カ テ コ ー ル ア ミ ン 代 謝 に 関 す る 基 礎 的 な ら び に 臨 床 的 研 究
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(2) 452. 岸. 第2章. 方. 川. 秀. 実. 操 作 を 開 始 し た.測. 法. 定 可 能 な 最 低 必 要 量 は3.0mlで. あ っ た.. 第1節. 生 体 試 料 の 採集 お よ び保 存 方 法. 第2節. 1). 織. 生 体 試 料 に お け る カ テ コ ー ル ア ミ ン 類 の 測 定 は,. 組. マ ウスおよ び ラッ トな どの小 動 物 の 場 合 は,部 位 別. 測定 法. 次 に 述 べ る よ う に 大 き く 分 け て5段. 階 の操 作 過 程 に. 分離 摘 出 の 場 合 を除 き,直 接 に動 物 を 液体 窒 素 に 落. 分 け ら れ る.す. と し込 み 瞬 間 固定 を行 った後,分 析 し よ う とす る組. 脱 脂 の 過 程 お よ び 加 水 分 解 の 過 程 で あ る.第. 織 を取 り出 した.ネ コ な ど比 較 的 大 きい動 物 の 場 合,. 階 は,カ テ コ ー ル ア ミ ン の ア ル ミナ へ の 吸 着 で あ る.. な わ ち,第 一 の 段 階 は 試 料 の 除 蛋 白, 二の段. 特 に脳 組 織 の場 合 に は,各 部 位 別 に分 離 摘 出す る機. カ テ コ ー ル ア ミンの メ チ ル 化 合 物 で あ るmetaneph. 会 が 多 く,著 者 は,摘 出時 の カ テ コ ー ル ア ミン の変. rine,. 動 を で き るだ け少 な くす る た め に 冷 却 生 理 食 塩 水. 換 樹 脂 を 用 い た.第. (0℃)で. 脳 内 を急 速 灌 流 した後,冷 却 固定 された. normetanephrineな. ど に つ い て は,イ. 三 の 段 階 は,カ. の ア ル ミ ナ か らの 溶 出 過 程,第. テ コー ル ア ミン. 四 の 段 階 は,ト. 脳 を す ば や く分 離摘 出す る方 法 を と っ た24).摘 出した. ル オ ロ ア セ チ ル 化(TFA化)で. 組 織 片 は試 料 処 理 開 始 ま で液 体 窒 素 につ け保存 した.. 段 階 と し て ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー で あ る.. 2). 血. 液. 1). マ ウス お よ び ラッ トなどの小 動 物 に お け る採 血 は, 心 臓 穿 刺 に よ っ て行 っ た.ネ コの 場 合 は,股 静 脈 よ り採 血 した.. 午 前9〜10時. に行 っ た.. 採 血 量 は,動 物 お よ び ヒ トと もに約7〜10mlで. あ. る.な お最 低 必 要 量 は,血 清 に して2 ,5mlで あ っ た. 採 集 し た 血液 は,ポ. リシ リコ ン樹 脂 製 の遠 心 管 に移. し,氷 で30分 間 冷 や した後,. リフ. あ る .最 後 に 第 五 の. 試 料 の 除 蛋 白お よ び脱 脂. 脳 組 織 の 場 合,ま. ず0〜2℃. 素 酸 を 脳 組 織1gに. に 冷 却 し た0.4N過. つ き20ml加. イ ザ ー に 入 れ,コ. ヒ トよ りの 採 血 は,原 則 と して 空 腹 安 静 の 状 態 で. オ ン交. え,ガ. ー ル ドル ー ム(1〜2℃)中. で ホ. モ ゲ ナ イズ し た .そ. の 後,. 遠 心 分 離 を行 い,上. 清 を 別 の 試 験 管 に と り,残. 再 度0.4N過. 0℃,. 塩 素 酸10mlで. 13,000g,. 洗 い,. 5分 間 遠 心 分 離 を 行 っ た 後,上 清 と 合 せ た.こ. 塩. ラ ス ホモ ゲ ナ. 0℃,. 10分 間 渣 を. 12,000g,. 清 を と り,最. の 除 蛋 白 され た 上 清 に0℃. 初 の上. に冷 却 し. 0℃ , 3000g, 8分 で 血 清 を分 離 し た.血 清 は,次 の 処 理実 験 を開 始 しな. たether‑benzene(溶. い限 り,血 清 分 離 後 す ぐに 液体 窒 素 固定 を して保 存. イ ワ キ,東. した.. 機 層 と水 層 の 境 界 面 に 不 溶 物 を 析 出 す る 水 層 を カ テ. 3). 尿 まで の24時 間尿 を1日 尿 と し. た. 1日 尿 採 集 直 後,塩 酸 で酸 性(pH1〜2)に. し,. 必 要 量 を‑20℃ 以 下 に保 存 した.夏 期 な どの尿 の腐 敗 しや す い季 節 に お け る蓄尿 に は,ペ ニ シ リン20万 単 位 を あ らか じめ蓄 尿 瓶 に投 入 して 防 腐 した.ペ. ニ. シ リ ン投 入 を行 って もカ テ コ ー ル ア ミン値 に は,影 響 を及 ぼ さな か っ た. 髄. 同 容 積 量 を 加 え 振 盪 器(KM式 京)で. 約300rpm,. ラ ン 針(#18)を. 朝8時 か ら翌 朝8時. 4). 積 比 で5:2)を. つ けた 注 射 器 で 不 溶 物 を吸 引 しな. 50mlビ. め る. 血 清 の 場 合,ま た0.4N過. ず 血 清5.0mlに. に冷却 し. 加 え手 で 振 っ て よ く 攪 拌. 0℃,. 10分 間 遠 心 分 離 を 行 い 上. 12,000g,. 洗 い,. 行 っ た 後,上. 0℃,. 脂 は,. 患 の な い虫 垂 炎(38例)お. な 操 作 を 行 っ た.血. よ び下 肢 骨 折(2例)の 性17例,年. 令10〜55才(平. 均33才))に つ いて 協 力 を依 頼 し手 術 前 の 腰 椎麻 酔 時 にお け る腰 椎 穿 刺 の 時,採 集 した. ちに ポ リシ リコ ン樹 脂製 の遠. 心 管 に移 し,氷 で 冷 却 した.液 体 窒 素 に よ る保 存 が で きな い 場 合 は,直 ち に0 .4N過 塩 素 酸 を加 え,処 理. 12,000g,. 5分. 塩素酸. 間遠 心 分 離 を. 清 液 を と り最 初 の 上 清 液 と 合 せ る.脱. た.髄 液 は,中 枢 神 経 系 お よ び精 神 神 経 科 領 域 の 疾. 採 集 した 髄 液 は,直. 対 し0℃. 塩 素 酸10.0mlを. し た 後,. 5.0mlで. 性23例,女. の 脱 脂 まで 終 了 した. ーカ ー に 移 し次 の 操 作 段 階 へ 進. 清 液 を 別 の 試 験 管 に と り,残 渣 を 再 度0.4N過. 液. ヒ トの髄 液 中の カ テ コ ー ル ア ミン類 の 測 定 を行 っ. 患 者40例(男. 万 能 シ ェ ー カー: KK 1分 間 振 盪 す る と,有. い よ う に 注 意 して 吸 い 取 る .こ 抽 出 液 は,. 上清液量 と. ether‑benzeneを. 用 い て 脳 組 織 の 場 合 と同 様 漿 の 場 合 も,血. 清 と同 様 な 除蛋. 白 お よ び 脱 脂 を行 う. 髄 液 の 場 合,血 清 と ほ ぼ 同 様 な 操 作 過 程 で あ る が. 髄 液5.0mlに 離 し,. 2回. 対 し0.4N過. 目 の 遠 心 分 離 に は,. で 行 っ た. 2). 塩 素 酸7.0mlを. 加水分解. 0.4N過. 加 え遠 心 分 塩 素 酸5.0ml.
(3) カテ コー ル ア ミン代謝 に関 す る基礎 的 な らび に臨床 的研 究. 尿 の 場 合 は,加 洋 ロ 紙No. 間,加. 水 分 解 を 行 う.す. 2)で. な わ ち ロ 紙(東. ろ 過 し た 尿30.0mlを100℃,. 水 分 解 を行 っ た 後,次. お よ び ガ ラ ス ウ ー ル な ど は,シ. 20分. の カ テ コ ー ル ア ミ ン類. の ア ル ミナ へ の 吸 着 過 程 に 移 る. 3). 清 お よ び 髄 液 の 除 蛋 白,脱. 終 了 し た 抽 出 液,尿. 脂 の過 程 を. の加 水 分 解 の 過 程 を終 了 した も. した 後 す ば. や く酸 性 処 理 し た 活 性 ア ル ミナ を 加 え,つ ア ン モ ニ ア 水 でpH8.4に. し,. る と ア ル ミナ は,底. 内 標 準 物 質 を 含 むn‑hexaneに. 7分. ECDを. 溶 か した カ テ コー ガ ス ク ロ マ トグ ラ. ス ク ロ マ トグ ラ フ の 装 置 は,. 用 い たYanaco. G80(柳. 記 録 計 を 付 属 し て い る.ガ 条 件 は 表1に. ン モ ニ ア 水 でpH5.5〜6.0に. ス タ ー ラ ー で 攪 拌 し た .つ. リ コ ン処 理 を 行 っ た.. ガ ス ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー. フ 装 置 に 注 入 し た.ガ. の に つ い て 以 下 同 様 の 操 作 を 行 う。 ま ず4Nア. 6). ル ア ミン 類 含 有 液 の0.5〜2.0μlを. カ テ コ ール ア ミン類 の アル ミナへ の 吸 着. 脳 組 織,血. 453. 示 し た.充. 本 製 作 所,京. 都)で. ス ク ロマ トグ ラ フ ィー の. 填 剤 のagingは,新. し い充. 表1. い で1N. 間 マ グ ネ テ ィ ック. い で5分. 間静 か に放 置 す. に 沈 澱 す る.上. 清 液 を捨 て ゝ沈. 澱 し た ア ル ミナ を ガ ラ ス ウ ー ル を つ め た ガ ラ ス カ ラ ム(内. 径9mm,長. 留 水 を 流 し3回. さ30cm)に 洗 う.な. よ び 尿 で は2g,血. 4). 冷 却 した 約10mlの. 蒸. お ア ル ミナ め 量 は,組. 清 お よ び 髄 液 で は1.5gを. 織お 用 い た.. カ テ コ ー ル ア ミ ン 類 の ア ル ミ ナ か らの 溶 出過. 程. ア ル ミナ を ガ ラ ス カ ラ ム に つ め 込 み 洗 滌 し た 後0.2 N酢. 酸20.0mlで. 溶 出 し た.特. 溶 出 す る 場 合 は, 速 度 は,. 0.25N酢. 1.0ml/分. 0.1%ア. ATMO‑VAC.. 5). 加 え, 25mlナ. ‑50℃,約10時 Refrigation. Park,. N. Y.)し. 用 い た.溶 出. シ. 間,凍 結 乾 燥(装 for Science. Inc.,. た.. .05mlを. い で 酢 酸 エ チ ル(ク. anhydride)を1滴. 加 え た.な. お. 無 水 ト リフル オ ロ酢 酸 を 加 え て 発 煙 を生 じ た 場 合 は, 再 度 真 空 ポ ン プ で 吸 引 した 後 デ シ ケ ー ター に 入 れ,で 度 酢 酸 エ チ ル お よ び無 水 ト. リ フ ル オ ロ酢 酸 を 加 え た.そ. の 後 ナ シ型 コル ベ ン の. 口 を パ ラ フ ィル ム で 完 全 に 密 封 し, 温 を 行 っ た.最. る.こ ー ム. 45℃,. 10分 間 保. 後 に 内 標 準 物 質 を 含 ん だn‑hexane. を1.0〜3.0ml加. え た.内 標 準 物 質 に 関 して は 後 述 す. れ ら の 前 処 理 の う ち 溶 出 過 程 は,コ. (1〜2℃)で. 行 い,ト. 間 ガ ラ ス カ ラ ム の一. 行 っ た,そ. ム を 検 出 器 側 に 連 結 さ せ,さ 上agingを. N2流 速 の 後 カ ラ. ら に 同 条 件 で24時. 間以. 行 っ た.連 日 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ を 使 用 す 料 注 入 後,同. 条 件 でagingを. 持 続 して. 第3章. 実験成績. ロ. 加 え て こ の 試 料 を 溶 か し た 後,す. き る限 り脱 水 を 行 い,再. N2圧1.8kg/cm2で. シ型 コル ベ. ば や く ア ン プ ル 内 に 密 封 し た 無 水 ト リ フ ル オ ロ酢 酸 (trifluoroacetic. 35.0ml/分,. る場 合 は,試. 完 全 に 凍 結 乾 燥 を行 う と 溶 出 液 は,ナ. マ ト用)0. 低48時. 使 用 し た.. ト リ フ ル オ ロ ア セ チ ル 化(TFA化). ン の 底 に 白 色 粉 末 と な る .つ. 填 剤 を 用 い る 場 合 は,最. 方 を 検 出 器 側 よ り は ず し カ ラ ム 温 度195℃,. の 溶 出 液10.0mlに. セ チ ル ア セ ト ン を2〜3滴. Island,. 選択的に. 酸20.0mlを. で あ っ た.こ. 型 コ ル ベ ン に 入 れ, 置:. にDOPAを. ー ル ドル. リフル オ ロア セ チ ル化. は,充 分 除 湿 の で きた 部 屋 で 行 った.ま た カ テ コー ル ア ミン類 を含 む液 が 接 す るす べ て の ガ ラス 器具 類. 第1節. 保持時間 の決定. カ テ コー ル ア ミン お よ び そ の類 縁 の標 準 物 質 にお 表2. Retention. time. of. catecholamines.
(4) 454. 岸. け る 保 持 時 間 の 決 定 の 結 果 を 表2に ()内. にepinephrineを1.00と. (relative. retention. dopamineに. 実. の. 示 し た.図1に. を 示 し た.注. 内 に 見 ら れ る ピ ー ク は,ト. 第2節. 示 し た.表. 秀. して 相 対 保 持 時 間. time)を. つ い て の1例. に 用 い たtrifluo. 川. roacetic. 入 後2分. 以. リフ ル オ ロ アセ チ ル 化 acidで. あ る.. 内 標 準 物 質 の 決定. ECDに. よ る 検 出 に 感 受 性 を もつ ハ ロゲ ン化 合 物 の. 中 か ら高 純 度 の 農 薬 を 選 び 検 討 し た.有 るn‑hexaneに. 機 溶媒 で あ. 可 溶 で 融 点 を 考 慮 し てdrin剤. るaldrinお. よ びdieldrin,. (BHC)の. α,δ異 性 体,. dichloroethane. benzene. p, p'‑dichlorodiphenyl‑. (DDE)お. ideをn‑hexaneに. であ. hexachloride. よ びheptachlor. epox. 溶 解 し 保 持 時 間 を し ら べ た.そ. の 結 果 を 図2に. 示 し た.そ. の 結 果,分. 析 対 象 の諸 カ. テ コ ー ル ア ミ ン と オ ー バ ー ラ ッ プ す る こ とな く,か つ こ れ ら と 最 も近 く に ピ ー ク を 示 すheptachlor xide(表1の. 同 条 件 で 保 持 時 間 は13.6分)が. 当 で あ る こ と が わ か っ た.そ. の 他,保. epo 最 も適. 持時 間はや ゝ. 長 い が,カ. テ コー ル ア ミン 類 の 分 析 の 妨 げ に な ら な い. dieldrinも. 内 標 準 物 質 と して 使 用可 能 で あ る こ とが. わ か っ た.. 第3節. 生 体 試 料 に お け る カテ コー ル ア ミン類 の. 分析 1). 脳 組 織 中 の カ テ コー ル ア ミン. 図1. Peak tention. of. dopamine. time. minutes.. The. chromatography table. 図2. Gas. chromatography. for. several. internal. standard. substances.. 1 .. of. Absolute. re. dopamine conditions are. is of shown. 7 .0 gas in.
(5) カ テ コ ー ル ア ミン代 謝 に関 す る基 礎 的 な ら びに 臨床 的 研 究. ラ ッ トお よ び ネ コ の 脳 組 織 の 分 析 を 行 っ た.図3 は ラ ッ トの 全 脳(whole で あ る が, dopamineお. brain)に. epoxideで1ng相. つ いて の 分 析 例. よ びnorepinephrineの. か な ピ ー ク が 見 ら れ る.内. 明 ら. 標 準 物 質 はheptachlor. 出 き れ た.図4に. ネ コ のcaudate. Chromatography of. 表3. rat. brain. Catecholamines. for. nucleusに. 検 おける. catecholamines. で あ る.ラ. た.ラ. brain. (Rat,. Cat). 示 し. ッ トの 全 脳 に お け る と 同 様 に ネ コ のcortexに. dopamine値. 検 出 さ れ た.ネ とnorepinephrine値. Chromatography caudate. the. norepinephrineの 高 い ピー クが特 徴 的. ッ トの 全 脳 お よ び ネ コ の 脳 組 織 の 各 部 位. もepinephrineが. 図4. tissues.. in. を 示 し た.. ピ ー ク に 比 較 してdopamineの. に お け る カ テ コ ー ル ア ミン の 測 定 結 果 を表3に. 当 量 で あ る.な お ラ ッ トの 脳 組 織 内. に は 小 ピ ー ク な が らepinephrine(数ng/g)も. 図3. ク ロマ トグ ラ フの1例. 455. for nucleus.. コ の全 脳 に お け る には有 意 の差 を. catecholamines. of. cat.
(6) 456. 岸. 認 め な か っ た.各 pallidum,. で は,他. nucleusで. はcortexに. 明 ら か に 高 値 を 呈 し た.な の 部 位 と 異 っ て,. dopamineよ. 秀. 比 較 し. 75〜83%,. おcortex. norepinephrineの. 2). り高 値 を 呈 し た.. Chromatography. for. 血 清 中 の カ テ コー ル ア ミン. 動 物 お よ び ヒ トに つ い て 測 定 し た.ネ. catecholamines. of. cat. 図6. Chromatography human. Catecholamines. *Age‑‑‑‑‑‑male:. in. つ いて は. つ い て は70〜79%で. serum. 24‑60years. (Rat,. Cat. and. old. (average. female:. 19‑50. years. old. (〃30.9). total:. 19‑60. years. old. (〃32.5). コお よ び ヒ. ト に つ い て の 測 定 に お け る ク ロ マ ト グ ラ フ の1例. serum.. 表4. narepinephrineに. あ っ た.. 方 が. 脳 組 織 中 の ガ ス クロ マ トグ ラ フ ィー に よ る カ テ コ. 図5. 実. ー ル ア ミン 定 量 の 回 収 率 は , dopamineに. 部 位 別 の 測 定 に よ る とputamen,. caudate. dopamineは. 川. Human). 33.8). serum.. for. catecholamines. を. of.
(7) カ テ コー ル ア ミン代 謝 に関 す る基 礎 的 な らび に臨 床 的 研 究. 図5お. よ び6に. 示 し た.ネ. タ ー ン を 示 す が,血. コ も ヒ トもほ ぼ 同様 な パ. 清 は脳 組 織 と異 って単 位 当 りの. 含 有 量 が 微 量 の た め,ガ. ス ク ロマ トグ ラフ の検 出器. の 感 度 を 上 げ て 測 定 す る必 要 が あ っ た .ラ コ お よ び ヒ トにつ い て の 測 定 結 果 を 表4に ラ ッ トお よ び ネ コ に お い て は, よ びepinephrineは. ッ ト,ネ 示 した .. 正 常 人 に お け る尿 中 カ テ コ ー ル ア ミ ン 測 定 の ク ロ マ トグ ラ フ の1例. の 順 で あ る こ と が わ か っ た.な. 4). norepinephrineお. は 男 女 差 は 認 め られ な か っ た .. た,ヒ. お よ びepinephrineは,他. ト血 清 中 のnorepinephrine. よ び表5に 示 した. 髄 液 中 に微 量 のDOPAが. よ び70〜78%で. あった. め,腰 椎 穿刺 時 の ル ンバ ー ル 針 の刺 入 に よ る痛 み も. , norepinephrine. 回 収 率 は,各. 々68〜75%. , 65. 完 全 に は除 か れ て い な い.腰 椎 穿 刺 時 に 出 血 した症 例 は除 外 した.. .. 髄 液 中 カ テ コ ー ル ア ミン測 定 に お け る回 収 率 は,. 尿 中 の カ テ コ ー ル ア ミン. Chromatography human. 検 出 され た.た だ 虫 垂 炎. に よ る腹痛 お よ び骨 折 に よ る痛 み は,少 な か らず 認. お よ びepinephrineの. 図7. 髄 液 中 の カ テ コ ール ア ミン. 髄 液 中 カ テ コ ール ア ミン測 定 の ク ロ マ トグ ラ フ の. の動 物 に 比較 して や ゝ低. ヒ ト血 清 中 に お け るdopamine. 3). お 尿 中 にoctopamine. 分 析 結 果 の1例 お よ び定 量値 の結 果 に つ い て 図8お. 値 を 示 し た.. 〜75%お. epinephrine. で あ っ た.. 物 の 場 合 と 同 様 に ヒ ト血 清 中 に もdopamine. を 検 出 し た.ま. な わ ち そ れ ら.. を 検 出 し た.. は ネ コ の方 が有 意 に高 値 を 呈 した.. 他 方,動. 示 し た .す. norepinephrine,. 尿 中 の カ テ コ ー ル ア ミ ン 測 定 の 回 収 率 は80〜87%. ほ ぼ 同 様 な 値 を 示 し, dopamine. よ びepinephrineに. を 図7に. の 含 有 量 はdopamine,. norepinephrineお. ヒ ト血 清 に つ い てdopamine,. 457. urine.. for. catecholamines. of. 図8. Chromatography human. cerebrospinal. for. catecholamines fluid. .. of.
(8) 458. 表5. 岸. Catecholamines. Control extremity.. DOPA,. group Sex:. dopamineお. 各 々80〜85%,. in. human. 川. cerebrospinal. 秀. 実. fluid.. is the 38 patients with appendicitis and 2 patients with male 23, female 17. Age: 10‑55 yrs (average 33). よ びnorepinephrineに. 65〜75%お. 第4章. つ い て. よ び68〜75%で. 考. あ っ た.. て お く と約50%が. fracture. of lower. 消失 す る.ま た,試 料 を過 塩 素 酸. で 除 蛋 白 後, 4℃ 以 下 で脱 脂,ア. ル ミナ 吸着 お よ び. 溶 出 を連 続 的 に行 えば,温 度 に よ る分 解 は ほ とん ど 察. 考 慮 しな くて もよ い.試 料 を 採集 後 直 ち に処 理 しな. カ テ コ ー ル ア ミン類 の 測定 技術 の進 歩 に よ り生 体 ア ミンに関 す る基 礎 的 お よび 臨床 的研 究 が盛 ん に な って きた.現 在 カ テ コ ール ア ミン類 の測 定 は,通 常. い で保 存 して お く場 合 は,長,短. 期 間 にか ゝわ らず. 液 体 窒 素 中 に 保存 す る こ とが好 ま しい. 測定 操 作上 の 注意 事項 と して,ガ ラ ス器 具 な どは. 蛍 光 法 に よ り行 わ れて い る.組 織 お よ び尿 中 の単 位. 特 に汚 染 の な い もの を用 い る こと は,言. 当 りの カ テ コ ー ル ア ミン含 有 量 は,血 清 お よ び髄 液. いが,カ テ コー ル ア ミンが ガ ラス面 に接 す る と カ テ. 中 の含 有 量 に比 較 して 多 量 で あ るた め,そ の測 定 は. コ ール 核 の水 酸 基 が ガ ラ ス含 有 成 分 と反 応 す る恐 れ. 蛍 光 法 で も差 しつ か え な いが,組 織 に お け る代 謝 的. が あ るの で,分 析 に使 用 す る 器具 はす べ て シ リコ ン. 研 究 に際 して は,同 時 に多 成 分 系 が 系 統 的 に分 離 で. 処 理 した もの を用 い た.. きる ガ ス クロ マ トグ ラ フ ィー 法 が 好 ま しい.ま た,. うま で もな. 次 に 分析 に用 い る試 薬 につ いては, ECDの. 検 出感. 血清 お よ び髄 液 中 の カ テ コー ル ア ミン含 有 量 は微 量. 度 が高 い た め 試 薬 の不 純 物 は,ガ ス ク ロ マ トグ ラ ム. で あ るた め,そ の 測 定 は蛍 光 法 で は実 際 に は非 常 に. 上 異常 ピー ク と して 出現 し,正 常 パ タ ー ン を乱 す た. 困難 で あ る.特 に臨 床 的 検 索 を行 う場 合,多 量 の血. め 特 に 純度 の高 い もの が用 い られ ね ば な らな い.従. 液 お よ び髄 液 の 採 集 は好 ま し くな い の で,ガ ス ク ロ. って,溶 出 に用 い る酢 酸, TFA化. マ トグ ラ フ ィー に よ る方 法 が 推 奨 され る.. エ チ ル,無 水 トリフ ル オ ロ酢 酸 は,い ず れ もガ ス ク. ガ ス ク ロマ トグ ラ フ ィーの 検 出 器 に は電 子 捕獲 検. 過 程 にお け る酢 酸. ロ マ トグ ラ フ ィー用 の高 純 度 の もの を用 い た.ま た. 放. 無 水 ト リフル オ ロ酢 酸 は,ア シル 化 が 完 全 に行 わ れ. 射 性 ニ ッケ ル を使 用 して い るが,こ れ の β線 源 を封. るた め に巌密 な無 水 状態 が 必 要 で あ るの で デ シ ケ ー. じ込 ん だ セ ル 内 に電 極 を置 い て 高 純度 の窒 素 ガ ス を. ター 中 に保 存 す る こ とが必 要 で あ った.. キ ャ リヤ ー ガ ス と して 流 して お くと,こ こに電 子 を 捕捉 して陰 イ オ ン にな りや す い 物 質 の 蒸気 が 流 入す. 除蛋 白 の過 程 で,河 合 ら26)は,血 清 で 塩 酸 アル コ ール ,組 織(副 腎髄 質)で トリク ロル 酢 酸 を用 い た. る と,電 離 電 流 が減 少 す るの で,こ の 変化 を増 巾記. が,著 者 は両 試料 と もに過 塩 素 酸 を用 いた.特 に 回. 録 す る もの で あ る.こ のECDは,有. 収 率 の点 で は,血 清 の 場 合過 塩 素 酸 の方 が好 ま しか っ. 出 器(ECD)を. 用 い た.著 者 の使 用 したECDは. 機,無 機 のハ. ロゲ ン化 合 物 に対 して 極 めて高 感度 で あ り,そ れ ら. た .脱 脂 の 過 程 で は, ether‑benzeneの. をng以 下 の量 で検 出,定 量 す る こ どが で き る25).従 っ. chloroformも. て生 体 微 量 成 分 を ハ ロ ゲ ン化 合 物 に 誘 導 してECD. 場 合 は,カ テ コー ル ア ミンの ア ル ミナへ の 吸 着 が 不. に よ り検 出す る わ けで あ る.. 充 分 で 回収 率低 下 の原 因 と な る.. 他 にether‑. 使 用 で きた.脱 脂 が 充 分 で きて な い. に注意 す る事項 と して まず. カテ コー ル ア ミンの アル ミナへの吸 着 過 程 は, Imai. 温 度 条 件 が重 要 で あ る.す な わ ち,試 料 を採 集 して. ら16)の操 作 とほ ぼ 同様 で あ る.カ テ コ ー ル ア ミンは,. か らTFA化. アル ミナ へ 吸着 され る と比 較 的 安 定 で あ るが,長 時. 試 料 の処 理 操 作 上,特. まで 常 に分 析 試 料 が2℃ 以 上 に 上昇 し. な い よ うに 注意 す る必 要 が あ る.そ の た め,常時1〜. 間 アル カ リ性 に して放 置 す る の は好 ま し くないので,. 2℃ の コ ー ル ドル ー ムで 実 験 を行 った.著 者 の経 験. アル ミナは直 ちに カ ラム に つめ て 次 の 溶 出 操 作 に 移. で は,カ テ コ ー ル ア ミ ン の う ち で も特 にdopamine. るべ きであ る.溶 出操 作に使 用す る溶出液(酸)の. は,不 安 定 で あ り試 料 を採 集後25℃ に30分 間 放 置 し. は,回. 種類. 収 率 に は ほ とん ど影 響 を 及 ぼ さ な い と い.
(9) カ テ コ ール ア ミン代 謝 に関 す る基 礎 的 な らび に臨 床 的 研 究. う報 告27)も あ る が,著 者 の 経 験 で はdopamine, epinephrineお. ー 法 に よ る測 定 値 も諸 氏30)31)の 報 告 と ほ ぼ 一 致 し た. nor. よ びepinephrineは0.2N酢. DOPAは0.25N酢. 459. 酸 で,. 値 が え ら れ た.. 酸 で 溶 出 した 場 合 に回 収 率が優 れ. て い た.. 次 に 脳 組 織 中 の カ テ コ ー ル ア ミ ン に 関 し て は,ラ ッ トの 全 脳 お よ び ネ コ のcortex中. 河 合 ら26)は,溶. 出液 の 乾燥 に 際 して 溶 出 液 をナ シ. 型 コ ル ベ ン に と り,ロ. ー タ リエ バ ポ レ ー タ ー を 用 い. 50℃ 以 下 の 水 浴 中 で 蒸 発 乾 固 し て お り,こ でTFA化. を 行 っ て い る が,著. 入 し た.こ. の 方 法 で は,溶. 却 し た 後,減. れについ. 者 は 凍 結 乾 燥 法 を導. 出 液 全 部 を‑50℃. まで 冷. 圧 乾 固 せ し め るの で 熱 に よ る分 解 を防. ぎ 充 分 乾 固 き せ る こ と が で き る.ま. た,か. の 試 料 を 一 度 に 濃 縮 し う る の で,血. 清 お よ び髄 液 な. な り大 量. ど の 定 量 も安 全 か つ 正 確 に 行 え る よ う に な っ た. 次 にTFA化. の 問 題 で あ る が,こ. よ り数ng/gの. epinephrineが. 検 出 さ れ た.従. epinephrineの. 存 在 は 多 く は 否 定 的 で あ っ た が,最 近. 来 中 枢 神 経 系 に は. で は 脳 内 に もphenylethanolamine‑N‑methyltra nsferaseが. 存 在 す る と い う報 告32)も あ り,今 回 の 著. 者 の 結 果 は,中. 枢 神 経 系 に お け るepinephrineの. 在 を 証 明 し て い る.蛍. 存. 光 法 に よ る測 定 値 と の 比 較 で. は ラ ッ トのnorepinephrine値. は 諸 氏33)34)35)の 測 定. 結 果 よ り や ゝ低 い よ う で あ る が,こ. れ は ラ ッ トの 発. 育 過 程 お よ び 断 頭 し て か ら試 料 処 理 ま で の 操 作 の 違. の 反 応 は技 術 的. い に よ る も の か も知 れ な い.ネ. コの全 脳 お よ び 脳 各. 操 作 お よ び 種 々 の 条 件 に よ り非 常 に 影 響 さ れ や す い. 部 位 に お け る カ テ コ ー ル ア ミ ン の 蛍 光 法 に よ る測 定. の で,特 に 実 験 者 は 種 々 の 条 件 が 常 に 一 定 す る よ う に. 値 は,報. 配 慮 し な け れ ば な らな い.ま た 無 水 ト リ フ ル オ ロ 酢 酸. 法 で は 約20mgあ. 以 外 にpentafluoropropionic anhydride 28)を用 い て ア シ ル 化 す る方 法 も試 み た が. 体 で 脳 諸 部 位 の 測 定 が 可 能 で あ り,従. TFA化. (PFPA) ,回. 収率 は. の 場 合 と ほ ぼ 同 様 で あ る.. さ て,カ. 告 者32)に よ っ て も か な り の 差 が あ る が,本 れ ば 充 分 測 定 可 能 で あ る の で1個. よ り数 個 体 を1試. って蛍 光 法 に. 料 とす る 場 合 と比 較 す る と信 頼 度. は 高 い と考 え る.. テ コ ー ル ア ミン 標 準 試 料 に つ い て の 分 析. Papavasiliouら23)はL‑DOPAお. 結 果 は,河 合 ら26)の 報 告 と ほ ぼ 一 致 し た 結 果 を 得 た.. hydrazinomethyldopa. 本 実 験 に お け る標 準試 料 お よ び生 体 試 料 の 分 析 に際. 中 のDOPAお. よ びL‑alpha. (MK486)を. 投 与 す る と髄 液. よ びdopamineが. 上 昇 す る こ と を蛍 光. し,ガ ス ク ロマ トグ ラ フ に 試 料 注 入 直 後 にtrifluoro‑. 法 で 測 定 し た が,著. acetic. 類 全 般 に わ た っ て ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー(ECD). acidの. ピ ー ク を 認 め た が,多 量 のn‑hexane. で 希 釈 し た 場 合 に は,こ. の ピ ー ク は 認 め ら れ な い.. で 定 量 分 析 し た.中. 生 体 試 料 に つ い て の 分 析 で は 前 述 の ご と く種 々 の 知 見 が み ら れ た が,ま. ず ヒ ト血 清 中 に ラ ッ トお よ び. ネ コ と 同 様 にdopamineが べ き で あ る .現. 検. 出 さ れ た こ と は 興 味 深 い.. 検 出 され た こ とは 注 目す. 脳 に お け る 最 も有 力 な 神 経 伝 達 物 質 候 補 で あ る カ テ コー ル ア ミン類 を髄 液 中 レベ ル で測 定 可 能 に な っ た こ と は,今. の 報 告 は な い.す で にImai. ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィー 法 に よ っ て 正 常 人. 血 清 中 に 数ng/mlのdopamineが て い る.こ. 枢神 経 系疾 患 お よ び 精神 科 領域. の 疾 患 の な い ヒ トの 髄 液 中 に 微 量 な が らDOPAが. 在 ま で 蛍 光 法 に よ る測 定 で 正 常 人 血. 清 中 の 正 確 なdopamine値 ら29)は,ガ. 者 は髄 液 中 の カ テ コ ー ル ア ミン. 存 在 す る と報 告 し. 後 の 種 々 の 中 枢神 経 系 に 関係 す る疾 患. の 病 因 お よ び 病 態 を生 化 学 的 に 研 究 す る 上 で 役 立 つ で あ ろ う.. の こ と は ガ ス ク ロ マ トグ ラ フ イー 法 は, 第5章. 結. 語. 蛍 光 法 と異 り多 成 分系 の 物質 をほ ぼ 同一 時 間 に測 定 で き る た め で あ ろ う.ガ. ス ク ロマ トグ ラフ ィー法 に. よ る ヒ ト血 清 中 のnorepinephrineお hrine値 定 値30)よ. は,す. よ びepinep. 血 清 中 のnorepinephrineお. た,ヒ. ト. よ びepinephrineは,. ラ ッ トお よ び ネ コ の 血 清 中 の そ れ ら よ り低 値 を 示 し た.. 法 で 行 っ た.分 は2.5ml,髄. 清,尿. お よ び髄 液 中 の カ テ コ ー ル ア. あ る の み な ら ず 単 位 当 りの 含 有 量 が 多 い た め 蛍 光 法 ス ク ロマ トグ ラフ ィ. 析 に 要 す る 試 料 は 組 織 は20mg,血. 液 は3.0mlで. あ り,い. ず れ もng以. 清 下 の. 単 位 ま で 測 定 可 能 で あ っ た. 2) rineの. 尿 中 の カテ コー ル ア ミン類 の 測定 は 試料 が豊 富 で. で も充 分 測 定 可 能 で あ る が,ガ. 組 織,血. ミ ン の 定 量 分 析 を ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー(ECD). で に 報 告 さ れ て い る蛍 光 法 に よ る測. り若 干 高 値 を 示 す 傾 向 に あ る.ま. 1). dopamine, 他 にDOPA,. nephrine,. norepinephrineお tyramine,. よ びepineph. octopamine,. normetanephrine,. synephrineな. meta ど も. 同 時 に 系 統 的 に 定 量 分 析 で き た. 3). 従 来 の 蛍 光 法 に よ る定 量 法 と ガ ス ク ロ マ ト グ.
(10) 460. 岸. 川. 秀. 稿 を終わ るに臨 み,御 指導,御 校 閲 を賜わ った岡. ラ フ ィ ー 法 に よ る分 析 と の 比 較 検 討 を 行 っ た. 4). 山大学 医学 部脳代謝研究施設病態生化学 部門高坂睦. 正 常 人 お よ び動 物 の 血 清 中 よ りdopamineを. 年教 授,同 機能生 化学部門森昭 胤教授,な らびに御. 検 出 し た. 5). 実. 校閲 を賜 った岡山大学医学部脳神経外 科教 室西本詮. ラ ッ トお よ び ネ コ の 脳 組 織 よ りepinephrine. を 検 出 し,中. 枢 神 経 系 に お け るepinephrineの. 教 授に深 く感謝の意 を表 します.ま た,本 研究に多 大の暖かい御援助 を頂い た岡 山大学 医学部脳代 謝研. 存在. を 確 認 し た.. 究施設 の教 室の皆様 に深 く感謝 の意 を表 します.. 文 1) Lawen, A.:. Quantitative. path. Parmacol., 2) Trendelenburg, der Wirkung ethode. 3) 4) 5). Untersuchungen. einer. einmaligen. exper.. intravenosen. path. Parmakol.,. Gaddum, J. H. and Lembeck, 4: 401-408,. Assay organs. Vane,. J. R.: The use of isolated Brit.. Euler,. U. S. and Hamberg,. J. Pharmacol.,. Science,. im normalen. Adrenalininjektion. 60: 161-176,. F.:. von Suprarenin.. physiologischer. Massm. medulla.. J. Pha. 1910.. of substances. from adrenal. for detecting. 23: 360-373,. Brit.. active. substances. in the. circulating. 1964.. U.: Colorimetric. estimation. of noradrenaline. in presence. of adr. 110: 561, 1949.. Folin, O. and Denis, W.: New methods for the determination of total urea and ammonia in blood. J. Biol. Chem., 11: 527-536, 1912.. 7). Shaw,. F. H.:. 8). Bloor,. W. R. and Bullen,. 9). exper.. Blut sowie beim Abklingen. mittels. 6). 727-739,. Arch.. 1949.. blood. enalin.. uber die Gefasswirkung. 51: 415-441, 1904. P.: Bestimmung des adrenalingehalte. Arch.. rmacol.,. 献. Estimation. of adrenaline. S. S.:. Biochem.. Determination. J.,. 32: 19-25,. of adrenaline. new protein. nitrogen,. 1938.. in blood.. J. Biol.. Chem., 138:. 1941.. Udenfriend, S., Cooper, J. R., Clark, C. T. and Baer, in adrenal medulla. Science, 177: 663-665, 1953.. 10) O'Hanlon,. J. F., Jr., Campuzano,. ogram concentrations. H. C. and Harvath,. of adrenaline. and noradrenaline. J. E.: Rate of turnover S. M.: A fluorometric in plasma.. Anal.. of epinephrine. assay. for subnan. Biochem.,. 34: 568-. 581, 1970. 11) Valori,. C.,. Brunori,. of epinephrine. hem., 33: 158-167, 12) Natelson,. S.,. of epinephrine.. 14) Kawai,. Arch.. L.: Improved. procedure. by the trihydroxyindole. J. B.: New fluorometric. Biochem., 23: 157-158, A. D.: Chemical. J., 51: 311-318,. S. and Tamura,. Chem. Pharm.. J. K. and Pincus,. H. and Bone,. Biochem.. V. and Corea,. fluorophors. reaction.. for. formation. Anal.. Bioc. 1970.. Lugovoy,. 13) Weil-Malherbe, blood.. C. A., Renzini,. and norepinephrine. Z.:. for. determination. 1949. estimation. of adrenaline-like. substances. in. 1952.. Gas chromatography. Bull., 16: 699-701,. method. of catecholamines. as their trifluoroacetates.. 1968.. 15) Bertani, L. M., Dziedzic, S. W., Clarke, D. D. and Gitlow, S. E.: A Gas-Liquid chromatog raphic method for the separation and quantation of normetanephrine and metanephrine in urine. Clin.. Chim.. Acta,. 30: 227-233,. 1970..
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(12) 462. 岸. Experimental 1.. and clinical. 秀. 実. studies on the catecholamine. Studies on the determination urine and cerebrospinal. 川. of catecholamines. metabolism. in tissues,. fluid by gas chromatography. serum,. (ECD).. by Hidemi KISHIKAWA Institute for Neurobiology, OkayamaUniversity Medical School. (Director: Prof. Mutsutoshi Kohsaka) Catecholamine in tissue, serum and urine has been determined by the fluorometric method. It still remains some problems, especially sensitivity in the measurement and purification of catecholamines. according. to this method. Therefore,. I determined. by a gas chromatographic. method. (using an Electron Capture Detector: ECD) modified from the method of Imai (1971). Catechol amines in cerebrospinal fluid (CSF) have not been determined by gas chromatographic method so far.. A new technique. for the determination. of catecholamine. in CSF of human will be prese. nted in this paper. The results. are as follows,. 1) According to the gas chromatography, 20 mg of tissue, CSF are enough to determine with the grade of one nanogram.. 2.5ml. of serum. and 3.0ml. of. 2) Dopamine, norepinephrine, epinephrine, 3, 4-dihydroxyphenylalanine (DOPA), tyramine, octopamine, metanephrine, normetanephrine and synephrine were determined. Retention time of gas chromatography for these substances was decided. ilable to the internal standard substances.. Heptachlor. 3) Dopamine was determined mals (rat and cat).. human subjects. 4) the central 5) contribute system.. Epinephrine nervous. in serum of normal. was detected. in brain tissue. system contains. Micro-quantitative. analysis. to the neurochemical. of rats and cats.. enough epinephrine of catecholamine. researches. epoxide or dieldrin. were ava. and in experimental. This evidence. ani. will show that. to evaluate. and its derivatives. and to the clinical. works. in various. samples. in the central. will. nervous.
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