る,と い う こ とはNovikoffら2)が. 指 摘 して い. ると こ ろで もあ り,. SDHの. 検 出 に 際 して は一 般 に. 明 らか に抑 制 され た.た だ 固 定 切 片 に お い て は,既. フ ォル マ リ ンに よ る固 定 を施 さ な い の が 原 則 の よ う. 述 の 如 くMD添. で あ る が, LDHの. 加 にて 軽 度 の 反 応 が み られ るが,こ. の 反応 は マ ロ ン酸 に よつ て 抑 制 さ れ な か つ た .な. 証 明に あ たつ て は,フ. ォル マ リ. ン固 定 切 片 が 用 い られ て い る場 合 が か な り あ る36)37)..
(6) 670. 徳. 著 者 はLDH,. SDHの. 永. 五. 輪. 検 出 に あた つ て,前 述 の 方. 雄. Pearse4)に. よ る と,短. 時 間(2〜4時. 間)の. 法 に よ り フ ォル マ リン固 定 切 片 に お い て もformazan. ォ ル マ リ ン 固 定 を 施 し た 場 合,. SDH,. の 形 成 を認 め た が,し か しそ の 標 本 で は非 固定 切 片. dase等. alkaline. に 比 して 反 応 が 全 般 的 に減 弱 して 現 わ れ,ま. acid phosphatase,. た 部位. に よ つ て は反 応 態 度 に多 少 の 変 化 が み られ た. α‑GPDHに. つ い て の 組 織 化学 的 研 究13)21)22)30)31). 小 脳P‑細. non‑specific. 胞 に お い て そ の 活 性 が 弱 い30),. cytochrom. oxi. phosphatase,. esterase等. な り 高 度 に 保 た れ て お り,そ. の活性はか. れ らの 証 明 に は フ ォル. マ リ ン 固 定 が 適 し て い る と し て い る.. 38)39)は,前 二 者 に く らべ る と比 較 的 少 な い が, α‑ GPDHは. は そ の 活 性 を 失 う が,. 冷フ. ま たNovikoff man3)は. and. Masek2)やWalker. and. 脱 水 素 酵 素 の 検 出 に 際 して も,方. Selig. 法 を工 夫. と い う こ とは 既 に報 告 され て お り,著 者 も ダ イ コ ネ. す れ ば フ ォル マ リ ン 固 定 が,固. ズ ミ小 脳 の 新 鮮 凍 結 ク リオ ス タ ッ ト切 片 のP‑細. も 良 好 な 結 果 を も た ら す も の で あ る と し た(前 述).. に お い て は, α‑GPDHの. 胞. 活性 がほ とん どみ られ な. い こ と を 認 め た.. Hayashi. and. Freiman41). ン に 特 にsensitiveな. と こ ろ が フ ォル マ リ ン固定 切 片 を 用 い て α‑GPDH 活 性 の 検 出 を 試 み た と ころ,分 子 層,顆 応 が 明 らか に減 弱 して 現 わ れ,こ. 粒層では反. れ はSDH,. LDH. 検 出 の 際 の 固定 切 片 にみ られ た 結 果 と 同様 で あ つ た が,非 固 定 切 片 のP‑細. 胞 に て α‑GPDHの. 活性 が. sin. ATP‑aseや. 定 を しな い場 合 よ り. (1966)は,フ. ォル マ リ. も の と し て し ら れ て い るmyo. α‑GPDHの. 証 明 に あ た り,「. 基質 」. を 加 え た 固 定 液 に て 切 片 を 固 定 す る こ と に よ り,そ の 活 性 を 保 た せ る こ と が 出 来 る こ と を 報 告 し て い る. (但 しSDHに. つ い て は こ の 方 法 も有 効 で は な か つ. た と い う.)し. か し この 場 合 に も 固定 時 間 を長 くし. ほ と ん ど認 め られ な か つ た に もか か わ らず,固 定 切. て,例. 間 に し た 場 合 に は 染 色 さ れ な い,と. 片 に て はP‑細. い う結 果 を 得 て い る.. 胞 に反 応 が 現 わ れ,し か も それ は他. の 層 の反 応 よ りも む しろ 強 い も の で あ つ た. α‑GPDHの. え ば25時. 著 者 は 脱 水 素 酵 素 系 の活 性 を 証 明 す る にあ た り,. 検 出 に あ た り,固 定 す るか し な い か. に よつ て, P‑細 胞 に おい て この よ う に全 く逆 の 関 係. 新 鮮 凍 結 ク リオ ス タ ッ ト切 片 と と もに,冷 リン固 定 切 片 も あわ せ て 使 用 し,特. フ ォル マ. に α‑GPDH,. が 示 され て お り,こ の 現 象 を解 明 す る た め に は ま ず. SDHの. 検 出 に際 して は,反 応 液 にmenadione. こ こで フ ォル マ リン固 定 の 影響 に つ い て 検 討 しな け. を添 加 す る こ と に よ り,固 定 切 片 に おい て もforma. (MD). れ ば な らな い.. zanが. 形 成 され る こ とを 認 め た.こ の場 合 の反 応 は,. 酵 素 組 織 化 学 に お け る 「固定 の 問 題 」 に つ い て は. 非 固定 切 片 に くらべ て 明 らか に軽 度 で あ り,こ れ は. 既 に多 くの 研 究 が あ る.理 論 的 に は酵 素 活 性 を低 下. ま ず酵 素 活 性 が フ ォル マ リ ンに よ り低 下 した結 果 と. せ しめ な い た め に,固 定 を 避 け新 鮮 凍 結 切 片 を 用 い. 考 え られ るが, α‑GPDHの. るの が 最 も好 ま しい,と 考 え られ る が,一 方 組 織 の. 片 のP‑細. 形 態 を 保 ち,酵 素 こ と に可 溶 性 酵 素,あ. 切 片 に て 強 陽 性 に現 わ れ る こ と は,単. るい は 反 応. 検 出 に 際 して 非 固 定 切. 胞 に ほ と ん ど陰 性 で あ つ た反 応 が,固 定 にP‑細. 胞内. 生 成 物 の 拡 散 を 防 ぎ,そ の 正 確 な 局 在 を 保 つ た め に. の 可 溶 性 の α‑GPDHの. は 固 定 を 施 す 方 が合 理 的 で あ る と され て い る.. 結 果 と して み な す わ け に は い か な い 面 が あ る と思 わ. 酵 素 組 織 化 学 に お い て,フ ル,ア. ォル マ リ ンは ア ル コー. 流 出 が 固 定 に よ り防 が れ た. れ る.. セ トン等 と と も に,固 定 剤 と して 多 く用 い ら. フ ォル マ リン固 定 切 片 に つ い て の 著 者 の 実 験 結果. れ て お り,酵 素 の種 類 に よ る 固定 の 適 否 や 固 定 法 に. を み る と,ま ず 組 織 塊 を長 時 間,例 え ば72時 間 固定. つ い て は 種 々 の 検 討 と工 夫 が な され て きた1)2)3)4)40). した 場 合 の 切 片 で も,比 較 的 短 時 間 固 定 の もの と同. 41).. 様 の 反応 態 度 を示 し, (α‑GPDH,. Seligman, Chauncey. and Nachlas1)は,. マ リ ン固定 後 の 肝 組織 のhomogenateを. 10%フ 用 い,数. SDH,. LDH検. 出. ォル. の 際 の)固 定 切 片 に お け る反 応 の程 度 に は,固 定 時. 種. 間 の 長 さに よ る著 明 な 差 異 が認 め られ な い(実 験1,. の 酵 素 に つ い て,固 定 後 に 残 存 して い る活 性 の,固. 2)と. 定 時 間 と 固定 時 温 度 に よ る影 響 の ち が い を し らべ,. 切 片 に比 しPHの. 固定 時 間 が 長 い程,ま. 験4)と. た固定時の温 度が高い程 活性. い う こ と,次 に 固 定 切 片 の 反応 で は,非 固定 変 化 に よ る影 響 が よ り少 な い(実. い う こ と,ま た 非 固 定 切 片 に お け るSDH. は低 下 す る傾 向 が あ る こ と,し か し酵 素 に よつ て は. 反応 は マ ロ ン酸 に よつ て 抑 制 を うけ るが,固 定 切 片. フ ォル マ リン固 定 の 影 響 を あ ま り受 け な い で,か. に お い て は マ ロ ン酸 に よ る 抑 制 を うけ な い(実. りの 活 性 を 保 つ て い る もの が あ る こ とを 認 め た.. な. 験. 5‑ⅰ))と い う こ とな どか ら,著 者 の 方 法 に よ る フ ォ.
(7) 小. 脳. ルマ リン固 定 切 片 に お け るNitro‑BT. の. 酵. 素. 組. 織. 化. 学. 671. の よ う なNAD‑or. formazanの. 形 成 は,も は や 酵 素 反 応 に基 く もの と は 考 え 難 く,. NADP‑independent. を 強 く活 性 化 す る こ と て,そ. dehydrogenase. のelectron. carrierと. 非 酵 素 的還 元 の 表 わ れ とみ な す べ き性 質 の もの と考. し て の 有 用 性 を 認 め て い る が,し. か しPMSは. 組織. え ざる を得 な い.て は 固 定 切 片 に現 わ れ た 反 応 は如. の 種 類 に よ つ てLDH,. (NAD‑linked. DH). 何 な る機 序 に基 くもの で あ ろ うか.. の 活 性 を 抑 制 し た り,増 強 さ せ た り し,ま. 著 者 はSDH,. α‑GPDHの. 応液 にMDを でMDを. 6‑phosphate. 証 明 に あ たつ て は,反. 添 加 す る方 法 を とつ て い る が,こ. こ. 用 い な い 場 合 の 反 応 に つ いて もみ な けれ. ば な らな い.実 験3に て, MDを に は,フ. 添加 し な い 場 合. ォル マ リン 固 定 切 片 で は α‑GPDH,. SDH. DH. α‑GPDH. (NADP‑linked. の 組 織 に てPMSに. DH)は,ほ. とんど. よ り活 性 が 抑 制 され. (Hardonk46)).. る と し た. Hashimotoら95)も,種. 鮮 凍 結 切 片 を 材 料 と し,水 BTを. たglucose‑. 用 い た 場 合,. 々組織の新. 素 受 容 体 と し てNitro‑. PMSがincubation. conditionに. の活 性 は証 明 され て い な い.従 つ て 固 定 切 片 に お け. よ つ て,染. る反応 の 出現 に, MDが. 較 的 変 化 し 易 い 作 用 を 及 ぼ す こ と を 指 摘 し,更. 重 要 な 役 割 を 演 じて い る こ. 色 性 を 増 強 させ た り抑制 させ た り して 比. とに は疑 いな い.一 方 非 固 定 切 片 で は,活 性 は み ら. れ に 比 す れ ばMDは. れ るけれ ど もSDH,. 塩 還 元 に 安 定 し た 作 用 を 示 す こ と を 認 め て い る.ま. α‑GPDHと. もにMDを. 添加 し. 抑制 作用 は な. にそ. た場合 よ り も反 応 は 弱 く,従 つ て 非 固定 切 片 に お い. たMDの. てMDは. 増 強 さ せ る こ と を 指 摘 し て い る.. 反 応 を 促 進 させ て い る こ と に な る.. 酵 素 組 織 化 学 に お い て, る と い う こ と は,最. MDが. 初Wattenberg. (1960)に. よ つ て 示 さ れ た.彼. てSDH,. α‑GPDH等. MDに. 有 益な作用を有す and. Leong38)42). 等は肝組織 等にお い. の 活 性 が,. coenzyme. Q10及. び. よ つ て 明 ら か に 増 強 さ れ る こ と を 認 め て い る.. そ して こ れ らquinone誘 とtetrazolium塩. 導 体 は,単. に脱 水 素酵 素 系. し て 作 用 す る の み で な く,そ. の 酵 素 系 の 何 ら か のcomponentと 互 作 用 に よ り,酵. の よ り特 異 的 な 相. 素 活 性 を 増 強 させ る もの で あ ろ う. と の 見 解 を 示 し た("menadione‑linked"α‑GPDH). Hess. and. Pearse21) (1961)は. の 新 鮮 凍 結 切 片 に て,特 の 検 出 に 際 し, MDが. にmitochondria内. α‑GPDH 7.4に. て),. MD及. くな る こ と を 認 め て い る.そ. び α‑グ リセ ロ 燐 酸 を 含 む 組 織 化 学 的 反 応 で. の 電 子 伝 達 系 は,恐. ら く直 接 酵 素 的 にtetrazolium塩. の 還 元 が な さ れ る 経 路 と は 異 つ た,別 も の と み な し,こ ctase".. して. (wosilait. の 場 合 の 酵 素 は"α‑GP‑MD and. Nason43):. 1954)と. 性 質 の も の で あ る と し て い る. 還 元 型MDの. 存 在 に て,非. Hashimotoら45). は,. 酵 素 的 にformazan色. (1964)は,. (PMS)の. redu 称すべ き. tetrazolium塩. へ 還 元 さ れ る わ け で あ る(Slater44)). methosulfate. の経路 をと る. 素. .. MD及. igman3),. 応 用 に つ い て は,. Hardonk46)そ. の 他47)の. 切 片 のP‑細. Walker. and. 活 性 検 出 に あ た り,非 固 定. 胞 に お い て は, MDを. 添 加 して もそ の. 影 響 が認 め られ な い と い う こ とで あ る.す な わ ち, 反 応 液 にNADを. も顆 粒 層,分. 添 加 しな い 場 合 に. 子層 に は 活 性 が認 め られ, MDの. 存在. は そ の 反 応 を 更 に 増 強 させ るが, P‑細 胞 で は活 性 が 非 常 に 微 弱 で あ り,し か もMD添. 加 に よつ て もそ. た反 応 液 にNADを. 添加 す る. こ と に よ つ て, P‑細 胞 に 軽 度 の 反 応 が 現 わ れ る の で あ るが(NAD‑linked. α‑GPDH),こ. MD添. 胞 反 応 は増 強 され な い(む. 加 に よつ てP‑細. は, P‑細 胞 に は 可 溶 性 のNAD‑linkeed. の 場 合 にも. つて理論的 に α‑GPDHの. 活 性 が い くらか 存 在 して い る と して も, NADを. 必. 要 と しな い 不 溶 性 の α‑GPDH,あ るいは い わ ゆ る "MD ‑linked" α‑GPDHと で も称 すべ き ものの 存 在 を 想 定 す る な らば, P‑細 胞 は そ の 活 性 を 有 しな い, と考 え られ る. しか る に フ ォル マ リン固 定 を施 した 切 片 に お い て は,反. 応 液 にMDを. 添 加 した 場 合 に, P細 胞 に 強. formazanの. 形 成 が 認 め られ る こ と. は,見 逃 せ な い事 実 で あ り,こ の よ うな 現 象 につ い. 組織化学的応 用 に お け る. ,. そ れ らの 脱 水 素 酵 素 活 性 に 及 ぼ す 影 響 に つ い て し ら べ て い る . PMSの. α‑. 応 を 明 らか に 増 強 させ る. こ と を 確 認 し た.し か し こ こで 注 目 す べ き こ とは, 小 脳 皮 質 の α‑GPDHの. 度 のNitro‑BT びPhenazine. 応 を も. 固 定 組 織 切 片 に てSDH‑,. しろ 減 弱 す る傾 向 さ え み られ た).従. 基 質 が コ ハ ク酸 の 場 合 よ り もtetrazolium塩(MTT) の 還 元 が 約50%高. dehydrogenase"反. DH"反. れ が増 強 され な い.ま. ダ イ コ ク ネ ズ ミの 脳. 存 在 す れ ば(pH;. 著 者 もMDが,非 GPDH‑,"nothing. α‑GPDHは. と の 間 のnonspecificなintermedi. ate electron carriersと. 存 在 は"nothing. く, tetrazolium. Sel. 報 告 が あ り , SDH. て そ の 本 態 や 機 構 を 説 明 す る こ と は 容 易 な こ とで は な い. Walker. and Seligman3)に. マ リ ン固 定 切 片 で はSDH活. よ れ ば, PMSは. フ ォル. 性 を 抑 制 す るが, MD.
(8) 672. 徳. 永. 五. 輪. 雄. は フ ォル マ リ ン固 定 後 に お いて も軽 度 に て は あ る が. Nitro‑BTの. SDHの. groupとMDと. 活 性 を 促 進 す る と して い る.し. か し著者の. 組 織 蛋 白 と の 結 合 性 を 前 提 と して,. SH‑. が 関 与 して い る非 酵 素 的 作 用 の 結. 実 験 の 結 果 か らは,前 述 の 如 くP‑細 胞 の 反 応 に 限. 果 で あ る こと を 示 唆 す る もの と考 え られ る.そ の間. らずSDH,. の 具 体 的 な 反応 機 序 の 決 定 は,今 後 の 検 索 に ま たな. α‑GPDHの. 検 出 に あ た りMDを. 添加. した 場 合 の 固 定 切片 に現 わ れ る反 応 は,す べ てMD. け れ ば な らな い.. に よ り そ の酵 素 活 性 が 促 進 さ れ た結 果 で あ る とは 考 え 難 い.. な お,こ. の 問 題 に 関 連 し た こ と と し て, Thomas48). (1963)は,. Pearse. and. Hess27). (1961)は,脱. 水素酵 素の組織. 化 学 に お け る色 素 と 組 織 蛋 白 との 結 合 性 に つ い て 検 討 し, tetrazolium塩. の. 「lipoprotein. の 吸 着 性 」("substantivity"for 要 因 を 指 摘 し て い る.彼 固 定 はNitro‑BTの. 強 め る. 等 に よ る と,フ. ォル マ リ ン. 分 布 がlipofusoinの. 組 織 蛋 白(lipoprotein. structures). cellsで. GPDH活. ク ネ ズ ミ の 腎 組 織 に お い て,. 使 用 して. る.非. た と え ば 基 質 と し てNADH2を 合 のPatternは,非. pattern‑. て,フ. 織 切 片 へ のNatro‑BTの. 非常 に似てい ることを. ォル マ リン固定 を施 した 組. Thomas. and. Pearseら30)は. 固 定 切 片 に てP‑細. 胞が. MDの. 存 在 下 でSH‑基. い てformazanを. の 結 合 性 を増. の 関 与 した 過 程 に お. Ⅴ 要. P‑細 胞 の. (1). 約. ダ イ コ ク ネ ズ ミ及 び ヒ ト,ネ. に 強 い 反 応 が 認 め られ た.こ の こ と は,固 定 切片 に. 素(SDH),. お い て はNitro‑BTのP‑細. 活 性 を 組 織 化 学 的 に検 索 した.. 胞へ の吸 着 性 が強 い こ. とを 示 す もの と考 え られ,従 る反 応 は, Nitro‑BTの. つ て 固定 切 片 に み られ. 組織 への吸着 性に関 連 して. 現 わ れ た もの で あ ろ うと 思 わ れ る. と こ ろ がSH‑inhibitorす. れ て 陰 性 と な る(実. の 場 合 で もNitr. 固 定 を とわ ず 反 応 は 抑 制 さ. 験5‑ⅱ).従. つ て,こ. 胞 に お け る 非 酵 素 的Nitro‑BT還. は 組 織 内 のSH‑基. の 固 定 切 片, 元反応 に. の 関 与 を 考 え な け れ ば な ら な い.. 更 に 基 質 の 存 在 しな い"nothing に よ り増 強 され,そ. DH"反. 加 に よ つ て), P‑細. 応 の場 合 と 同 様. 胞 にお け る反 応 が 顆. 粒 層 や 分 子 層 に お け るよ り もや や 強 く現 わ れ る傾 向 が 認 め られ る と い う 事 実 も 考 え あ わ せ る と,実 結 果 か ら, MD添. に そ のP‑細. α‑GPDHの. と してmenadione. 検 出 に あ た つ て はintermediator (MD)を. 反 応 液 に 添 加 した. 顆 粒. cerebellosi"に 相 当 して 最 も 強 く,. 分 子 層 で はformazan顆. 粒 は び ま ん 性 に 形 成 され て. 反 応 は顆 粒層 よ りや や 弱 くPurkinje細. 胞(P‑細 胞). は 核 を 除 い て 細 胞 体 に 強度 〜 中 等 度 の 活 性 を示 し, 白質 に は 活 性 は ほ と ん ど 証 明 され なか つ た. SDHは. 全 体 と してLDHの. 反応 態度に 似た 像を. 示 し,顆 粒層 に最 も強 く,つ い でP‑細. 胞 層,分. 子. 層 の順 で 活 性 が 認 め られ,白 質 に は ほ とん ど証 明さ. 応 がMD. の 場 合 こ とに 固 定 切 片 に お い て. は 基 質 の 存 在 して い る α‑GPDH反. α‑グリセ ロ燐 酸 脱 水 素 酵 素(α‑GPDH). 層 の"gloneruli. 組 織 へ の 吸 着 性 は充 分 に 保 たれ て い る に も 定,非. SDH,. コの 小 脳 に つ. ハ ク 酸 脱 水 素酵. 新 鮮 凍 結 ク リオ ス タ ッ ト切 片 に て, LDHは. な わ ちN‑ethylmaleimide. た 切 片 で は‑こ. か か わ らず‑固. 切 片,特. 性をほ. ら れ る.. 出 にあ. 添 加 した 場 合 の)固 定 切 片 に み られ た. 5‑ⅱ)及 び実 験6の. α‑GPDH活. 形 成 す る と い う事 実 は,. い て,乳 酸 脱 水 素 酵 素(LDH),コ. に(MD添. こ れ が α‑. 胞 が 固 定 に よ りNitro‑BTと. 染 色 態 度 に非 常 に よ く似 て お り, P‑細 胞 に お い て 特. 特 にP‑細. ころ. 吸 着 態 度 を非 酵 素 的 還 元 に. よ つ て し らべ た が,そ の 結 果 は α‑GPDH検. o‑BTの. ほ. な わ ち"lipophobe". 細 胞 化 学 的特 異 性 の 一 面 を示 す もの で あ ろ う と考 え. 著 者 も実 験6に. でprencubateし. 胞 がlipofuscinを. 性 を ほ と ん ど 示 さな い こ とを 報 告 して い. が,P‑細 強 し,. 酵 素 的 還 元 と し てNitro‑BTを. 指 摘 し て い る.. た り(MDを. の. とん ど示 さな か つ た こ と は彼 等 の 所 見 に 一 致 す る. 用 い て 検 索 した 場. 吸 着 して 得 ら れ たpatternと. にP‑細. あ る こ と は 既 に し ら れ て い る45)50)51)と. で あ る が,. に ダイ コ. Aitro‑BTを. 沈着の. 分 布 と特 異 的 に関 連 性 が あ る ら. と ん ど 蓄 積 し な い 性 質 の も の,す. へ の 結 合 性 を 増 強 さ せ る と さ れ て お り,更. の 酵 素 的 還 元 に よ つ て 得 ら れ たstaining. 活 性 がlipofuscinの. し い と 考 え て お り,更. structuresへ. protein)を. α‑GPDHの. あ る 周 辺 に 隣 接 し て 高 度 に 示 さ れ た こ と か ら,そ. 験. 加 に よ る 固定. 胞 に お け る 反 応 の 出 現 は,. れ な か つ た. α‑GPDH反 LDH,. 応 は,顆. SDHと. formazanの. 粒層,分. 子 層 に お いて は. ほ ぼ 同 じで あ るが,. P‑細 胞 層 に は. 形 成 が ほ とん ど な く,あ た か も 顆 粒層. と分 子 層 の 間 に 空 隙 が あ る様 な 像 を示 し た.白 質 に は 活 性 は ほ とん ど証 明 さ れ な か つ た, こ れ ら の 所 見 は,こ れ まで の 報 告 に ほ ぼ一 致 す.
(9) 小. 脳. の. 酵. 素. 組. る もの で あ る. (2)上 記 酵 素活 性 の検 出 に あ た り,新 鮮 凍 結 ク リ. α‑GPDH,. LDHと. もに 反応 は 全 般 に 減 弱. 反 応 の 減 弱 の 度 合 は他 の2者 に. ⅳ ) MDの. 存 在 が 不 可 欠 で あ る.. ⅴ ) SH‑基. の 関 与 が あ る. 組織へ の 吸着性の 増 強 が 関 連 し. この こ とか ら フ ォル マ リン固定 切 片 に 見 られ る反 応 は, Nitro‑BTの. 組 織 蛋 白 との 結 合 性 を 前 提 と し. て, SH‑groupとMDと. くらべ て 少 な い よ うで あ つ た. こ こで 注 目す べ き こと は,非 固 定 切 片 のP‑細 層 に お い て, α‑GPDHの. 673. と い う こ とを 認 め た.. 凍結 切 片 を あ わせ て使 用 した. SDH,. 学. て い る.. フ ォル マ リンで 固 定 した 後 に作 製 した. され るが, LDHの. 化. ⅵ ) Nitro‑BTの. オ ス タ ッ ト切 片 と と もに,同 一 材 料 に つ いて 組 織 塊 を ま ず10%冷. 織. 胞. 用 の 結 果 で あ る こ とを 推 論 した.. 活 性 が ほ とん ど 認 め ら れ. な か つ た に も か かわ らず 固定 切 片 のP‑細 応 が認 め られ,し か もformazan形. 胞 には反. 成 は 他の部 よ り. もむ しろ強 度 で あつ た点 で あ る.こ の 事 実 は 酵 素 組. が 関 与 して い る非 酵 素 的 作. (4) 小 脳 組 織 でP‑細. 胞 が 他 の 細 胞 要 素 と異 な り,. 非 固 定 切 片 に お い て α‑GPDH活. 性 を ほ と ん ど示 さ. な い こ と,お よ び フ ォル マ リ ン固 定 に よ りP‑細 胞 に非 酵 素 的 なNitro‑BT還. 元 が著 明 に あ らわ れ る こ. 織 化学 に お け る方 法 の 選 定 や 結 果 の 判 定 に あ たつ て. とは, P‑細 胞 の細 胞 化 学 的 特 異 性 の 一 面 を 示 す も. は常 に慎 重 な 配 慮 が 要 求 され る こ とを示 す 現 象 で あ. の で あ ろ う.. るとみ な され,こ の点 に 着 目 し特 に 固定 の 問 題 をめ ぐつ て 諸 種 の条 件 を 実 験 的 に設 定 して し らべ た.. 稿 を 終 る に あ た り,御 校 閲 を い た だ い た 恩 師 奥 村. (3) フ ォル マ リン固 定 切 片 にお け る反 応 に は,. 教 授 な らび に終 始御 指 導,御 鞭 撻 下 さ つ た 岡 山 県 立. ⅰ ) 固 定 時 間 の 長 さ に よ る著 明 な差 異 が み られ な. 岡 山 病 院 長 那 須 弘 之 博 士 に厚 く御 礼 申 し上 げ ます.. い. ⅱ ) pHの. 変 化 に よ る影 響 が少 な い.. (本 論 文 の 要 旨は 第8回. ⅲ ) 特 異 的 抑 制 剤 に よ る影 響 が み られ な い.. 文 1). Seligman, las,. 2). 4). A.. Chauncey,. Walker,. D.. physic.. and. Pearse,. A.. G.,. H.,. and. 19,. Masek,. 献. J.. 10) Histoch. 1958. Seligman,. Biochem.. Cytol.,. 11) A.. M.:. 9:. H.. Histochem.. Bio. 1961 J.,. and. Cytochem.,. Brown, 5:. 13). 7). 8). M.,. Cytochem.,. Pearse,. A.. 515,. 591,. M.:. M. J.. K‑C., 5:. E.:. J.. et. 420,. al:. J.. Hist. M.:. 14). 1957. Histochem.. 15). Seligman,. 16). Okayama,. Walker,. D. and. G.. and. Biochem.. Cytol.,. J.. M.,. Walker. Biophysic.. , and. D.. G.,. Biochem.. and. Cytol.,. 4:. J.. D.. E.:. J.. 302,. Seki,. S.:. Acta. 1958. Histochem.. 747,. 1958. G.,. Hess,. Hess,. Biophysic.. R., J.. Cytochem.,. R., and. Scarpelli,. Biophysic.. D.. and. Pearse,. Biochem.. G.,. and. 6:. and. A.. G.. Cytol.,. Pearse,. Biochem.. Cytol.,. 4:. A.. G. 4:. 1958. Wattenberg,. L.. 225,. W.:. J.. Histochem.. Cytochem.,. 1958. Zimmermann,. H.,. and. Pearse,. Cytochem.,. Glenner,. G. G., J.. Histochem.. R. B.:. 7:. Weissbach,. 17). Cohen, 106:. 309,. 1961. 18). Hess,. R.,. Pearse,. Seligman,. and. 1958. Scarpelli,. B. G.:. 4:. H, 12:. B.:. Histochem. M.,. Biophysic.. M.. Okazaki,. Pearson,. 6: Cytochem.,. 1958. Nachlas, A.. G.. Tsou,. 1957. Nachlas,. 29, 9). M.. ochem.. A.. Med.. 753,. Nachlas,. 5:. T,. E:. 1957 6). Oda,. 112, 12). 1961. Theoretical. Churchill.. Burtner,. J.. 415,. Histcchemistry. London:. 467, 1958. Nach. 1951. B.:. and. G.,. J.. H. 26:. 217,. G. E.:. G.. G. W.:. and 6:. Applied.. Glenner,. Tech.,. B.,. Cytochem.,. and 5). M., Stain. Novikoff, em.. 3). A.. M.M.:. 日本 神 経 病 理 学 会 総 会 に. お い て 発 表 した.). Proc.. 271, H.,. Cytochem., Soc.. A. G. E.:. A.. J.. 1959 and 8:. Exp.. G. E.:. Redfield, 258,. Biol.. Experimentia,. 1960 Med.,. 17:.
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(11) 小 Enzyme. 脳. with. a. の 酵. 組. Histochemistry. special. reference. in. 素. to. Purkinje. 織. 化 学. of the. 675. Cerebellum. α‑glycerophosphate. cells. and. fixation. the. of. the. dehydrogenase. problem. of. the. material. By Iwao Department. of Neuro-Psychiatry. TOKUNAGA. Okayama. (Director:. University. Prof.. Medical. Nikichi. School,. Okayama,. Japan. Okumura). ABSTRACT With ate. the. genase. been. cryostat. the. formation. cial. precaution. the. enzyme. conditions. of. is. little. 4). the. when. formazans in. a. this. in. observed. study. have. of. was. been. the. tried. freshly‑. as. has. already. molecular. with. fact. in. cold. specal. α‑GPDH that. of various. reference. P‑cell. formalin. of. in dicates. of. layer. detected. determination. establishment a. α‑GPDH, the. SDH,. fixed. lact. In. identification. This the. with. and. been. first of. and. view,. SDH. and. hardly. P‑cells.. of. dehydro‑. cerebellosi),. course. methods. of. LDH. has. block. activities. intermediator.. of. the in. of. the. α‑glycerophosphate. (glomeruli. α‑GPDH. tissue. point. an. activities. the. material. identification as. layer of. selection. the and. the. prepared, was. the. From such. the. granular. were. required. for. For. activity. findings, sections. histochemistry.. following. results. the. 1). effect presence. of. the. to. is. MD. the. reaction.. is. the. that. sections different. fact that. the non‑enzymic seem. no. I. have. non‑enzymic is. bound do. other. recuction. to reflect one. is. a. spe. results. in. experimental to. that. the. problem. the. hardly. tissue exhibit. aspect. appears. 6) the. the. be. fixed 2). there. observed:. enhancement. tissue. reaction SH‑group. is. of. associated. observable and. MD. in are. the invo. protein. the. activity. of cerebellar markedly. of the cytochemical. sections time:. can. to the. which. the. fixation. and. Nitro‑BT. in. cellular components. of Nitro‑BT. in of. effect. involved; of. postulated. to. reaction length. inhibitory. reaction. P‑cells. the. the. specific. Pearse). that. from. to to. SH‑group. Nitro‑BT. findings. non‑fixed. fixed specimen,. 3) 5). findings from. regard due. substativity;. these. the. pH:. prerequisite;. results. with. difference. in. cf:. assumption. Furthevmore,. fouud. marked. change. From. sections. been. no. (adsorption;. formalinfixed on. have. there. due. incorporation. lved,. the. as. medium. cerebellum, in. Nitro‑BT. is. formalin:. with. this. cat. (SDH),. incubation. the. but. frozen. and. fixation.. The with. to. then. human dehydrogenase. the. found. (P‑cells),. optimal. the. of. been. contrast and. rat,. histochemically.. to. sections. cells. In. solution. added. have. Purkinje. layer.. studied. was. reported,. and. albino succinate. were. (MD). prepares. of. (LDH),. (α‑GPDH). menadione. of. cerebellum. dehydrogenase. in. of. tissue,. α‑GPDH. in. as well. the. as the. P‑cells of the formalin‑. specificity of the P‑cells..
(12) 676. 徳. 徳. 図1:. LDH,ダ 脳,新. イ コ ク ネ ズ ミ小. 鮮 ク リ オ ス タ ッ ト切. 片.. 図2:. 永. 永. 五. 論. SDH,ダ 脳,新. 文. 輪. 雄. 附. 図. イ コ ク ネ ズ ミ小. 図3:. 図3の. 弱 拡 大.. イ コ ク ネズ 鮮 ク リオ ス タ ッ. ト切 片.. 片.. 図4:. α‑GPDH,ダ ミ小 脳,新. 鮮 ク リ オ ス タ ッ ト切. 図5:. (α‑GPDH),ダ. イ コ ク ネ ズ ミ小 脳,. 冷 フ オ ル マ リ ン 固 定 切 片.. 図6:. (α‑GPDH),ヒ ン固 定 切 片 .. ト小 脳,冷. フオル マ リ. 図7:. ダ イ コ ク ネ ズ ミ小 脳,固 (結 合)し. たNitro‑BTの,ア. 酸 に よ る 還 元 反 応.. 定切片に吸着 ス コル ビン.
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